DE2836560A1 - Antivirales mittel und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

• Antivirales Mittel und Verfahren
• zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein l-Amino-2,4-äthanobicyclo-F3,3,i] nonan oder ein Salz desselben als aktiven Bestandteil sowie gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthaltendes antivirales Mittel.
• Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß ?-Amino-2,4-äthanobicyclol,3,1~ nonanhydrochlorid (im folgenden als Verbindung A bezeichnet),)bei dem es sich um das Chlorwasserstoffsäuresalz des 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1]nonans handelt, eine sehr starke antivirale Aktivität gegen Herpes- und Influenzaviren entfaltet.
• Es ist bekannt, daß die sog. "Käfig-Verbindungen", z.B.
• Amantadin, oftmals eine Anti-RNA-Virusaktivität entfalten.
• "Käfig-Verbindungen" mit antiviraler Aktivität gegen DNA-Viren sind nicht bekannt. Die Verbindung A vereinigt in sich eine antivirale Aktivität gegen das zu den RNA-Viren gehörende Influenza-Virus und eine sehr starke antivirale Aktivität gegen das zu den DNA-Viren gehörende Herpes-Virus. Folglich stellt also die Verbindung A ein sehr wirksames antivirales Mittel dar.
• +) (bezüglich der Herstellung und Wirksamkeit der Verbindung A vgl. offengelegte japanische Patentanmeldung 50150/1978).
• Verbindungen der angegebenen Art ohne 1-Aminogruppe lassen sich beispielsweise nach dem von Takaishi und Mitarbeitern in "J. Chem. Soc. Perkin Transaction t" Band 19, Seite 789 (1975) beschriebenen Verfahren herstellen.
• Im folgenden wird über die Ergebnisse von Untersuchungen hinsichtlich der antiviralen Wirksamkeit, der wirksamen Dosis und der Toxizität der Verbindung A berichtet.
• Versuch 1: Wirksamkeit der Verbindung A auf das Wachstum von Herpes-Virus in Gewebekulturen Die antivirale Aktivität wird nach der Röhrchen-Verdünnungsmethode ermittelt. Für den Versuch werden HeLa-Zellen und KB-Zellen verwendet. Die HeLa-Zellen werden im YLE-Medium, die KB-Zellen im Eagle-MEM-Medium gezüchtet. Das Medium wird mit 10 % fötalem Kalbsserum angereichert. Die in dem Röhrchen gewachsene einzige Zellenschicht wird in frisches Medium, das mit 2 % fötalem Kalbsserum angereichert ist, überführt, worauf 1000 TCD50 Herpes-Simplex-Type 1 (HF-Stamm) und die zu untersuchende Verbindung zugegeben werden.
• Nach 72 stündiger Inkubation bei 370C werden der virusinduzierte zytopathische Effekt (CPE) und die Zytotoxizität der Verbindung durch mikroskopische Untersuchungen ermittelt.
• In der folgenden Tabelle I finden sich Angaben über die geringste, ein Viruswachstum inhibierende Konzentration (MIC) und die geringste zytotoxische Konzentration (MCC).
• Tabelle I Einfluß der Verbindung A auf das Wachstum von Herpes-Simplex-Virus

  Tests-erbindung Wirt- MIC MCC

  zellen (pg/ml) (g/ml)

  Verbindung A HeLa 2,5 100

  KB 2,5 100

  Amantadin- HeLa 50 > 50

  hydrochlorid KB 50 > 50

  Versuch 2: Therapeutische Wirksamkeit der Verbindung A auf eine Versuchszwecken dienende Herpes-Virus-Infektion.
• Die therapeutische Wirksamkeit wird anhand zweier Versuchsinfektionen ermittelt: 1. Wirksamkeit auf Herpeskeratitis Nach Applikation von 2 % Kokain in die Augen eines mit Barbital betäubten Kaninchens wird das Korneaepithel beider Augen angekratzt und mit Herpes-Simplex-Virus Type 1 (HF-Stamm) infiziert.
• Eines der infizierten Augen wird mit der Verbindung A behandelt, das andere dient zur Kontrolle der Virusinfektion.
• In das mit der Verbindung A zu behandelnde Auge wird 7 Tage lang fünfmal pro Tag, beginnend 12 h nach der Virusinfektion, eine 0,5 %ige Augenlotion der Verbindung A in 1,4 % Vinylalkohol geträufelt.
• Jedes Auge wird 7 Tage lang täglich untersucht, wobei die jeweilige krankhafte Veränderung der Konjunktiva, Kornea und der Iris bewertet wird. Eine entsprechende Untersuchung erfolgt vor der ersten Behandlung. Die verschiedenen Beobachtungen werden aufgezeichnet.
• In einem Parallelversuch werden beide Augen eines Kaninchens in gleicher Weise angekratzt, jedoch nicht mit dem Virus infiziert. Eines der Augen wird in entsprechender Weise mit der Verbindung A, das andere zur Toxizitätskontrolle mit 1,4 % Polyvinylalkohol behandelt.
• In der graphischen Darstellung der beigefügten Figur bedeuten die Zahlen auf der Abszisse die Tage nach der viralen Infektion, die Zahlen auf der Ordinate die Bewertung "O" (normal) bis "4" (maximale Schädigung).
• Die Kurve 1 entspricht dem Versuch mit einer 0,5 W der Verbindung A enthaltenden Augenlotion, die Kurve 2 entspricht einem Vergleichsversuch.
• Die 0,5 %-ige Augenlotion der Verbindung A verlängert im Vergleich zu der Probe zur Toxizitätsermittlung die Heilungsdauer nicht, d.h. die Verbindung A ist nicht toxisch.
• 2. Wirkung auf Herpesencephalitis Mäuse werden mit Äther betäubt und danach intrazerebral (i.c.) mit 30 LD50 Herpes-Simplex-Virus Type 1 (HF-Stamm) infiziert. Die infizierten Mäuse werden nach verschiedenen therapeutischen Schemata behandelt. Die antivirale Wirksamkeit der Verbindung A wird durch Vergleichen der Anzahl an Uberlebenden in der dritten Woche nach der Virusinfektion und die mittlere Anzahl Uberlebenstage ermittelt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle II. Tabelle II Wirksamkeit der Verbindung A bei Herpesencephalitis

  a) b) c) d)

  Dosis Verabreichungs- mitllere Anzahl der Überlebensverhältnis,

  (mg/kg) weg Überlebenstage Anzahl der Überlebenden/

  Gesamtzahl der Versuchs-

  tiere (Mäuse)

  Verbin- 5 i.c 8,3 6/10

  dung A 0 5,7 0/10

  Verbin- 100 p.o. 7,7 4/10

  dung A 0 5,5 0/10

  Verbin- 100 s.c. 7,6 5/10

  dung A 0 5,7 0/10

  Verbin- 10 i.v. 8,1 4/10

  dung A 0 5,8 0/10

  a) Verabreichungsdosis b) Das Verabreichungsschema bei jedem Verabreichungsweg ist folgendes: i.c. (intrazerebral): einmalige Verabreichung gleichzeitig mit der Virusinfektion p.o. (per os): zweimalige Verabreichung pro Tag während 8,5 Tagen, beginnend 4 h nach der Virusinfektion s.c. (subkutan): zweimalige Verabreichung pro Tag während 8,5 Tagen, beginnend 4 h nach der Virusinfektion i.v. (intravenös): einmalige Verabreichung, beginnend 3 h nach der Virusinfektion c) Die Versuchstiere werden nach der Infektion 21 Tage lang beobachtet, wobei die mittlere Überlebensdauer ermittelt wird.
• d) Uberlebensverhältnis am 21. Tag nach der Virusinfektion Versuch 3: Akute Toxizität der Verbindung A bei Mäusen Die akute Toxizität der Verbindung A bei Mäusen wird in üblicher Weise bestimmt. Dabei erhält man die in Tabelle III angegebenen Ergebnisse. Bei diesem Versuch wird als Vergleichsverbindung das zu denselben "Käfig-Verbindungen" gehörende Amantadinhydrochlorid verwendet.
• Tabelle III Akute Toxizität der Verbindung A bei Mäusen

  Testverbindung LD50 (mg/kg)

  p.o. i.v.

  Verbindung A 320 58

  Amantadinhydrochlorid 480 86

  Versuch 4: Einfluß der Verbindung A auf eine Versuchs zwecken dienende Influenza-Virus-Infektion Die antivirale Aktivität wird nach der von Tani und Mitarbeitern in "Fukuoka Igaku Zasshi" Band 58, Seite 9 (1967) beschriebenen Horsfall-Methode bestimmt.
• Vorbereitung der zu testenden Verbindung: Die Verbindung A sowie Amantadinhydrochlorid als Vergleichssubstanz werden in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung zu Injektionszwecken gelöst.
• Versuchstiere: männliche ddy-Mäuse eines Gewichts von etwa 12 g, und zwar jeweils 10 pro Versuch Virus: Influenza-Virus AoPR/8 Bewertung der zu testenden Verbindungen: 5 LD50 Influenza-Virus AoPR/8 werdern nach der Aerosol-Methode zum Infizieren von Mäusen verwendet. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Verbindung A und von Amantadinhydrochlorid wird 3 h vor bzw. 2, 6, 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138 bzw. 150 h nach der Infektion mit einer subkutanen Arzneimittelbehandlung" in verschiedenen Dosen begonnen.
• Sieben Tage nach der Infektion wird nach Tötung der Versuchstiere der jeweilige Grad der Lungenschädigung bzw. der krankhaften Veränderung der Lunge ermittelt. Auch dann, wenn die Versuchstiere innerhalb von 7 Tagen nach Infektion eingehen, wird die Lungenschädigung bzw. die krankhafte Veränderung der Lunge geprüft.
• Es werden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle IV

  Versuch verabreichte Bewertung der Lungen-

  Nr. Dosis schädigung

  (mg/kg)

  1 O 4,8

  2 AmantadinHCL (10 mg/kg) 4,3 *

  3 Amantadin-HCL (25 mg/kg) 4,1 *

  4 Amantadin-HCL (50 mg/kg) 4,0 *

  5 Verbindung A (7,5 mg/kg) 4,4

  6 Verbindung A (15 mg/kg) 4,2 *

  7 Verbindung A (30 mg/kg) 4,0 *

  (*): p kleiner 0,05 (Wahrscheinlichkeitswert) Wie bereits erwähnt, zeigt die erfindungsgemäß verwendete Verbindung eine sehr starke antivirale Aktivität, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro. Sie läßt sich folglich zur Behandlung von an Herpes-Virus-Erkrankungen, beispielsweise Herpeskeratitis, Herpesencephalitis und Herpeslabialis leidenden Menschen und an Influenza-Infektionen leidenden Menschen verwenden. Geeignete pharmazeutische Zubereitungsformen sind Salben, Augenlotionen, Injektionslösungen, Tabletten und dgl.
• Die zur Behandlung von Erwachsenen erforderliche Dosis an der Verbindung A ist je nach dem Verabreichungsweg verschieden. Bei Verwendung in einer Augenlotion oder Salbe, die pro Tag mehrmals verabreicht wird, empfiehlt sich eine Konzentration (an der Verbindung A) von 0,1 bis 1, vorzugsweise von 0,2 %. Bei oraler oder subkutaner Verabreichung werden 50 bis 1000, vorzugsweise 200 mg pro Tag als Gesamtdosis empfohlen. Bei intravenöser Verabreichung eignen sich 10 bis 5Q, vorzugsweise 10 mg pro Tag.
• Die Verbindung A läßt sich in einer dem Apothekter oder Arzneimittelchemiker geläufigen Weise in Augenlotions, Salben, Injektionslösungen, oral verabreichbare Arzneimittel und dgl. überführen.
• Im folgenden werden noch pharmazeutische Zubereitungsformen bzw. Arzneimittel aus bzw. mit der Verbindung A angegeben: Beispiel 1 (Augenlotion) In einen 1000 ml fassenden Zylinder mit einem Bodenstopfen werden 800 ml destilliertes Wasser, 5 ml ß-Phenyläthanol und 5 g Verbindung A gefüllt. Nachdem die Lösung durch Zugabe von Natriumchlorid isotonisch gemacht worden ist, wird die Lösung mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und dann durch einen Baumwollpfropfen filtriert. Die Substanzen werden aseptisch behandelt.
• Beispiel 2 (Salbe) Die Verbindung A wird mit einer geringen Menge flüssigen Paraffins verrieben, worauf soviel Vaseline zugegeben wird, daß eine 0,5 %-ige Salbe erhalten wird. Die Substanzen werden aseptisch behandelt.
• Beispiel 3 (oral zu verabreichendes Mittel) 1. 1-Amino-2,4-äthanobicyclot3,3,linonanhydrochlorid 100 mg 2. Sacharose 88 mg 3. Kaolin 150 mg 4. Kartoffelstärke 20 mg 5. Magnesiumstearat 5 mg Zu einem Gemisch der Bestandteile 1, 2 und 3 wird die Kartoffelstärke in Form einer 10 %-igen Stärkepaste zugegeben, worauf das Ganze granuliert wird. Die erhaltenen Körnchen werden durch ein Sieb Nr. 60 (B.S.) gesiebt und auf konstantes Gewicht getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Körnchen durch ein Sieb Nr. 16 (B.S.) gesiebt und zur Herstellung fei fließender Körnchen mit dem Magnesiumstearat gemischt. Das Ganze wird dann mittels eines 11,11 mm-Stempels zu 100 mg Tabletten verpreßt. Die Tabletten können, falls erforderlich, in üblicher Weise mit einem leicht löslichen filmbildenden Überzug versehen werden.
• Beispiel 4 (Injektionslösung) 10 mg sterilen 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1]nonahydrochlorids werden aseptisch in eine Phiole gefüllt. Diese wird dann zur Verhinderung eines Feuchtigkeitszutritts und einer mikrobiellen Verunreinigung zugeschmolzen. Vor Gebrauch wird der Phioleninhalt mit 2 ml einer 5 %-igen injizierbaren Glucoselösung gemischt.
• Beispiel 5 (Injektionslösung) 100 mg sterilen 1-Amino-2,4-thanobicycloS3,3,1]nonanhydrochlorids werden aseptisch in eine Phiole gefüllt.
• Diese wird dann zur Verhinderung eines Feuchtigkeitszutritts und einer mikrobiellen Verunreinigung zugeschweißt.
• Vor Gebrauch wird der Phioleninhalt mit 2 ml einer 0,9 %-igen physiologischen Kochsalzlösung gemischt.

Claims (3)

1. Patentansprüche 0 Antiviral wirksames Arzneimittel zur Behandlung oder Verhinderung von durch Herpes- oder Influenzaviren verursachten infektiösen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer pharmakologisch wirksamen Menge l-Amino-2,4-äthanobicyclol3,3,lnonan oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben besteht oder eine pharmakologisch wirksame Menge 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1] nonan oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben sowie gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
2. 2. Verwendung pharmakologisch wirksamer Mengen von 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1]nonan oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes (als antivirales Mittel) zur Behandlung bzw. Bekämpfung oder Verhinderung von durch Herpes- oder Influenzaviren verursachten infektiösen Erkrankungen.
3. 3. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[,3,3,1]nonan oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz desselben mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vermischt.