DE2900537C2

DE2900537C2 -

Info

Publication number: DE2900537C2
Application number: DE2900537A
Authority: DE
Inventors: Geb. Solovjeva Valeria Vasiljevna Kastron; Rasma Oskarovna Riga Su Vitolin; Jury Arkadjevic Fialkov; Svetlana Vladimirovna Kiew/Kiev Su Scheljaschenko; Gunar Janovic Dubur; Agris Adolfovic Riga Su Kimenis
Original assignee: INSTITUT ORGANICESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIJSKOJ SSR RIGA SU; INSTITUT ORGANICESKOJ CHIMII AKADEMII NAUK UKRAINSKOJ SSR KIEW/KIEV SU
Current assignee: INSTITUT ORGANICESKOGO SINTEZA AKADEMII NAUK LATVIJSKOJ SSR RIGA SU; INSTITUT ORGANICESKOJ CHIMII AKADEMII NAUK UKRAINSKOJ SSR KIEW/KIEV SU
Priority date: 1978-01-11
Filing date: 1979-01-08
Publication date: 1988-09-29
Also published as: FR2414501A1; DE2900537A1; FR2414501B1; CA1117124A; GB2013186B; JPS54122280A; GB2013186A; SU706410A1; JPS6016933B2; US4219653A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den 2,6-Dimethyl- 4-(2-difluormethoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarbon säuredimethylester. Dieses 1,4-Dihydropyridinderivat besitzt eine hypotensive Wirksamkeit und kann deswegen in der Medi zin Verwendung finden.

Es ist eine große Zahl von 1,4-Dihydropyridinderivaten be kannt, die eine hypotensive Wirksamkeit aufweisen. Jedoch besitzen sie eine relativ hohe Toxizität (B. Loev, M. M. Goodman, K. M. Snader, R. Tedeschi., E. Macko, J. Med. Chem., 1974, 17, 956; B. Loev, S. Erreich, R. Tedeschi, J. Pharm. Pharmac. 1972, 24, 917).

So beträgt beispielsweise die hypotensive Wirksamkeit der bekannten Substanz 2,6-Dimethyl-4-(2-trifluormethyl-phenyl)- 1,4-dihydropyridin-3,5-dicarbonsäurediäthylester (in der Folge mit (A) bezeichnet) ED₃₀=0,022 mg/kg. Dabei beträgt dessen Toxizität LD₅₀=38,5 mg/kg. Im Zusammenhang damit ist die Suche nach neuen Verbindungen in der 1,4-Dihydropyridin reihe sinnvoll, die eine geringere Toxizität aufweisen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Entwicklung solch einer Verbindung, die eine hohe hypotensive Wirksamkeit bei einer geringen Toxizität besitzt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die neue Verbindung 2,6-Dimethyl-4-(2- difluormethoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarbonsäure dimethylester gelöst.

Die erfindungsgemäße Verbindung der oben angeführten Formel kann durch die Kondensation von Acetessigsäuremethylester, 2-Difluormethoxy-benzaldehyd und Ammoniak unter Kochen in einem inerten organischen Lösungsmittel erhalten werden. Das Produkt stellt eine farblose kristalline Substanz dar, die in organischen Lösungsmitteln löslich und wasserunlös lich ist.

Nachstehend wird ein Beispiel zur Herstellung von 2,6-Dime thyl-4-(2-difluormethoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-di carbonsäuredimethylester angeführt.

2,40 g (0,0139 Mol) 2-Difluormethoxy-benzaldehyd, 3,23 g (0,0278 Mol) Acetessigsäuremethylester, 5 ml wäßrige Ammo niaklösung und 10 ml Methanol werden während 3 Stunden ge kocht. Nach der Abkühlung und Zugabe von 40 ml Hexan fällt ein hellgelber Niederschlag von 2,6-Dimethyl-4-(2-difluor methoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarbonsäuredime thylester aus. Nach der Kristallisation aus Methanol erhält man 2,03 g (40%) farblose Substanz vom Schmp. 153-154°C, UV-Spektrum λ _max, nm (log ε): 205 (4,36); 243 (4,26), 366 (3,82), IR-Spektrum, cm^-1: 1619, 1642, 1682, 3340.

1H-NMR-Spektrum, δ ppm (in CDCl₃): 2,22 (6H, Singulett, 2,6-CH₃); 3,52 (6H, Singulett, OCH₃); 5,19 (1H, Singulett, 4-H); 5,75 (1H, Singulett, NH); 6,40 (1H, Multiplett, OCHF₂); 7,02 (4H, Multiplett, arom.).

Elementaranalyse:

Berechnet in %:C 58,8; H 5,2; N 3,8 Gefunden in %:C 59,0; H 5,2; N 3,7

Summenformel: C₁₈H₁₉F₂NO₅

Die Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz 2,6-Dimethyl-4-(2-difluormethoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dica-rbon säuredimethylester auf den arteriellen System blutdruck wurde an narkotisierten Katzen, Ratten und Hunden unternommen.

Aus der deutlichen hypotensiven Wirksamkeit sowohl bei der intravenösen als auch bei der peroralen Einführung sowie der relativ niedrigen Toxizität der erfindungsgemäßen Substanz kann man schließen, daß sie in der medizinischen Pra xis zur Behandlung der essentiellen Hypertonie Anwendung finden wird.

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Verbindung bei der intravenösen Einführung in Form von 50%iger wäßriger Dimethylacetamidlösung einen deutlichen hypotensiven Effekt hervorruft. Die perorale Einführung der Verbindung in Form von wäßriger Suspension mit Polyoxy-äthylensorbit monooleat setzt den arteriellen Blutdruck bei Ratten mit künstlicher Hypertonie bedeutend herab. Der hypotensiven Wirksamkeit nach unterscheidet sich die genannte Verbindung von der bekannten Substanz (A) praktisch nicht.

Der hypotensive Effekt der erfindungsgemäßen Verbindung in Versuchen an narkotisierten Ratten und bei intravenöser Ver abreichung ist ED₃₀=0,033 mg/kg, bei Versuchen an narkotisierten Hunden, ebenfalls intravenös, ist ED₃₀=0,028 mg/kg (ED₃₀ ist die Dosis des Mittels, die den arte riellen Systemblutdruck um 30% senkt).

In den Dosen, die den arteriellen Blutdruck herabsetzen, hemmt die erfindungsgemäße Substanz die Äußerung der hämo dynamischen Effekte von biogenen Aminen (Adrenalin, Isa drin und Acetylcholin).

In den Versuchen an Ratten wurde gezeigt, daß die gegebene Verbindung den gleichen Antagonismus zu Noradrenalin wie die Verbindung (A) aufweist, der Antagonismus zu Angiotensin ist jedoch erheblich deutlicher ausgeprägt. Die Angaben in Bezug auf den Antagonismus der erfindungsgemäßen Substanz sind in Tabelle 1 angeführt.

Tabelle 1

Hinsichtlich der Verbindung 4-(3′-Nitrophenyl)-2,6-dimethyl-3,5-dicarbäthoxy- 1,4-dihydropyridin (B) ist in der DE-AS 16 70 827 folgendes gesagt:
Bei einer Dosis von 0,125 mg/kg intravenös wurde in Versuchen an Ratten eine leichte Senkung des Blutdrucks bei einer In jektion beobachtet, und in Versuchen an Hunden, ebenfalls intravenös, wurde bei einer Dosis von 0,02 mg/kg dieselbe leichte Senkung des Blutdrucks beobachtet.

Es wurde die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung auf den systolischen Blutdruck an spontan hypertensiven Ratten des Okamoto-Aoki-Stammes (Okamoto K., Aoki K., Jap. Circ. J., 1963, (27), 282) untersucht. Dazu wurden Ratten der Alters gruppe 6 bis 7 Monate (Körpergewicht 185-210 g) genommen. Der systolische Blutdruck wurde mit dem Pletismographen ge messen (Birmingham M. K., Science, 1973, (182), 1249), an welchem ein pneumatischer Puls-Transducer angeschlossen wurde (Narco Bio-System). Die Blutdruckregistrierung erfolgte auf einem Physiographen (Narco Bio-System). Vor der Blutdruck messung wurden die Ratten in einer warmen (+45°C) Kammer 5 min lang gehalten. Der systolische Blutdruck wurde vor der Verabreichung des Präparats sowie nach 0,5, 1, 3, 6 und 24 Stunden seit dem Zeitpunkt der Verabreichung registriert. Das erfindungsgemäße Produkt wurde in Dosen von 1,3 und 10 mg/kg verabreicht. Jede Dosis wurde an 6-7 Ratten unter sucht. Das Präparat wurde durch die Sonde in den Magen in Form einer Wassersuspension (5 ml/kg) auf der Basis von Polyoxy-äthylen-sorbit-monooleat eingeführt. Eine Kontrollgruppe von Ratten erhielt eine entsprechende Menge isotonischer NaCl-Lösung.

Bei spontan hypotensiven Ratten (SHR) war die hypotensive Wirkung der Verbindung (B) geringer (Verminderung des Systo lendrucks um 20% gegenüber 24% bei der erfindungsgemäßen Verbindung). 24 Stunden nach der Verabreichung der Verbin dung (B) überstieg der Systolendruck den Ausgangsdruck um 3,5%, während bei der erfindungsgemäßen Verbindung der Aus gangsdruck noch nicht vollständig erreicht worden war.

Die effektive Dosis der erfindungsgemäßen Substanz, bei wel cher der arterielle Blutdruck um 30% herabgesetzt wird, be trägt 0,024 mg/kg, was die Wirksamkeit von Papaverin um das 10fache übersteigt und der Wirksamkeit der bekannten Sub stanz (A) nicht nachsteht (ED₃₀=0,022 mg/kg). Ein wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindung besteht darin, daß sie um das 10fache weniger toxisch ist, als die bekannte Substanz (A), und daß deren Antagonismus in bezug auf Angio tensin um das 2- bis 3fache höher ist.

Die erfindungsgemäße Verbindung übertrifft als Calcium-Anta gonist in ihrer Wirksamkeit das bekannte Handelsprodukt Nifedipin-Dimethyl-2,6-dimethyl- 4-(2′-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat-(Mura kami, S. 8), im folgenden die Verbindung (C), wie in ver schiedenen Versuchen am Froschherzen und am Kaninchenpapillar muskel festgestellt wurde, um das 3- bis 5fache.

Die erfindungsgemäße Verbindung weist eine viel höhere Licht stabilität auf. Beide Verbindungen wurden 24 Stunden mit 150 kLux unter einem polychromatischen Licht einer Wellen länge von 300 bis 800 nm beobachtet. Die totale Zersetzung von (C) erfolgte nach 30 Minuten, während die Zersetzung der erfindungsgemäßen Verbindung 1000mal langsamer erfolgte.

Bei der Untersuchung der akuten Toxizität in den Versuchen an weißen Mäusen bei der intraperitonealen Einführung wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz um das 10fache weniger toxisch ist als die Substanz (A). Die Anga ben über die hypotensive Wirksamkeit und Toxizität sind in Tabelle 2 angeführt.

Tabelle 2

Die erfindungsgemäße Verbindung unterscheidet sich hinsichtlich ihrer akuten Toxizität nur geringfügig von 4-(3′-Nitro phenyl)-2,6-dimethyl-3,5-dicarbäthoxy-1,4-dihydropyridin (DE-OS 16 70 827 oder Verbindung B der DE-OS 23 02 866). So beträgt bei Mäuse-Versuchen bei peroraler Verabreichung der LD₅₀-Wert für die erfindungsgemäße Verbindung ca. 4.000 mg/kg gegenüber ca. 5.000 mg/kg (B) und i. p. ca. 400 gegenüber 500 mg/kg.

Die Verbindung (B) ist weniger toxisch, steht jedoch der erfindungsgemäßen Verbindung hinsichtlich ihrer pharmakolo gischen (spezifischen) Aktivität nach und hat nicht die Nebenwirkungen, die die Verwendung von (B) kennzeichnen.

In Dosierung von 3 bis 10 mg/kg ruft die erfindungsgemäße Verbindung bei Versuchen an hypotensiven Ratten eine wesent lich weniger ausgeprägte Tachykardie hervor. Die Verbindung (B) wurde offensichtlich wegen ihrer tachykardischen Neben wirkung nicht zum Arzneimittel. An SHR-Ratten ruft diese Verbindung eine Steigerung der Frequenz der Herzmuskelkon traktionen um 13% hervor, wobei die Tachykardie noch nach 6 Stunden beobachtet werden konnte und das Maximum nach 3 Stunden erreicht wurde. Demgegenüber ist die Tachykardie bei der erfindungsgemäßen Verbindung weniger ausgeprägt (Stei gerung der Herzfrequenz auf 10% während einer Stunde, Maximum nach 30 Minuten).

Die Verbindung (B) ruft somit, verglichen mit der erfindungsgemäßen Verbindung, eine Tachykardie hervor, die 3- bis 5mal länger anhält und verursacht ferner noch bei wiederholter Verabreichung Tachyphylaxie. Da ein blutdrucksenkendes Prä parat zu therapeutischen Zwecken über längere Zeit verab reicht werden muß, ist die Anwendung dieser Verbindung zu medizinischen Zwecken sinnlos.

Die Wirkung auf das zentrale Nervensystem ist bei der erfindungsgemäßen Verbindung kürzer im Vergleich zu (C). In einer Dosierung von 1 mg/kg dauert die Nebenwirkung der er findungsgemäßen Verbindung 90 Minuten, bei (C) 150 Minuten.

Die erfindungsgemäße Verbindung übt eine weniger ausgeprägt dämpfende Wirkung auf die spontane Bewegungsaktivität aus. In einer Dosierung von 10, 30, 100 und 300 mg/kg vermindert (C) die aktive Bewegung entsprechend um 50,25; 38,8 und 76,2%.

Bei einer Dosierung von 3 bis 300 mg/kg hat aber die erfindungsgemäße Verbindung praktisch keinen mehr oder weniger bedeutsamen Einfluß auf die aktive Bewegung bei Versuchen an Mäusen der Linie BALB/C.

Bei einem Vergleich der Wirkung beider Verbindungen auf die Muskelkontraktion bei Mäusen wurde festgestellt, daß diese bei (C) wesentlich stärker ausgeprägt ist. Bei einer Dosierung von 10 mg/kg wirkte z. B. (C) bei dem durchgeführten Versuch wesentlich stärker, während die erfindungsgemäße Verbindung überhaupt nicht wirkte.

Die Wirkung auf den Muskeltonus wurde mit dem Test "sich am Reck hochziehen" ermittelt (Bassier J.R., Enc´phale, 1961, (1), Nr. 4, S. 340-359).

Die unten angeführten Werte sollen die Vorteile der erfindungsgemäßen Verbindung gegenüber der bekannten analogen Verbindung (C) zeigen (Tabelle 3).

Tabelle 3

Die Auswirkung auf die spontane Bewegungsaktivität von Mäusen des Stammes BAIB/c (Männchen, Körpergewicht 22-26 g) bei oraler Applikation (n =10, t =23°C)

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung auf die spontane Bewegungsaktivität wurde nach der Aktometrie-Methode unter sucht (K. S. Rajewskÿ, W. A. Timofejew, Bull. Exp. Biol. & Med., 1965, 6, S. 114-116). Die Merkmale der Bewegungsaktivität wurden nach 60 bis 120 min registriert, nachdem die Tiere in die dafür vorgesehene Versuchsanlage gesetzt worden waren.

Aus der Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung in den Dosen 3 bis 300 mg/kg keine wesentliche Auswirkung (P=0,5) auf die Bewegungsaktivität von Mäusen ausübt. (C) hingegen, verabreicht in kleinen Mengen von 10 bis 30 mg/kg, unterdrückt die spontane Bewegungsaktivität nach 60 bzw. 120 min: nach 60 min bei einer Dosis von 10 mg/kg um 40%, nach 120 min bei Dosen von 10 bzw. 30 mg/kg ent sprechend um 50% und 25%; (P=0,05). In Dosen von 100 bzw. 300 mg/kg ist die Auswirkung von (C) auf die spontane Bewe gungsaktivität von Mäusen statistisch gesehen ohne Bedeutung.

Nach der statistischen Auswertung der Ergebnisse in alterna tiver Form nach der Methodik von Litchfield J. T. und Wilcoxon F. (J. Pharmacol. Exp. Therap. 1949, (96), S. 99) wurden folgende Angaben ermittelt: ED₅₀ für die erfindungsgemäße Verbindung nach 60 min 100 (58,8-170,0) mg/kg und ED₅₀ für (C) 64 (37,6-108,8) mg/kg.

Daraus folgt, daß der absolute Wert von ED₅₀ für (C) größer ist. Aber die durchgeführte Vergleichsstudie der Aktivität beider Verbindungen hat gezeigt, daß P. R.<f. P. R. ist, d. h., der Unterschied zwischen der erfindungsgemäßen Verbindung und (C) bezüglich ihrer Auswirkung auf den Tonus der Skelett muskulatur vom statistischen Standpunkt her gesehen ist un wesentlich (P=0,5).

Die Vergleichsstudie der erfindungsgemäßen Verbindung und (C) bezüglich ihrer Auswirkung auf die Strukturen des zentra len Nervensystems wurde mit Hilfe der Elektroenzephalographie an Kaninchen im chronischen Experiment durchgeführt. Zu die sem Zweck wurden Tiere im Alter von 4 bis 6 Monaten (Männchen, Körpergewicht 2,5-3 kg) genommen. Bei Kaninchen wurde auf der Schädelfläche zwischen den Augen (10-12 mm vom Bregma ent fernt) ein spezieller Halter mit 8 Elektroden befestigt. Die Elektroden wurden in den motorischen, sensorischen und optischen Zonen der Gehirnrinde, in vorderem und hinterem Hypo thalamus, in der Retikularformation des Mittelhirns implan tiert, wobei sich im Nasenbein eine gemeinsame Elektrode be fand. Die Koordinaten der Unterrindenstrukturen wurden nach dem Atlas von Soyer et al (1954) bestimmt. Die Kaninchen wurden unter Pentabarbitalnarkose operiert (30 mg/kg, intrape ritoneal). Innerhalb von 2-3 Tagen nach der Operation wurde den Kaninchen Penicillin eingespritzt. Die bioelektrische Aktivität des Gehirns wurde mit Hilfe eines 8-Kanal-Elektro enzephalographen nach der Unipolarmethodik registriert. Die Versuchstiere befanden sich in einer abgeschirmten Kammer, die in einen speziellen Käfig gestellt wurde, was eine ruhige Stellung der Tiere während des Versuchs gewährleistete.

Es wurde die Wirkung der zwei Verbindungen auf die spontane bioelektrische Aktivität der oben erwähnten Hirnstrukturen, sowie auf die "Erwachreaktion" hervorgerufen durch Schallreiz (Pegel 800 und 3200 Hz), auf die Reaktion bei der Rhythmus umstellung, hervorgerufen durch taktmäßigen Lichtreiz (Fre quenz 2-30 Hz) beobachtet. Daneben wurde das EKG als Merkmal vegetativer Änderungen aufgezeichnet. Nach der Stabilisierung des EEG- bzw. EKG-Bildes wurde den Kaninchen physiologische Salzlösung in der Dosis 2 ml per os, sowie die erfindungsgemäße Verbindung in der Dosis 0,1; 1,0; 10,0; 20,0; 30,0; 50,0 und 100,0 mg/kg und (C) in der Dosis 0,1; 1,0 und 10,0 mg/kg verab reicht. Das EEG bzw. das EKG wurde alle 10 min nach der Verab reichung innerhalb einer Stunde aufgezeichnet und danach alle 30 min, bis sich die Ausgangsparameter wiederhergestellt hat ten. Die verabreichten Präparate wurden mit physiologischer Salzlösung bei Zugabe von Polyoxy-äthylen-sorbit-monooleat verdünnt.

Die akute Toxizität wurde an weißen, nicht reinrassigen Mäusen (Männchen, Körpergewicht 20-23 g) geprüft. Die erfindungsgemäße Verbindung wurde in Form einer Wassersuspension auf Basis von Polyoxy-äthylen-sorbit-monooleat intraperitoneal und intragastral in der Dosis 0,1 ml/10 g Körpergewicht appli ziert. Nach der Applikation des Präparats wurden die Mäuse 11 Tage lang beobachtet. Jede Dosis wurde an 6 Mäusen unter sucht. Zur Bestimmung der mittleren Letaldosis (LD₅₀) wurden 5-6 Dosen der genannten Verbindung genommen, wobei diese Un tersuchung nach der Methodik von Litchfield J. T. und Wilcoxon F. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 1949, (96), 99) durchgeführt wurde. Die beiden Verbindungen wurden jeweils zu feinem Pulver im Mörser verrieben (zu 95% bestand dieses Pulver aus Par tikeln mit der Länge <10µm). Die Präparate wurden zuvor mit Polyoxy-äthylen-sorbit-monooleat (0,2 ml 15%-Lösung auf je 1 g der Substanz) versetzt, wonach man sie in einem Homogenisator aus Teflon mit Destillierwasser suspendierte, bis man die gewünschte Konzentration erhielt. (C) wurde wegen seiner Lichtempfindlichkeit so verarbeitet, daß die Lichteinwirkung aus geschlossen war. Für Versuchszwecke wurden SLC-Wistar-Ratten im Alter von 5 Wochen genommen, die aus dem Tierlabor Agri cultural Cooperative Association for Laboratory Animals stamm ten und vor dem Experiment 2 Wochen lang zur Adaption an neue Verhältnisse im Labor gehalten wurden. Weibchen und Männchen wurden in 11 Versuchsgruppen zu je 15 Tieren aufgeteilt. In jedem Käfig befanden sich 3 Tiere. Das Mittelkörpergewicht am Beginn des Experiments betrug bei Männchen etwa 173 g und bei Weibchen etwa 124 g. Die Raumtemperatur betrug 21±1°C und die Luftfeuchtigkeit 55±5%. Der Raum wurde ununterbrochen mit der Klimaanlage ventiliert. Die Ratten wurden mit speziellem Laborfutter CE-7 ernährt und mit Leitungswasser ad libidum getränkt.

Die an Ratten beobachtete akute Toxizität beträgt bei oraler Applikation für die erfindungsgemäße Verbindung 6.000 bis 7.000 mg/kg und für (C) 4.000 bis 8.000 mg/kg.

Beim Studium der subakuten Toxizität an Ratten wurden toxische Symptome bei der erfindungsgemäßen Verbindung nur bei einer Dosierung von 2.000 mg/kg festgestellt, während diese bei (C) schon bei einer Dosierung von 400 mg/kg festgestellt wurden.

Die maximale Dosis betrug bei diesem Experiment 0,5 bis 0,25 von LD₅₀, d. h., beide Präparate wurden in der Menge 3,2; 16; 80; 400 und 2.000 mg/kg verabreicht. Das Suspensionsvolumen belief sich bei dieser Dosis auf 20 ml/kg bei 2.000 mg/kg und auf 10 mg/kg bei den übrigen Dosen. Den Kontrollratten wurde nur Lösungs mittel (10 mg/kg) enthaltend 0,3% Polyoxy-äthylen-sorbit-monooleat verabreicht, weil eine solche Konzentration für die den Ratten verabreichten Präparate das Maximum betrug. Die Präparate wurden 12 Wochen lang ununterbrochen appliziert.

Die Ratten standen jeden Tag unter allgemeiner Beobachtung, das Körpergewicht wurde einmal pro Woche bestimmt. Der Was serverbrauch wurde einmal pro Woche errechnet, ausgehend von dessen gegebender und verbliebener Menge. Der Futterverbrauch wurde analog dazu errechnet. Innerhalb von 10-11 Wochen wurde das Sediment im Harn sowie der Augenhintergrund bei den Kontroll ratten beobachtet (fotografiert); diesen Ratten wurden 16 und 400 mg/kg beider Präparate verabreicht. Alle Ratten, die das Präparat 12 Wochen lang erhielten, wurden nach Ablauf von 17-24 Stunden getötet.

Es wurde aufgezeichnet:
Reaktion auf Schallreiz, Farbe, Aus richtreflex, Hornhautreflex, Pupillen reflex, Körpergewicht, Kopf-, Rumpf- und Schwanzlänge

Urinanalyse:
Blutspuren, Ketonkörper, Glukose, Proteine, pH

Hämatologische Untersuchungen:
Anzahl der roten Blutkörperchen, Thrombozytenanalyse, Thrombozyten zahl, Hämatokrit, Hämoglobin, Nieder schlagszeit (Prothrombinzeit, relative Prothrombinzeit), Differenzzahl der weißen Blutkörperchen, Anzahl der Retikulozyten

Biochemische Untersuchungen:
Allgemeiner Cholesteringehalt, Zucker, totales Protein, Stickstoffgehalt im Urin, alkalische Phosphatase, Glutamat- Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyru vat-Transaminase, Albumin, Globulin, Ver hältnis Albumin/Globulin, Elektrolyt (Na⁺, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, anorg. Phosphat, Cl^-), Knochen markanalyse.
Autopsie und pathologische Untersuchung

Nach der künstlichen Blutentleerung wurden die Ratten sofort einer Autopsie unterzogen. Zuerst waren bemerkenswerte Ände rungen in Organen und Geweben zu verzeichnen.
Folgende Körperorgane wurden gewogen:
Hypophyse, Schilddrüse, Adrenaldrüse, Ovaria, Gebärmutter, Hoden, Prostata, Samenzellen, Gehirn, Speicheldrüse, Thymus, Herz, Lungen, Leber, Milz und Nieren.
Histopathologisch wurden die oben genannten Organe sowie die folgenden untersucht: Pankreas, Lymphknoten, Magen, Duodenum, Rektum, Aorta, Urinblase, Muskeln, Knochenmark, Augen, Haut, Rückenmark und Dünndarm.

Diese Organe wurden mit 10%igem Pufferformalin fixiert, wo nach man paraffinierte Schnitte anfertigte bei nachträglicher Fixation mit Hämatoxylin und Eosin. Gestorbene wie auch über lebende Ratten wurden auf die gleiche Art histopathologisch untersucht.

Claims

2,6-Dimethyl-4-(2-difluormethoxy-phenyl)-1,4-dihydropyridin-3,5-dica-rbon säuredimethylester der Formel (I)