DE2838644A1 - 5-trifluormethyl-2'-desoxycytidin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

TER MEER - MÜLLER - STEINMEIST

D-8000 München 22 D-4800 Bielefeld

Triftstraße 4 * «->' Siekerwall 7

ER ⁰

5. Sep. 1978

Case: PCR-121-GER
tM/th

PCR, INC., P.O.Box 1466, Gainesville, Florida 32601/USA

und

UNIVERSITY OF MIAMI, 141 Ashe Building Coral Gables, Florida 33124/USA

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel.

Prioritäten:

17.	März	1	978,	USA,	Nr.	887	,745
17.	März	1	978,	USA,	Nr.	887	„555
17.	März	1	978,	USA,	Nr.	887	,541

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BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung sowie Arzneimittel bzw. pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindung als Wirkstoff enthalten. 5

Durch Herpesvieren und herpesartige Viren verursachte Erkrankungen des Menschen sind besonders weit verbreitet. Beispiele für Herpesviren sind Herpes simplex Virus (HSV) Typ 1 (HSV-1) und 2 (HSV-2) und Herpes varicellazoster Virus (VZV), das die Windpocken bei Kindern und die Gürtelrose bei Erwachsenen verursacht. Andere Beispiele für herpesartige Viren sind das Epstein-Barr Virus, Pseudorabies Virus, Cytomegalo Virus, das die Marekkrankheit bei Hühnern verursachende Virus, das Pferdeabort Virus (equine abortion virus EAV) und das Lucke-Frosch Virus.

Herpes simplex Viren treten bei vielen pathologischen Systemen auf und schließen Augeninfektionen (Keratitis), Hautinfektionen (im Geschlechtsbereich und im Mundbereich) und auf systemischem Wege ausgebreitete Infektionen ein. Eine von dem Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) verursachte Erkrankung ist eine besonders virulente Form der Encephalitis, die, wenn sie nicht in wirksamer Weise behandelt wird, im allgemeinen tödlich verläuft. Es ist weiterhin bekannt, daß Herpesviren und herpesartige Viren bei der Verursachung von infektöser Mononucleosis, dem Burkitt¹s Lymphom und Nasen-Rachen-Karzinomen beteiligt sind. Auch wiederkehrende und anhaltende Infektionen der Genitalien werden von dem Virus

HSV-2 verursacht, das weit verbreitet ist und nur schlecht behandelt werden kann, so daß die daran erkrankten

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Patienten an starken physischen Beschwerden und psychologischen Spannungen leiden. Das Virus HSV-1 verursacht einem Großteil der Bevölkerung erhebliche Beschwerden. Bislang war jedoch keine Möglichkeit bekannt, die wiederauftretenden Infektionen zu behandeln und dieses Virus in seinem latenten Zustand zu bekämpfen.

Varicella-zoster ist häufig die Ursache der Morbidität von immunosuppressiv behandelten Patienten, wie den Empfängern von Nierentransplantaten und Krebspatienten.

Das Cytomegalo-Virus verursacht Abnormitäten bei Embryos, perinatale neurologische Erkrankungen und führt zu grossen Problemen bei den Neugeborenen und stellt ebenso wie das Zoster-Virus ein neurotropes Virus dar.

Ein besonders aktiver Bereich der derzeitigen medizinischen Forschung befaßt sich mit der Untersuchung von durch Viren verursachten Erkrankungen und insbesondere jenen, die durch Herpesviren und herpesartige Viren verursacht sind. Ein wichtiger Bereich dieser Forschungen befaßt sich mit der Entwicklung von selektiven Mitteln mit Wirkung gegen Viren, die zur Behandlung dieser Erkrankungen eingesetzt werden können. Ein weiterer Aspekt dieser Untersuchungen ist in der Entwicklung eines wirksamen antineoplastischen Mittels zu sehen,das in selektiver Weise sich schnell teilende Zellen abtötet. Wenngleich erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von gegen Viren wirkenden Mitteln und für die chemotherapeutische Behandlung von Krebs geeigneten Mitteln gemacht worden sind, steht bislang kein völlig zufriedenstellendes Mittel zu Verfügung. Wie weiter unten näher erläutert werden wird, ist das Hauptproblem der gegen Viren wirkenden Mittel und der chemotherapeutischen Mittel in ihrer Neigung, im Körper einem Katabolismus zu unter-

35 liegen, und insbesondere in ihrer Toxizität gegen nichtinfizierte Zellen, das heißt ihrer unzureichenden

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Selektivität, zu sehen.Dies ist auch ein Problem von Analogen von Nukleinsäurebestandteilen gewesen, die als antineoplastische Mittel eingesetzt werden.

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Die Suche nach wirksamen Mitteln mit Wirkung gegen Viren, die eine spezifische Wirkung gegen Viren bei Zellen ausüben, die mit Herpesviren und herpesartigen Viren infiziert sind, hat unterschiedliche Erfolge gezeigt. 1962 untersuchte Kaufman (IDU Therapy of Herpes Simplex, Arch.Ophthalmol. 67 (1962) 583) die Aktivität von bestimmten 5-Halogen-desoxyuridin-Verbindungen gegen Viren und fand, daß 5-Jod-2'-desoxyuridin eine antivirale Wirkung gegen HSV-Infektionen des Auges ausübt. Später fand Heidelberger, daß wenngleich 5-Fluor-desoxyuridin eine sehr geringe Wirkung gegen Viren ausübt, 5-Trifluormethyl-2-desoxyuridin oder 5-Trifluor-thymidin eine gegen Viren wirkende Aktivität bei Infektionen des Auges besitzt«5-Trifluorthymidin ist in der US-PS 3 201 387 beschrieben und beansprucht.

(IdU)

(F₃dU)

HOH₂C

5~\Tod-2 ° -deso2Eyuridin

5-Trifluom="chyl-2' «descssyuridin

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Wenngleich 5-Jod-2'-desoxyuridin gegen Herpes-Keratitis wirksam ist/ ist diese Verbindung weniger wirksam als 5-Trifluorthymidin und weniger wirksam bei systemischen Infektionen oder bei der Behandlung von Herpes genitalis, 5

Trotz der Tatsache, daß sie eine Wirkung gegen Viren ausüben, leiden diese beiden Verbindungen (nämlich 5-Jod-2'-desoxyuridin und 5-Trifluor-thymidin) an zwei wesentlichen Nachteilen. Der erste ist darin zu sehen, daß die Verbindungen im Körper einem schnellen Katabolismus unterliegen, der zu einer signifikanten Verminderung der Wirksamkeit der Verbindungen gegen Viren führt. Der zweite Nachteil ist darin zu sehen, daß die Verbindungen gegen nicht-infizierte Zellen toxisch sind, was wiederum Anlaß ist für unangenehme und schädliche Nebenwirkungen. Die Behandlung von Herpes-Encephalitis mit S-Jod-2¹-desoxyuridin wurde wegen der Toxizität und der Unwirksamkeit dieser Verbindung aufgegeben, während 5-Trifluor-thymidin für die Behandlung von systemischen Infektionen nicht eingesetzt wurde. Es wurden einige Versuche unternommen, zur Behandlung der Encephalitis diese Verbindung direkt in den Schädel zu injizieren. Die Untersuchungen befinden sich jedoch nocht im Stadium der Tierversuche. Weiterhin scheint diese Behandlungsform bei der Anwendung auf Menschen erhebliche Gefährdungen mit sich zu bringen.

Es ist von Untersuchungen von verschiedenen 5-substituierten analogen Verbindungen des Desoxyuridins, einschließlich 5-Methylamino-2'-desoxyuridin, 5-Thiocyanato-2'-desoxyuridin, 5-Sthyl-2'-desoxyuridin, 5-Propyl-2'-desoxyuridin, 5-Phenyl-2'-desoxyuridin und 5-Allyl-2'-desoxyuridin, berichtet worden, die erkennen lassen, daß diese Verbindungen in Zellkulturen eine Wirkung gegen Herpes simplex Viren ausüben. Der Erfolg dieser

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Verbindungen wird jedoch wahrscheinlich auf Zellkulturuntersuchungen beschränkt sein, trotz der Tatsache, daß sie in diesen Kulturen nicht toxisch sind, da sie Substrate für die katabolen Enzyme üridinphosphorylase und Thymidinphosphorylase darstellen.

Es konnte gezeigt werden, daß Adeninarabinosid zu einer Verminderung der Letalität von Encephalitis beim Menschen führt. Jedoch war die Zahl der behandelten Patienten, die an neurologischen Nebenwirkungen litten, entmutigend. Dies bedeutet, daß der Arzneimittelwirkstoff zwar die Mortalität vermindert, jedoch die Morbidität erhöht. Weiterhin sind Adeninarabinosid (ara-A) oder Adenosinmonophosphat-arabinosid (ara-AMP) weder gegen anhaltende Herpesinfektionen des Genitalbereiches wirksam, noch führen sie zu einer Verminderung des Auftretens von latenten Virusinfektionen. Phosphonessigsäure zeigt sich bei Tieren als wirksam, muß jedoch in den meisten Fällen sehr bald nach der Injektion verabreicht werden und ist im allgemeinen unwirksam, wenn der Beginn der Behandlung verzögert wird, was aber bei der Anwendung auf den Menschen der realistisch anzusehende Normalfall ist.

Andere Arzneimittel, wie Thymidin-arabinosid (ara-T), 4-Amino-5-jod-desoxyuridin und Acylguanin, befinden sich in verschiedenen Stadien der Entwicklung und sind noch weit davon entfernt, bei klinischen Untersuchungen eingesetzt zu werden. Weiterhin ist es wegen der Fähigkeit der Viren,durch Mutation gegen Arzneimittel resistent zu werden (wie es bei Phosphonessigsäure der Fall ist), wahrscheinlich, daß die chemotherapeutische Behandlung von Viren eine Kombination von Arzneimitteln erfordern wird, die über verschiedene Mechanismen ein-5 wirken.

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Auf dem Gebiet der Krebsforschung wurde ein sehr wirksames Arzneimittel, nämlich 5-Fluor-uracil, von C.Heidelberger entwickelt. Die Möglichkeit, dieses Arzneimittel als wirksamen Inhibitor von schnell wachsenden Tumoren zu übertreffen, zeigte sich bei seiner Synthese von 5-Trifluor-thymidin. 5-Trifluor-thymidin wird jedoch im Menschen schnell katabolisiert, so daß seine weitere Untersuchung als Antikrebsmittel aufgegeben wurde.

In jüngster Zeit wurde das Interesse auf die Untersuchung von Desoxycytidinverbindungen und insbesondere auf die 5-substituierten Derivate, als mögliche Mittel mit Wirkung gegen Viren gerichtet. Greer et al. (Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 255

(1975) 359) untersuchten die Wirkung von 5-Halogen-2'-desoxycytidinen und insbesondere von 5-Brom-2'-desoxycytidin und von 5-Jod-2'-desoxycytidin gegen Viren. Die Untersuchungen haben gezeigt, daß diese 5-Halogen-2·-desoxycytidin-Verbindungen eine ähnliche antivirale

20 Wirkung gegen mit HSV infizierte Zellen ausüben, wie

die entsprechenden 5-Halogen-2'-desoxyuridin-Verbindungen, wobei die Hauptbedeutung darin zu sehen ist, daß die 5-Halogen-2*-desoxycytidin-Verbindungen wesentlich weniger toxisch gegen nicht-infizierte Zellen sind als die

25 Desoxyuridin-Verbindungen. Kurimoto et al. (Foliaο

Ophthalmol. Japan, 20(1969) 4 9) haben gezeigt, daß 5-Jod-2'-desoxycytidin für die Behandlung von Herpes-Keratitis wirksamer ist als 5-Jod-2^!-desoxyuridin»

Ein Nachteil der 5-Halogen-2'-desoxycytidin-Verbindungen ist in ihrer Neigung zu sehen, in Gegenwart von desaminierenden Enzymen, wie Cytidindesaminase, einer Desaminierung zu unterliegen. Solche Enzyme sind normalerweise im Blut vorhanden und katalysieren die Des-

35 aminierung der 5-Halogen-2'-desoxycytidin-Verbindung zu der entsprechenden 5-Halogen-2'-desoxyuridin-

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Verbindung.' Als Ergebnis dieser Desaminierung werden Uridinverbindungen gebildet, die keine Selektivität besitzen und gegen nicht-infizierte Zellen toxisch sind und somit zu unangenehmen und schädlichen Nebenwirkungen führen. Weiterhin werden die analogen Desoxyuridinverbindungen weiterhin zu Stoffwechselprodukten abgebaut, die keine Wirkung gegen Viren ausüben.

Zur Überwindung dieses Problems der Desaminierung hat es sich als erforderlich erwiesen, einen Desaminierungsinhibitor einzusetzen, wozu sich Tetrahydrouridin und 2'-Desoxytetrahydrouridxn als besonders wirksam erwiesen haben. Diese beiden Verbindungen sind in der US-PS 4 017 606 (Hanze et al.) beschrieben. Diese Druckschrift beschreibt die Synthese von Tetrahydrouridin und 2'-Desoxytetrahydrouridin ausgehend von einer Verbindung, deren allgemeine Formel die Verbindung 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin einschließt, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Es findet sich jedoch in der genannten Druckschrift keine spezifische Offenbarung bezüglich 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin und keinerlei Hinweis auf irgendeine Wirkung dieser Verbindung gegen Viren.

Jüngere Untersuchungen haben über die Wirkung von 5-Methy1-2'-desoxycytidin und 5-Äthyl-2'-desoxycytidin gegen Viren berichtet. Shugar (J.Med.Chem., Vol. 17, Nr. 3 (1974) 296) fand, daß 5-Äthyl-2·-desoxycytidin nur eine geringe Wirkung gegen durch HSV infizierte Zellen und keine Wirkung gegen Kuhpocken und gegen vesikuläre Stomatitis ausübt. Neueste Untersuchungen von Lin und Prusoff (Abstracts of Papers, 174th ACS Meeting, American Chemical Society, 28. August bis 2.September 1977) haben gezeigt, daß 5-Methyl-2'-desoxycytidin als antivirales Mittel zur Behandlung von durch HSV infizierten Zellen weniger wirksam ist als 5-Methyl-2^ü-

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desoxyuridin.

Die erfindungsgemäße Verbindung 5-Trifluormethyl-2 desoxycytidin, die der folgenden Formel 5

NH,

KOH₀C
10 ^z\ ^-0\ (F₃methyl dc)

entspricht, zeigt eine Reihe von überraschenden und nicht zu erwartenden Vorteilen gegenüber den oben abgehandelten herkömmlichen antiviralen Mitteln bzw. Mitteln zur Bekämpfung von Viren. Insbesondere zeigt 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin eine erhöhte Spezifität gegen Zellen,die von Herpesviren und herpesartigen Viren infiziert worden sind. Die Verbindung wird in nicht-infizierten Zellen nicht zu einem cytotoxischen StoffWechselprodukt abgebaut. Weiterhin zeigt 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin eine erhöhte Stoffwechselstabilität, was eine anhaltende antivirale Aktivität zur Folge hat. Die Verbindung zeigt eine wesentlich stärkere Wirkung gegen Viren und dies bei Konzentrationen, die nicht cytotoxisch sind.

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytodin wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch hergestellt, daß man 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin, dessen freie Hydroxylgruppen geschützt worden sind, mit Ammoniak umsetzt. Die Reaktion wird im allgemeinen bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt, die nicht oberhalb der Zer-Setzungstemperaturen der Ausgangsmaterialien und der Endprodukte liegt. Die Reaktionstemperatur variiert im

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allgemeinen von etwa 50 bis 25O°C und vorzugsweise von etwa 60 bis 100°C. Es hat sich in der Praxis gezeigt, daß Temperaturen von etwa 60 bis 80⁰C die zufriedenstellendsten Ergebnisse liefern. Die genaue Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, hängt natürlich von der Art der eingesetzten Reaktionsteilnehmer und der verwendeten Lösungsmittel ab, wobei die optimale Temperatur ohne weiteres durch einfache Untersuchungen ermittelt werden kann.

10

Im allgemeinen ist es notwendig, die freien Hydroxylgruppen zu schützen, bevor die Aminierung in zufriedenstellender Weise durchgeführt wird. Es ist hierfür möglich, irgendeine geeignete Schutzgruppe einzusetzen, wenngleich es aus Gründen der einfacheren Handhabung im allgemeinen bevorzugt ist, eine blockierende Gruppe oder Schutzgruppe einzuführen, die ein kristallines Produkt bildet statt einer Schutzgruppe, die zu einem flüssigen Produkt Anlaß gibt.

Es hat sich gezeigt, daß die Synthese besonders zufriedenstellend dann abläuft, wenn man eine Silylschutzgruppe anwendet, wie die Trimethylsilylgruppe, die man mit Hilfe -der Verfahrensweise einführen kann, die von Vorbrüggen und Niedballa (Angew.Chem.Internat.

Edit., Vol. 10, Nr. 9 (1971) 657) beschrieben worden ist, auf welche Druckschrift hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Hierzu wird die Reaktion vorzugsweise in der Weise geführt, daß man 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin mit einem Silylierungsmittel, wie Hexamethyldisilazan (HMDS) oder Trimethylsilylchlorid (Trimethy!chlorsilan oder TMCS) in Gegenwart von überschüssigem Ammoniak umsetzt. Das Silylierungsmittel wird im allgemeinen im Überschuß eingesetzt und dient sowohl als Lösungsmittel für die Reaktion als auch als Silylierungsmittel. Weiterhin ist es möglich^ die verschiedenen freien Hydroxylgruppen mit verschiedenen

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Schutzgruppen zu schützen. Beispielsweise kann man die 2,4-Stellungen des Pyrimidinrings durch Umsetzen mit einer Art eines Mittels zur Einführung von Schutzgruppen umsetzen und die Hydroxygruppen an dem Desoxyfuranosylring mit Hilfe einer andersartigen Schutzgruppe schützen.

Die Reaktion wird im allgemeinen während mindestens 10 Stunden, üblicherweise während 20 bis 50 Stunden, durchgeführt. Es ist nicht notwendig, die Reaktion unter überatmosphärischem Druck zu führen, wenngleich es sich als vorteilhaft erwiesen hat, die Reaktion in einem geschlossenen Rohr oder einem Autoklaven ablaufen zu lassen, um unerwünschte Ammoniakverluste während des Erhitzens zu vermeiden. Wenn die Reaktion in einem Autoklaven oder einem geschlossenen Rohr durchgeführt wird, erhält man bei Drucken von 3,45 bis 13,8 bar (500 bis 200 psi), und noch bevorzugter bei Drucken von 4,14 bis 5,51 bar (60 bis 80 psi) gute Ausbeuten der gewünschten Verbindung 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin.

Nach Ablauf der Reaktion erhält man als Reaktionsmischung im allgemeinen eine ölige braune Flüssigkeit, die unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen zu 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin aufgearbeitet werden kann, das in Form eines weißen kristallinen Feststoffs anfällt. 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin ist in Aceton unlöslich und in Wasser teilweise löslieh und kann in zufriedenstellender Weise aus heißem Wasser umkristallisiert werden.

Als überraschend und unerwartet ist die Stabilität der Trifluormethylgruppe bei den angewandten Reaktions-5 bedingungen anzusehen. Aus der Literatur ist bekannt, daß sich beim Erhitzen von 5-Trifluormethyl-2'-desoxy-

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3¹,5'-di-0-toluyl-uridin mit methanol!sehem Ammoniak in einer Stahlbombe bei etwa 100⁰C ausschließlich das 5-Carbomethoxynucleosid bildet (Ryan et al., J.Org.Chem· 31 (1976) 1181). Es ist möglich, daß die Anwesenheit einer Schutzgruppe in dem Pyrimidinring den Verlauf der Reaktion beeinflußt.

Ein weiteres überraschendes und nicht zu erwartendes Ergebnis der Herstellung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin ist darin zu sehen, daß die Silylierungs/Aminierungs-Reaktion in Abwesenheit eines N--Substituenten nicht abläuft. Somit ergibt die Umsetzung von 5-Trifluormethyluracil mit Hexamethyldisilazan und überschüssigem Ammoniak unter Anwendung,der oben beschriebenen Reaktionsbedingungen nicht die entsprechende Aminoverbindung, was durch das nachstehende Vergleichsbeispiel A verdeutlicht wird.

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte 5-Trifluormethyl-2·- desoxyuridin (Trifluorthymidin) kann man mit Hilfe jener Verfahrensweisen herstellen, die von Heidelberger et al. (J.Am.Chem.Soc. 34 (1962) 3597 und J.Med.Chem. 7 (1964) 1 und US-PS 3 201 387) und Ryan et al. (J.Org.Chem. 31 (1966) 1181) beschrieben worden sind.

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Es hat sich gezeigt, daß man bei der oben beschriebenen Silylierungsreaktion mit einer Mischung aus Hexamethyldisilazan und einer geringen Menge Trimethylchlorsilan eine höhere Ausbeute oder eine schnellere Reaktion erreicht, da offenbar die geringe Menge des Trimethylchlorsilans eine katalytische Wirkung ausübt. Diese Wirkung ist in der US-PS 4 024 143 vom 17. Mai 1977 offenbart, auf welche Druckschrift hiermit bezüglich der dort beschriebenen Silylierungsreaktionen ausdrücklich Bezug genommen sei.

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Die bevorzugten Silylierungsmittel wurden oben bereits angegeben. Die Silylierungsreaktion kann jedoch ganz allgemein in der Weise durchgeführt werden, daß man mindestens eine stöchiometrische Menge eines Silylierungsmittels,

nämlich eines Silans der allgemeinen Formel

<R')₃SiX

in der R¹ für eine niedrigmolekulare Alkylgruppe und X für ein Halogenatom stehen, und/oder eines Disilazans der allgemeinen Formel

ZT(R')₃Si7₂NH

worin R¹ für eine niedrigmolekulare Alkylgruppe steht, verwendet und bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Reaktionsmischung arbeitet. Die in den obigen allgemeinen Formeln angegebenen niedrigmolekularen Alkylgruppen können 1 bis etwa 4 Kohlen-

20 stoffatome enthalten.

Die Authentizität der erfindungsgemäßen Verbindung wird mit Hilfe der nachstehend angegebenen Verfahrensweise nachgewiesen.
25

5-Trifluorthymidin (5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin) (Rc = 0,43) und

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin (R_f = 0,80) sind mit Hilfe eines Chromatographiesystems auf der Grundlage von Whatman 3MM und einem System aus wassergesättigtem n-Butanol und Ammoniak (100 ml mit Wasser gesättigtem n-Butanol plus 1 ml konzentriertem NH₄OH) trennbar. Inkubiert man 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin mit einem rohen Cytidindesaminaseextrakt aus menschlichem Epidermoid-Karzinom (HEP-2-Zellen), so ergibt sich ein Flecken mit einem R_f-Wert von 0,43, während der Flecken

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mit einem R^-Wert von 0,80 bei dem obigen Chromatographiesystem verschwindet. Das mit Cytidindesaminase inkubierte 5-Trifluorthymidin verbleibt dabei chromatographisch unverändert.
5

Die Ergebnisse der Behandlung mit HNO₂ (bei einem pH-Wert von 4,5) bei Raumtemperatur sind identisch mit den oben erhaltenen. Das Inkubieren von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin während 9 Stunden führt in etwa 98%iger Umwandlung zu einem Produkt, das in dem gleichen Lösungsmittelsystem, wie dem oben beschriebenen, den gleichen R_f-Wert wie 5-Trifluor-thymidin besitzt. 5-Trifluor-thymidin bleibt dabei unverändert. Inkubiert man 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin und 5-Trifluorthymidin mit einem Acetatpuffer (mit einem pH-Wert von 4,5) während 9 Stunden, so ergibt sich keinerlei Modifizierung der Desoxyribonucleoside.

Die folgenden Flecken werden mit Wasser eluiert und bezüglich ihres UV-Spektrums bei 225 bis 350 nm untersucht:

a) Standard

b) 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin-Standard

c) Flecken mit einem R_f-Wert von 0,43 nach der Behandlung von 5-Trifluorthymidin mit Cytidindesaminase und

d) Flecken mit einem R^-Wert von 0,43 nach der Behandlung von 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin mit Cytidindesaminase.

Das UV-Absorptionsspektrum von durch Desaminierung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin gebildetem 5-Trifluorthymidin ist identisch mit dem Spektrum, das man mit authentischem 5-Trifluorthymidin erhält.

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Die obigen Lösungen a, c und d werden auf den gleichen 0.D.-Wert eingestellt und als Substrate für die durch HSV-2 induzierte Pyrimidin-desoxyribonucleosidkinase verwendet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt:

Lösung nMol phosphoryliert während

60 Minuten

a 0,07

¹⁰ c 0,08

d 0,05

Somit wird das Produkt der Behandlung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin mit Cytidindesaminase (d) ebenso phosphoryliert wie 5-Trifluorthymidin.

Man bildet Stammlösungen von 5-Trifluorthymidin und 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin mit gleicher Konzentration wie die chromatographisch gereinigten Produkte 5-Trifluorthymidin und 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin (Lösungen a bzw. b). Üblicherweise wird 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin nur zu einem Sechstel des Ausmaßes phosphoryliert in dem 5-Trifluorthymidin phosphoryliert wird. Dieses Experiment wird mit der Absicht durchgeführt, nachzuweisen, ob die oben beschriebene chromatographische Reinigung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin zu-einer besseren Phosphorylierung bezüglich 5-Trifluorthymidin führt. Diese Untersuchung wird zweimal durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben.

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nMol phosphoryliert in 4 Stunden

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Standardlösungen

Chromatographisch gereinigt

5-Trifluorthymidin 0,48

5-Trifluormethyl- 0,48 2'-desoxycytidin

(0,57)

(0,08) etwa 1/6

kein signifikanter Unterschied in dem Verhältnis

5-Trifluorthymidin 0,16

5-Trifluormethyl- 0,04 2'-desoxycytidin

(0,19)

(0,06) ungefähr

1/3 bis 1/4

Die Werte für die chromatographisch gereinigten Proben sind wahrscheinlich wegen Verunreinigungen aus dem nicht mit Säure gewaschenen Papier niedriger.

Man kann auch andere chromatographische Systeme und chemische Analysenverfahren, wie die Dünnschichtchromatographie, dazu verwenden, die Identität der Erfindung nachzuweisen. Die Reinheit der bei den obigen Untersuchungen eingesetzten Verbindung beträgt etwa 80%.

25

Elementaranalyse:

	40	C	4	H	1	4	N
ber. :	40	,67	3	,06	1	3	,23
gef. :	,63	,80		,08

30

35

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin zeigt eine überraschend selektive Wirkung gegen Viren und insbesondere gegen Zellen, die mit den Viren HSV-1 und HSV-2 infiziert sind, sowie gegen Zellen, die mit dem Herpes-varicella-zoster-Virus (VZV) infiziert sind. Weiterhin zeigt 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin, wenn die Verbindung zusammen mit

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einem Cytidindesaminaseinhibitor, wie Tetrahydrouridin, eingesetzt wird, eine überraschende und unerwartete Verbesserung der Stoffwechselstabilität, die zu einer geringeren Cytotoxizität in den Zellen führt, im Vergleich zu anderen Verbindungen, wie Trifluorthymidin, unabhängig davon, ob diese mit oder ohne einen Inhibitor eingesetzt werden. Aufgrund der starken Aktivität gegen Viren und der geringen Cytotoxizität kann die erfindungsgemäße Verbindung 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin in derart geringen Mengen, die dennoch eine ausreichende Wirksamkeit gegen Viren ausüben, eingesetzt werden, daß die Cytotoxizität gegenüber nicht-infizierten Zellen minimal ist.

Da die transformierten Zellen die durch Herpes verursachte Enzymaktivität besitzen und selektiv gegen 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin empfindlich sind, ist davon auszugehen, daß 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin die Fähigkeit besitzt, latente Infektionen zu beeinflussen, die erhebliche Probleme bezüglich der neurotropischen Wirkung dieser Viren darstellen.

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin sollte für die Behandlung von verschiedenen von Herpes verursachten Krankheitszuständen geeignet sein, wie Nasen-Rachen-Karzinome und das Burkitt's Lymphom.

Weiterhin sollte 5-Trif luormethyl-2'-desoxycytidin (F₃methyldC) wegen seiner Fähigkeit, das Enzym Thymidylatsynthetase zu inhibieren, wenn, wie es angenommen wird, das Material im Stoffwechsel zu 5-Trifluorthymidinmonophosphat abgebaut wird, als chemotherapeutisches Mittel zur Behandlung des Krebses geeignet sein. Es ist bekannt, daß Thymidylatsynthetase das Targetenzym der 5-Fluoruracil-Chemotherapie ist. Es wird angenommen, daß 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidinmonophosphat (F₃methylCMP) langsam zu 5-Trifluorthymidin-

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monophosphat (F^dTMP) umgewandelt wird und die Zellen inhibiert, wenn diese in die S-Phase (die Phase der DNA-Synthese) übergehen. Dies bedeutet, daß 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin dann als eine Depotform des potentiellen Inhibitors von Krebszellen dienen kann.

Eine weitere Eigenschaft von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin ist sein Eingreifen in die DNA, mit der Möglichkeit, die DNA-Synthese in den Krebszellen zu beenden. Die Konzentrationen, in denen 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin als chemotherapeutisches Mittel für die chemotherapeutische Behandlung des Krebses eingesetzt werden, sind etwa um eine Größenordnung größer als die Konzentrationen, die man bei der Behandlung von Viren anwendet, wie es aus den nachstehenden Erläuterungen hervorgeht. Es ist bekannt, daß gewisse Tumoren einen hohen Gehalt an Cytidindesaminase aufweisen. Solche Tumoren sind gegen eine chemotherapeutxsche Behandlung mit ara-C resistent. Diese Tumoren können jedoch am Ort des Tumors 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin in einen potentiellen selektiven Inhibitor der Krebszellen desaminieren, wobei 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin in Nichtkrebsgewebe mit wesentlich geringerer Geschwindigkeit umgewandelt wird. Für diese Anwendungszwecke wird 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin ohne die gleichzeitige Verabreichung eines Cytidindesaminaseinhibitors gegeben.

5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin kann als wesentlicher Wirkstoff in pharmazeutisch wirksamen Mengen zusammen mit geeigneten Trägermaterialien oder Verdünnungsmitteln für die intraperitoneale Verabreichung bei Tieruntersuchungen, für die intravenöse, subkutane, intramuskuläre, orale oder topische Verabreichung zu pharmazeutischen Zubereitungen formuliert werden. Die

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Konzentration der Verbindung in der Zubereitung kann von etwa 0,01 bis 50 Gew.-% variieren in Abhängigkeit von dem Verabrexchungsweg, der Häufigkeit der Verabreichung, der Schwere des Krankheitszustandes, und dem Alter, dem Gewicht und dem allgemeinen physischen Zustand des zu behandelnden Patienten. Wenn die Zubereitung oder das Arzneimittel in einer für die topische Verabreichung geeigneten Form, beispielsweise einer Salbe, vorliegt, variiert die Konzentration an 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin im allgemeinen von etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 20 Gew.-% und noch bevorzugter von etwa 5 bis etwa 10 Gew.-%. Wenn die Zubereitung in einer Form vorliegt, die für die intraperitoneale Verabreichung bei Tier-Untersuchungen geeignet ist, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin, liegt der Wirkstoff im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 5 % (Gewicht/Volumen) und noch, bevorzugter in einer Menge von etwa 1 Gew.-% (Gewicht/Volumen) vor. Bei oral zu verabreichenden Präparaten variiert die Konzentration an 5-Trifluormethyl-2¹ -desoxycytidin im allgemeinen von etwa 0,05 bis etwa 10 Gew.-%, bevorzugter von etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-% und noch bevorzugter von etwa 1 bis

25 etwa 2 Gew.-%.

Wenn 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin durch intravenöse Injektion verabreicht werden soll, beträgt die Konzentration der- Verbindung etwa 0,05 bis etwa 5 % (Gewicht/ Volumen), bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 0,5 % (Gewicht/ Volumen). Für die intramuskuläre Injektion werden die gleichen Konzentrationen angewandt, wie sie eben bezüglich der intraperitonealen Verabreichung angegeben sind. Weiterhin kann man in gewissen Fällen, beispielsweise zur Behandlung bestimmter Arten von Encephalitis, die Verbindung direkt in den Schädel injizieren.

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Man kann auch andere Verabreichungswege anwenden. So kann man für bestimmte Arten von Virusinfektionen Suppositorien verwenden und kann bei anderen therapeutischen Behandlungen 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin auch in Form von chirurgisch einzubringenden Implantaten mit langsamer Wirkstofffreisetzung einsetzen.

Als pharmazeutisch annehmbare Trägermaterialien oder Verdünnungsmittel für die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen oder Arzneimittel kann man irgendwelche verträglichen nicht-toxischen Materialien einsetzen, die mit dem Wirkstoff 5-Trifluormethyl-2 ' -desoxycytidin vermischt werden können. Wenn die Zubereitung in einer¹für die parenterale Verabreichung, beispielsweise die intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung, geeigneten Form vorliegt, kann das Trägermaterial, das vorzugsweise ein wäßriges Vehikel ist, auch gewisse andere übliche Zusätze enthalten, wie ein Suspendiermittel, wie beispielsweise Methylcellulose oder Polyvinylpyrrolidin, und ein übliches oberflächenaktives Mittel. Für die orale Verabreichung kann man die Zubereitungen zu wäßrigen Lösungen, Suspensionen, Kapseln oder Tabletten verarbeiten, die geeignete Trägermaterialien oder Verdünnungsmittel, beispielsweise Laktose, Stärke und/oder Magnesiumstearat enthalten. In gewissen Fällen kann man eine gesteigerte Wirkung gegen Viren dadurch erreichen, daß man gleichzeitig Dimethylsulfoxid (DMSO) verabreicht, das auch ein Lösungsmittel für 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin darstellt.

Um die desaminierende Wirkung von Enzymen, wie Cytosindesaminase, zu inhibieren, wodurch eine Verminderung der antiviralen Wirkung verursacht wird, ist es erforderlich, bei der Behandlung von Viren gleichzeitig entweder zuvor oder gleichzeitig mit der Verabreichung von 5-TrifIuormethyl-2'-desoxycytidin^ ein die Desaminierung

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Case: PCR-121-GER TER MEER · MÖLLER · STEINMEISTER

inhibierendes Mittel, wie Tetrahydrouridin oder 2'-Desoxytetrahydrouridxn, zu geben. Somit enthalten die für die Bekämpfung von Viren eingesetzten pharmazeutischen Zubereitungen (als Hauptwirkstoff) eine pharmazeutisch wirksame Menge 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin neben einer inhibierenden Menge eines Cytidindesaminaseinhibitors, beispielsweise von Tetrahydrouridin oder 2¹-Desoxytetrahydrouridin. Im allgemeinen ist ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial oder Verdünnungsmittel der oben beschriebenen Art vorhanden, was jedoch von der Art der Zubereitung abhängt. Tetrahydrouridin und 2-Desoxytetrahydrouridin sind auch bei extrem hohen Konzentrationen für Menschen nicht toxisch. Weiterhin sind sie relativ stoffwechselstabil. Das Gewichtsverhältnis von Tetrahydrouridin oder 2'-Desoxytetrahydrouridxn zu der erfindungsgemäßen Verbindung 5-Trifluormethyl~2'-desoxycytidin kann 500:1 bis 1:1 betragen, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von etwa 20:1 bis etwa 5:1.

Zur Bestimmung der Toxizität von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin oder anderen Mitteln zur Bekämpfung von Viren gegenüber nicht-infizierten Zellen behandelt man getrennte Kulturen von Zellen von menschlichem Epidermoidlaryngeal-Karzinom (HEp-2) mit Nucleosidanalogen in variierenden Konzentrationen während 48 Stunden, wonach man die Zeilschicht (Monolayer) mit phosphatgepufferter Salzlösung wäscht, um irgendwelche restlichen analogen Verbindungen zu entfernen. Die Zellen werden dann mit Trypsin behandelt, um sie von den Kulturschalen abzu-

30 lösen und werden dann in verschiedenen Verdünnungen

erneut in Kulturen eingebracht. Nach 7 Tagen werden die Kulturen gefärbt und es werden Kolonien von 50 Zellen oder mehr als eine lebensfähige Zelle gezählt. Die Lebensfähigkeit, die einen geeigneten Parameter für die Toxizität darstellt, wird in dieser Weise durch Aus-

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breiten der Zellen bestimmt. Demzufolge wird die Toxizität als Zellenreplikation bzv7. Koloniebildung gemessen.

In der beigefügten Fig. 1 ist die Cytotoxizität von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin und von 5-Trifluorthymidin mit und ohne Tetrahydrouridin gegen HEp-2-ZeIlen dargestellt (siehe die Tabelle I bezüglich ähnlicher Werte für 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin). Es ist ohne weiteres die erhebliche Steigerung des Prozentsatzes der überlebenden Zellen in Gegenwart von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin und Tetrahydrouridin zu erkennen·-

Zur Verdeutlichung der Inhibierung der Virusreplikation werden HSV-Viren der Typen 1 oder 2 mit niedrigen Multiplizitäten während 2 Stunden bei 37⁰C an HEp-2-Zellen adsorbiert. Das die analogen Nucleosidverbindungen in variierenden Konzentrationen enthaltende Kulturmedium wird dann den infizierten Kulturen zugesetzt. Im Fall der HEp-2-Zellen,die einen hohen Desaminasegehalt aufweisen, wird dem Medium Tetrahydrouridin zugesetzt. Nach 48 Stunden wird das Virus durch Einfrieren und Auftauen aus den Kulturen gewonnen. Das aus jeder Kultur gewonnene Virus wird durch Plaquebestimmung in DHK-Zellen titriert. Unter Anwendung dieser Verfahrensweise kann man die antivirale Wirksamkeit von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin direkt mit der Wirksamkeit anderer Mittel zur Bekämpfung von Viren vergleichen. Weiterhin kann man durch Zusatz von Tetrahydrouridin zu dem Medium die Wirksamkeit von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin ohne Desaminierung am Nucleosidteil bestimmen.

Die beigefügte Fig. 2 verdeutlicht die Wirkung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin und von 5-Trifluorthymidin in Kombination mit Tetrahydrouridin oder nicht gegen Viren des Typs HSV-2. Die Ergebnisse lassen ohne weiteres er-

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kennen, daß die Verbindungen gleich wirksame Mittel zur Bekämpfung von Viren darstellen.

Eine Betrachtung der Tabelle II oder ein Vergleich mit der Fig. 1 läßt jedoch erkennen, daß 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin (plus Tetrahydrouridin) bei Konzentrationen, bei denen eine wirksame Aktivität gegen Viren vorliegt, sehr wenig cytotoxisch ist, während 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin (ohne Tetrahydrouridin) und 5-Trifluorthymidin (in Gegenwart oder in Abwesenheit von Tetrahydrouridin) bei Konzentrationen, in denen diese Verbindungen eine Wirkung gegen Viren ausüben, extrem cytotoxisch sind. Dies weist auf den hohen therapeutischen Index der Kombination aus 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin und Tetrahydrouridin hin.

Aus der Tabelle III ist zu erkennen, daß man beim Züchten von Zellen in Gegenwart von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin eine Steigerung der überlebensfähigkeit um den Faktor 5 dann erreichen kann, wenn man 2'~ Desoxytetrahydrouridin anstelle von Tetrahydrouridin verwendet, ohne daß hierdurch die Wirksamkeit der Wirkung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin gegen Viren

25 des Typs HSV-2 beeinträchtigt wird.

Die Fig. 3 verdeutlicht, die antivirale Wirkung von 5-Trif luormethy 1.-2' -desoxycytidin und 5-Trif luorthymidin in Gegenwart oder in Abwesenheit von Tetrahydrouridin gegen das Virus HSV-1. Es ist zu erkennen, daß 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin _ Tetrahydrouridin eine stärkere Wirkung gegen das Virus ausübt als 5-Trifluorthymidin * Tetrahydrouridin.

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Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in der Tabelle IV angegeben. 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin i Tetrahydrouridin stellt ein wirksames Mittel zur Bekämpfung von Viren bei Konzentrationen dar, bei denen nur eine vernachlässigbare bis mäßige Cytotoxizität zu erkennen ist.

Man kann Tiere, einschließlich Menschen, die an Krankheiten leiden, die von Herpesviren oder herpesartigen Viren verursacht sind, behandeln, indem man dem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge von 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin vorzugsweise in Gegenwart eines Desaminierungsinhibitors und gegebenenfalls, jedoch vorzugsweise, in Gegenwart eines·pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterials oder Verdünnungsmittels', verabreicht.

Zur Behandlung systemischer Infektionen wird das erfindungsgemäße 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin vorzugsweise durch intravenöse Injektion und gegebenenfalls auch durch orale Verabreichung gegeben. Zur Behandlung von topischen Infektionen wird 5-Trifluormethyl-2¹-desoxycytidin überwiegend topisch angewandt.

Es hat sich gezeigt, daß man besonders vorteilhafte Ergebnisse dann erzielt, wenn man dem Patienten während 7 Tagen etwa 0,01 mMol pro Kilogramm bis 0,25 mMol pro Kilogramm 5-Trifluormethyl-2·-desoxycytidin pro Tag verabreicht, was 3 bis 75 mg pro Kilogramm Körpergewicht entspricht, so daß man einem Mann mit einem Körpergewicht von 70 kg im Rahmen einer siebentägigen Behandlung bei einer täglichen Verabreichung von 10 mg/kg Körpergewicht 700 mg gibt. Diese projizierten Zahlenwerte ergeben sich aus Untersuchungen an der Maus, bei denen sich gezeigt hat, daß man ein Überleben von 60% dann erzielt, wenn man 250 mg 5-Trifluormethyl-

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2'-desoxycytidin pro Kilogramm Körpergewicht einmal täglich während 7 Tagen gibt, wenn man gleichzeitig 1 Stunde vor der Verabreichung von 5-Trifluormethyl-2* desoxycytidin Tetrahydrouridin gibt. Ein überleben von 100% erreicht man mit einer Dosis von 50 mg 5-Trifluormethyl-2 '-desoxycytidin pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag während 7 Tagen bei gleichzeitiger Verabreichung von Tetrahydrouridin. DEr LDj- -Wert für 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin (gleichzeitig mit Tetrahydrouridin gegeben) beträgt bei einer siebentägigen Behandlung 325 mg/kg/Tag.

Wenngleich die obigen Ausführungen auf 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin gerichtet sind, ist es jedoch ersiehtlieh, daß auch andere analoge Verbindungen, die die perfluorierte niedrigmolekulare Alkylgruppe oder niedrigmolekulare Alkenylgruppe in der 5-Stellung aufweisen, beispielsweise 5-Pentafluoräthyl-2'-desoxycytidin und 5-Trifluorvinyl-2'-desoxycytidin, eine entsprechende antivirale und chemotherapeutische Wirkung besitzen. Weiterhin kann 2¹,3'-Didesoxy-5-trifluormethyl-2'-desoxycytidin ein selektives Mittel zur Beendigung der DNA-Ketten in von Herpesviren infizierten Zellen darstellen und die Arabinoside 5-Trifluorthyminarabinosid und 5-Trifluormethylcytosinarabinosid können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin kann für diesen Anwendungszweck auch 2'-Az ido-5-tr if luormethyl-2'-desoxycytidin eingesetzt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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- 30 -

Beispiel 1

Herstellung von 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin.

Man sättigt eine Mischung aus 10 g (0,034 Mol) 5-Trifluormethyl-2¹-desoxyuridin, 100 g Hexamethyldisilazan und 0,01 g Ammoniumchlorid mit Ammoniak und erhitzt die Mischung in einer 500 ml-Fischer-Porter-Aerosolvorrichtung über Nacht auf 150°C. Man erhält eine hellbraune klare Lösung, die man während weiterer 24 Stunden erhitzt. Nach insgesamt 44 Stunden unterbricht man das Erhitzen und erhält eine klare braune. Lösung. Man zieht das Lösungsmittel im Teilvakuum unter Anwendung eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von etwa 50 bis 60⁰C ab. Man erhitzt den Rückstand während etwa 6 Stunden mit 150 ml zum Sieden am Rückfluß. Dann zieht man das Methanol unter Verwendung eines Rotationsverdampfers ab und erhält etwa 10 g eines Feststoffs, den man in 250 ml siedendem Wasser löst, filtriert und abkühlt, wobei man 2 g eines kristallinen Feststoffs erhält. Aus der Mutterlauge scheiden sich weitere Kristalle ab, die man isoliert und die mit den zuvor erhaltenen Kristallen identisch sind. Die vereinigten Kristalle werden in 30 ml Äthanol zum Sieden am Rückfluß erhitzt und ergeben die gewünschte Verbindung, 5-Trifluormethyl-2 '-desoxycytidin.

Elementaranalyse s	C	4	H	1	3	N
	,31	4	,46	1	4	,70
ber.: 40	,67		,06			,23
gef.s 40

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- 31 -

UV-Daten	= 282
/t (0,1 HCl) (max)	= 279
λ (0,1 NaOH) (max)
IR-Daten

ΐημ (E = 10 410)

πιμ (E = 10 280)

3200 (breit), 1650 (breit), 1160, 1100, 1060 cm

-1

10 15 20

30 35

Beispiel 2

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 unter Anwendung einer Mischung aus Hexamethyldisilazan und Trimethylsilylchlorid als Silylierungsmittel. In einem 100 ml-Autoklaven sättigt man eine Mischung aus 5 g 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin, 50 ml Hexamethyldisilazan und 0,2 ml Trimethylsilylchlorid bei Raumtemperatur mit 10 g Ammoniak. Es ergibt sich ein geringer Druck von 0,69 bis 1,38 bar (10 bis 20 psi). Man erhitzt die Mischung dann während etwa 48 Stunden auf etwa 165⁰C, wobei man einen Druck von etwa 13,8 bar (200 psi) verzeichnet. Dann öffnet man den Autoklaven und gießt die erhaltene Mischung in einen 50 ml-Kolben. Man zieht das Lösungsmittel im Vakuum ab und erhält eine braune viskose Flüssigkeit. Die Dünnschichtchromatographie unter Anwendung einer wäßrigen Lösung zeigt, daß lediglich eine Spur des Ausgangsmaterials vorhanden ist und daß der Hauptbestandteil der Mischung eine andersartige Verbindung ist. Die Mischung wird dann mit 200 ml siedendem Wasser extrahiert, mit Aktivkohle entfärbt und filtriert. Man zieht das Wasser im Vakuum unter Anwendung eines Rotationsverdampfers ab und erhält etwa 0,15 bis 0,2 g einer Verbindung, die aufgrund ihrer Analysenwerte mit der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Verbindung identisch ist.

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Beispiel 3

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 2, mit dem Unterschied, daß man die Reaktion in einem geschlossenen Rohr statt in einem Autoklaven durchführt. Man beschickt ein Fischer-Porter-Rohr mit einer Mischung aus 3,0 g 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin und 2,8 g Hexamethyldisilazan und sättigt die Mischung während etwa 30 Minuten mit Ammoniak. Es bildet sich ein Gel. Dann gibt man 0,2 ml Trimethylsilylchlorid zu der Mischung, verschließt

das Rohr und erhitzt es über Nacht auf 140°C, wobei sich ein Druck von 4,14 bar (60 psi) einstellt. Dann erhöht man die Temperatur auf 150⁰C, wodurch sich ein Druck von 5,51 bar (80 psi) ergibt. Man setzt das Erhitzen während weiterer 24 Stunden fort und erhält eine klare hellbraune Lösung und eine geringe Menge eines Feststoffs, der sich durch Sublimation an den kühleren Abschnitten des Rohres abgeschieden hat. Man kühlt das Rohr ab, wobei eine gewisse Menge des Feststoffs ausfällt. Man öffnet das Rohr und kühlt es, worauf man das Hexamethyldisilazan im Vakuum bei 50 bis 60°C abzieht und einen viskosen braunen Rückstand erhält. Man gibt 50 ml Methanol zu und erhitzt die Mischung während 6 Stunden auf 65 bis 70°C. Dann zieht man das Methanol im Vakuum ab und erhält einen braunen Feststoff, den man

in 200 ml heißen Wassers löst und filtriert. Das Filtrat wird mit Aktivkohle entfärbt, filtriert und zur Trockene eingedampft und ergibt 2,5 g eines Feststoffs. Diesen Feststoff löst man in siedendem Wasser, filtriert ihn und kühlt ihn ab, wobei man 0,1 g Kristalle erhält, die aufgrund der Analysenwerte mit der Verbindung der Beispiele 1 und 2 identisch sind„

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Beispiel 4

Man bildet eine wäßrige Lösung von 5-Trifluormethyl-2"-desoxycytidin durch Auflösen von etwa 0,2 g dieser Verbindung in 5 ml physiologisch reinem Wasser unter sterilen Bedingungen. Die für die Verabreichung durch Injektion geeignete Lösung wird dann in Ampullen abgeschmolzen und bis zur Verwendung aufbewahrt.

Beispiel 5

Man bildet eine für die topische Verabreichung geeignete Formulierung der Verbindung 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin durch übliches Verarbeiten von 0,4 g dieser Verbindung mit 1 g Lanolin als Trägermaterial unter Bildung einer Creme mit glatter Konsistenz, die auf die

15 Haut aufgetragen werden kann.

Beispiel 6

Man bringt eine Mischung aus 18 g 5-Trifluormethyl-2^r-

desoxyuridin, 200 ml Hexamethyldxsilazan und 1,5 ml 2O

Trimethylchlorsilan in einem Fischer-Porter-Kolben mit wasserfreiem Ammoniak auf einen Druck von 2,76 bar (40 psi). Dann erhitzt man die Mischung unter Rühren während 94 Stunden auf 65 bis 75°C, wobei sich ein Druck von 4,14 bis 4,83 bar (60 bis 70 psi) ergibt. Das über-

schüssige Ammoniak wird abgelassen, worauf man das überschüssige Hexamethyldxsilazan im Vakuum abzieht. Man versetzt den Rückstand mit Methanol und erhitzt die Mischung zur Rückflußtemperatur. Man zieht das Methanol im Vakuum ab und kristallisiert den festen Rückstand aus Wasser um, wobei man 7 g 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin erhält, das mit der Verbindung von Beispiel 1 identisch ist.

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Analyse:	C	72	4	H	1	4	N
ber.:	40,	67	4	,23	1	4	,36
gef.:	40,		,06		,23

Vergleichsbeispiel A

Man bringt eine Mischung aus 0,3 g 5-Trifluormethyluracil, 5 ml Hexamethyldisxlazan und 0,2 ml Trimethylchlorsilan in einem Fischer-Porter-Rohr mit wasserfreiem Ammoniak auf einen Druck von 1,25 bar (18 psi). Man erhitzt "die Mischung während 72 Stunden auf eine Temperatur von 160 bis 170°C, wobei sich ein Druck von 4,14 bar (60 psi) ergibt. Nach der Abtrennung des überschüssigen Hexamethyldisxlazans und der Hydrolyse des Reaktionsprodukts mit überschüssigem Methanol unter Rückfluß wird das Ausgangsmaterial (5-Trifluormethyluracil) zurückgewonnen. Auch das Dünnschichtchromatogramm läßt keinen Hinweis auf andere Produkte erkennen.

20

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O CO OO

cn c*> ο

Tabelle I
Cytotoxizität von 5-Trifluormethyl-2' -desoxycytidin gegen HEp-2-Zellen

	% des Überlebens	mit Tetrahydrouridin 0,003 0,03 0,3
Konzentration nffol	ohne Tetrahydrouridin 0,003 0,3 0,3	100 57 <0,3 93 15 <Ό,0005 53 25 0,001 61 31
Versuch 1 2 3 4	3 <0,3 <0,3 0,1 0,0005 <0,0005 0,1 0,0008 0,0007 0,6 0,02	77 32 <O,O1
Durchschnittswert %S	0,95 <0,01 <0,01

Konzentration von Tetrahydrouridin: 100 μg/ml bei den Versuchen 1 und 2

500 μg/ml bei den Versuchen 3 und 4

Tetrahydrouridin zeigt keinerlei cytotoxische Wirkung

%S = 100 χ

Anzahl der Zellen, die nach der Behandlung von behandelten Monoschichten mit Trypsin

Kolonien bilden können

Anzahl der Zellen, die nach der Behandlung mit Trypsin von unbehandelten Ifonoschichten Kolonien bilden können

co
cn

00
CO

2
m
m

ΠΙ

CO

j O

■ cn
ι (D

ο η

w ·

-^ c

M 3 -> Di I

ω α

"3

CO

1-3 K

*3

H H

Tabelle II

Antivirale Wirkung von 5-Trif luontiethyl-2' -desoxycytMin gegen HSV-2-Viren

	ohne	0,003	log..o der überlebenden Viren	0,3	mit Tetrahydrouridin	0,3
	-0,1	Tetrahydrouridin		0,003 0,03
Kbnssitration mftol	HD, 92	0,3	-3,7	-0 -3,0	-3,7
Versuch 1	-1,8	-3,1		-1,5 -3,7
2		-2,7		-1,9 <-4,1
3	-0,94 0,95	<-4,1	-3,7 <0,01	-3,7	-3,7 <0,01
4		-2,9		-1,7 -3,6 77 32
Durchschnittswert log10 S.Po % S (siehe Tabelle I)	-3,2 <0,01

Konzentration von Tetrahydrouridin: 100 μg/ml bei den Versuchen 1 und 2

500 μg/ml bei den Versuchen 3 und 4

TetraJiydroaridin zeigt keine antivirale Wirkung S.P. = log_1o der übsrlebenden Fraktion der plaquebildenden Einheiten

Anzahl der Plaqaen auf BHK-Zellitonoschichten nach dem Aufbringen des durch Gefrieren und Auftauen

von behandelten infizierten Monoschichten von HEp-2-Zellen erhaltenen Virus

Anzahl der Plaquen auf BHK-Zellmonoschichten nach dem Aufbringen des in der obigen Weise aus unbehandelten infizierten HEp-2-Monoschichten erhaltenen Virus

^1

U) CTi

OQ
Φ

ΓΠ 3)

m m

C=

21

m ω

η ^ ρ η cn SJ (D -

O C

cn

Tabelle III

OO Ca) CO

Cytotoxizität und antivirale Wirkung von 5-Trifluormethyl-2' -desoxycytidin in Gegenwart und in Abwesenheit von Tetrahydrouridin bzw. von 2'-Desoxytetxahydrouridxn

ohne Zugabe + Tetrahydrouridin

+ 2'-Desoxytetrahydrourxdin

% S der HEp-2-Zellen: 0,06 ItMDl	< 0,006	9Ϊ 3	50Ϊ 5
log10 S-F. HSV-2:
0,03 nrtfol	- 3,3	- 3,4	- 3,5 j

Konzentration von Tetrahydrouridin und von 2' -Desoxytetrahydrourxdin = 500 μg/Inl

U)

-J

m ' ζ

I m

'■ (S)

α ν ρ ο cn id (D >

na a ο η

ω α μ a

ro

09
Cs)
OP

TER wi£E

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- 38 -

ro

-^ H H H

cn
O

(U

r-1

co

vo

es
η

H (U
Λ
(O

rl

«ΐ¹

-d

aft

-ρ ο δ (!)

8-

SCN3

	cn δ)
	tn
CP
β ίχ«	β
θ	03
ω	O
O

ο?

log.

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Claims (1)

1. PATENTANS PRÜCHE

   1. 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin.

   2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzei-cr'h net, daß man 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin, dessen freie Hydroxylgruppen man mit einer Schutzgruppe geschützt hat, bei einer Temperatur von etwa 50°C bis etwa 25O⁰C mit Ammoniak umsetzt.

   10

   20

   25

   30

   Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als geschütztes 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin ein silyliertes 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin einsetzt.

   Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e kennz eichnet, daß man ein silyliertes 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin einsetzt, das man durch Umsetzen von 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin mit einer mindestens stöchiometrischen Menge eines Silylierungsmittels, wie
   a) ein Silan der allgemeinen Formel

   (RM₃SiX

   worin R¹ für eine niedrigmolekulare Alkylgruppe und X für ein Halogenatom stehen, und/oder b) ein Disilazan der allgemeinen Formel

   worin R¹ für eine niedrigmolekulare Alkylgruppe steht,

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   bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Reaktionsmischung gebildet hat.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e kennzeichnet, daß man ein unter Verwendung von Hexamethyldisilazan, Trimethylsilylchlorid und/oder einer Mischung davon als
   Silylierungsmittel silyliertes 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin einsetzt.

   10

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e kennz eichnet, daß man ein mit Hilfe von Hexamethyldisilazan silyliertes 5-Trifluormethyl-2'-desoxyuridin einsetzt.

   15

   7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 60 bis etwa 80⁰C
   durchführt.

   20

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e kennz eichnet, daß man die Umsetzung
   während mindestens 10 Stunden bewirkt.

   9. Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von
   Herpes-Vieren oder herpesartigen Viren,
   dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 und eine inhibierende Menge eines Cytidindesaminaseinhibitors enthält.

   10. Zubereitung nach Anspruch 9, dadurch

   gekennzeichnet, daß sie 5-Trifluormethyl-2 ·-desoxycytidin in einer Menge von etwa 0,01 bis 50 Gew.-% enthält.

   909839/0630

   PCR, INC. und UNIVERSITY OP MIAMI

   Case: PCR-121-GER TER MEER - MÜLLER ■ STEINMEISTER

   11. Zubereitung nach Anspruch 9,dadurch gekennzeichnet, daß sie als Cytidindesaminaseinhibitor Tetrahydrouridin und/oder

   2'-Desoxytetrahydrouridin enthält.

   12. Zubereitung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Cytidindesaminaseinhibitor und 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidin in einer Menge von etwa 5CX): 1 bis etwa

   10 1:1 enthält.

   13. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennz eichnet, daß sie in einer für die Verabreichung auf peritonealem Wege ge-

   15 eigneten Form vorliegt.

   14. Zubereitung nach Anspruch 13, dadurch gekennzei chnet, daß sie 5-Trifluormethyl-2 '-desoxycytidin in einer Menge von etwa

   20 O,O5 bis 5 Gew.-% enthält.

   15. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer für die Verabreichung auf topischem Wege geeig-

   25 neten Form vorliegt.

   16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie 5-Trifluormet.hyl-2' -desoxycytidin in einer Menge von etwa

   30 5 bis 50 Gew.-% enthält.

   17. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer für die Verabreichung auf oralem Wege geeigneten Form

   35 vorliegt.

   909839/0630

   PCR, INC. und UNIVERSITY OF MIAMI TER MEER · MÖLLER ■ STEINMEISTER Case: PCR-1 21 -GER

   2338644

   18. Zubereitung nach Anspruch 17, dadurch

   gekennz eichnet, daß sie 5-Trifluormethyl-2'-desoxycytidxn in einer Menge von etwa 0,05 bis 10 Gew.-% enthält.

   909839/0630