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Antivirales Mittel und Verfahren
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zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein l-Amino-2,4-äthanobicyclo-F3,3,i]
nonan oder ein Salz desselben als aktiven Bestandteil sowie gegebenenfalls einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger enthaltendes antivirales Mittel.
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Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß ?-Amino-2,4-äthanobicyclol,3,1~
nonanhydrochlorid (im folgenden als Verbindung A bezeichnet),)bei dem es sich um
das Chlorwasserstoffsäuresalz des 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1]nonans handelt,
eine sehr starke antivirale Aktivität gegen Herpes- und Influenzaviren entfaltet.
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Es ist bekannt, daß die sog. "Käfig-Verbindungen", z.B.
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Amantadin, oftmals eine Anti-RNA-Virusaktivität entfalten.
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"Käfig-Verbindungen" mit antiviraler Aktivität gegen DNA-Viren sind
nicht bekannt. Die Verbindung A vereinigt in sich eine antivirale Aktivität gegen
das zu den RNA-Viren gehörende Influenza-Virus und eine sehr starke antivirale Aktivität
gegen das zu den DNA-Viren gehörende Herpes-Virus. Folglich stellt also die Verbindung
A ein sehr wirksames antivirales Mittel dar.
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+) (bezüglich der Herstellung und Wirksamkeit der Verbindung A vgl.
offengelegte japanische Patentanmeldung 50150/1978).
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Verbindungen der angegebenen Art ohne 1-Aminogruppe lassen sich beispielsweise
nach dem von Takaishi und Mitarbeitern in "J. Chem. Soc. Perkin Transaction t" Band
19, Seite 789 (1975) beschriebenen Verfahren herstellen.
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Im folgenden wird über die Ergebnisse von Untersuchungen hinsichtlich
der antiviralen Wirksamkeit, der wirksamen Dosis und der Toxizität der Verbindung
A berichtet.
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Versuch 1: Wirksamkeit der Verbindung A auf das Wachstum von Herpes-Virus
in Gewebekulturen Die antivirale Aktivität wird nach der Röhrchen-Verdünnungsmethode
ermittelt. Für den Versuch werden HeLa-Zellen und KB-Zellen verwendet. Die HeLa-Zellen
werden im YLE-Medium, die KB-Zellen im Eagle-MEM-Medium gezüchtet. Das Medium wird
mit 10 % fötalem Kalbsserum angereichert. Die in dem Röhrchen gewachsene einzige
Zellenschicht wird in frisches Medium, das mit 2 % fötalem Kalbsserum angereichert
ist, überführt, worauf 1000 TCD50 Herpes-Simplex-Type 1 (HF-Stamm) und die zu untersuchende
Verbindung zugegeben werden.
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Nach 72 stündiger Inkubation bei 370C werden der virusinduzierte zytopathische
Effekt (CPE) und die Zytotoxizität der Verbindung durch mikroskopische Untersuchungen
ermittelt.
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In der folgenden Tabelle I finden sich Angaben über die geringste,
ein Viruswachstum inhibierende Konzentration
(MIC) und die geringste
zytotoxische Konzentration (MCC).
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Tabelle I Einfluß der Verbindung A auf das Wachstum von Herpes-Simplex-Virus
| Tests-erbindung Wirt- MIC MCC |
| zellen (pg/ml) (g/ml) |
| Verbindung A HeLa 2,5 100 |
| KB 2,5 100 |
| Amantadin- HeLa 50 > 50 |
| hydrochlorid KB 50 > 50 |
Versuch 2: Therapeutische Wirksamkeit der Verbindung A auf eine Versuchszwecken
dienende Herpes-Virus-Infektion.
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Die therapeutische Wirksamkeit wird anhand zweier Versuchsinfektionen
ermittelt: 1. Wirksamkeit auf Herpeskeratitis Nach Applikation von 2 % Kokain in
die Augen eines mit Barbital betäubten Kaninchens wird das Korneaepithel beider
Augen angekratzt und mit Herpes-Simplex-Virus Type 1 (HF-Stamm) infiziert.
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Eines der infizierten Augen wird mit der Verbindung A behandelt,
das
andere dient zur Kontrolle der Virusinfektion.
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In das mit der Verbindung A zu behandelnde Auge wird 7 Tage lang fünfmal
pro Tag, beginnend 12 h nach der Virusinfektion, eine 0,5 %ige Augenlotion der Verbindung
A in 1,4 % Vinylalkohol geträufelt.
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Jedes Auge wird 7 Tage lang täglich untersucht, wobei die jeweilige
krankhafte Veränderung der Konjunktiva, Kornea und der Iris bewertet wird. Eine
entsprechende Untersuchung erfolgt vor der ersten Behandlung. Die verschiedenen
Beobachtungen werden aufgezeichnet.
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In einem Parallelversuch werden beide Augen eines Kaninchens in gleicher
Weise angekratzt, jedoch nicht mit dem Virus infiziert. Eines der Augen wird in
entsprechender Weise mit der Verbindung A, das andere zur Toxizitätskontrolle mit
1,4 % Polyvinylalkohol behandelt.
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In der graphischen Darstellung der beigefügten Figur bedeuten die
Zahlen auf der Abszisse die Tage nach der viralen Infektion, die Zahlen auf der
Ordinate die Bewertung "O" (normal) bis "4" (maximale Schädigung).
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Die Kurve 1 entspricht dem Versuch mit einer 0,5 W der Verbindung
A enthaltenden Augenlotion, die Kurve 2 entspricht einem Vergleichsversuch.
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Die 0,5 %-ige Augenlotion der Verbindung A verlängert im Vergleich
zu der Probe zur Toxizitätsermittlung die Heilungsdauer nicht, d.h. die Verbindung
A ist nicht toxisch.
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2. Wirkung auf Herpesencephalitis Mäuse werden mit Äther betäubt und
danach intrazerebral (i.c.) mit 30 LD50 Herpes-Simplex-Virus Type 1 (HF-Stamm) infiziert.
Die infizierten Mäuse werden nach verschiedenen therapeutischen Schemata behandelt.
Die antivirale Wirksamkeit der Verbindung A wird durch Vergleichen der Anzahl an
Uberlebenden in der dritten Woche nach der Virusinfektion und die mittlere Anzahl
Uberlebenstage ermittelt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle II.
Tabelle
II Wirksamkeit der Verbindung A bei Herpesencephalitis
| a) b) c) d) |
| Dosis Verabreichungs- mitllere Anzahl der Überlebensverhältnis, |
| (mg/kg) weg Überlebenstage Anzahl der Überlebenden/ |
| Gesamtzahl der Versuchs- |
| tiere (Mäuse) |
| Verbin- 5 i.c 8,3 6/10 |
| dung A 0 5,7 0/10 |
| Verbin- 100 p.o. 7,7 4/10 |
| dung A 0 5,5 0/10 |
| Verbin- 100 s.c. 7,6 5/10 |
| dung A 0 5,7 0/10 |
| Verbin- 10 i.v. 8,1 4/10 |
| dung A 0 5,8 0/10 |
a) Verabreichungsdosis b) Das Verabreichungsschema bei jedem Verabreichungsweg
ist folgendes: i.c. (intrazerebral): einmalige Verabreichung gleichzeitig mit der
Virusinfektion p.o. (per os): zweimalige Verabreichung pro Tag während 8,5 Tagen,
beginnend 4 h nach der Virusinfektion s.c. (subkutan): zweimalige Verabreichung
pro Tag während 8,5 Tagen, beginnend 4 h nach der Virusinfektion i.v. (intravenös):
einmalige Verabreichung, beginnend 3 h nach der Virusinfektion c) Die Versuchstiere
werden nach der Infektion 21 Tage lang beobachtet, wobei die mittlere Überlebensdauer
ermittelt wird.
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d) Uberlebensverhältnis am 21. Tag nach der Virusinfektion Versuch
3: Akute Toxizität der Verbindung A bei Mäusen Die akute Toxizität der Verbindung
A bei Mäusen wird in üblicher Weise bestimmt. Dabei erhält man die in Tabelle III
angegebenen Ergebnisse. Bei diesem Versuch wird als Vergleichsverbindung das zu
denselben "Käfig-Verbindungen" gehörende Amantadinhydrochlorid verwendet.
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Tabelle III Akute Toxizität der Verbindung A bei Mäusen
| Testverbindung LD50 (mg/kg) |
| p.o. i.v. |
| Verbindung A 320 58 |
| Amantadinhydrochlorid 480 86 |
Versuch 4: Einfluß der Verbindung A auf eine Versuchs zwecken
dienende Influenza-Virus-Infektion Die antivirale Aktivität wird nach der von Tani
und Mitarbeitern in "Fukuoka Igaku Zasshi" Band 58, Seite 9 (1967) beschriebenen
Horsfall-Methode bestimmt.
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Vorbereitung der zu testenden Verbindung: Die Verbindung A sowie Amantadinhydrochlorid
als Vergleichssubstanz werden in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung zu
Injektionszwecken gelöst.
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Versuchstiere: männliche ddy-Mäuse eines Gewichts von etwa 12 g, und
zwar jeweils 10 pro Versuch Virus: Influenza-Virus AoPR/8 Bewertung der zu testenden
Verbindungen: 5 LD50 Influenza-Virus AoPR/8 werdern nach der Aerosol-Methode zum
Infizieren von Mäusen verwendet. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Verbindung A
und von Amantadinhydrochlorid wird 3 h vor bzw. 2, 6, 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90,
102, 114, 126, 138 bzw. 150 h nach der Infektion mit einer subkutanen Arzneimittelbehandlung"
in verschiedenen Dosen begonnen.
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Sieben Tage nach der Infektion wird nach Tötung der Versuchstiere
der jeweilige Grad der Lungenschädigung bzw. der krankhaften Veränderung der Lunge
ermittelt. Auch dann, wenn die Versuchstiere innerhalb von 7 Tagen nach Infektion
eingehen, wird die Lungenschädigung bzw. die krankhafte Veränderung der Lunge geprüft.
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Es werden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle IV
| Versuch verabreichte Bewertung der Lungen- |
| Nr. Dosis schädigung |
| (mg/kg) |
| 1 O 4,8 |
| 2 AmantadinHCL (10 mg/kg) 4,3 * |
| 3 Amantadin-HCL (25 mg/kg) 4,1 * |
| 4 Amantadin-HCL (50 mg/kg) 4,0 * |
| 5 Verbindung A (7,5 mg/kg) 4,4 |
| 6 Verbindung A (15 mg/kg) 4,2 * |
| 7 Verbindung A (30 mg/kg) 4,0 * |
(*): p kleiner 0,05 (Wahrscheinlichkeitswert) Wie bereits erwähnt, zeigt die erfindungsgemäß
verwendete Verbindung eine sehr starke antivirale Aktivität, und zwar sowohl in
vivo als auch in vitro. Sie läßt sich folglich zur Behandlung von an Herpes-Virus-Erkrankungen,
beispielsweise Herpeskeratitis, Herpesencephalitis und Herpeslabialis leidenden
Menschen und an Influenza-Infektionen leidenden Menschen verwenden. Geeignete pharmazeutische
Zubereitungsformen sind Salben, Augenlotionen, Injektionslösungen, Tabletten und
dgl.
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Die zur Behandlung von Erwachsenen erforderliche Dosis an der Verbindung
A ist je nach dem Verabreichungsweg verschieden. Bei Verwendung in einer Augenlotion
oder Salbe, die pro Tag mehrmals verabreicht wird, empfiehlt sich eine Konzentration
(an
der Verbindung A) von 0,1 bis 1, vorzugsweise von 0,2 %. Bei oraler oder subkutaner
Verabreichung werden 50 bis 1000, vorzugsweise 200 mg pro Tag als Gesamtdosis empfohlen.
Bei intravenöser Verabreichung eignen sich 10 bis 5Q, vorzugsweise 10 mg pro Tag.
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Die Verbindung A läßt sich in einer dem Apothekter oder Arzneimittelchemiker
geläufigen Weise in Augenlotions, Salben, Injektionslösungen, oral verabreichbare
Arzneimittel und dgl. überführen.
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Im folgenden werden noch pharmazeutische Zubereitungsformen bzw. Arzneimittel
aus bzw. mit der Verbindung A angegeben: Beispiel 1 (Augenlotion) In einen 1000
ml fassenden Zylinder mit einem Bodenstopfen werden 800 ml destilliertes Wasser,
5 ml ß-Phenyläthanol und 5 g Verbindung A gefüllt. Nachdem die Lösung durch Zugabe
von Natriumchlorid isotonisch gemacht worden ist, wird die Lösung mit destilliertem
Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und dann durch einen Baumwollpfropfen filtriert. Die
Substanzen werden aseptisch behandelt.
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Beispiel 2 (Salbe) Die Verbindung A wird mit einer geringen Menge
flüssigen Paraffins verrieben, worauf soviel Vaseline zugegeben wird, daß eine 0,5
%-ige Salbe erhalten wird. Die Substanzen werden aseptisch behandelt.
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Beispiel 3 (oral zu verabreichendes Mittel) 1. 1-Amino-2,4-äthanobicyclot3,3,linonanhydrochlorid
100 mg 2. Sacharose 88 mg 3. Kaolin 150 mg 4. Kartoffelstärke 20 mg 5. Magnesiumstearat
5 mg Zu einem Gemisch der Bestandteile 1, 2 und 3 wird die Kartoffelstärke in Form
einer 10 %-igen Stärkepaste zugegeben, worauf das Ganze granuliert wird. Die erhaltenen
Körnchen werden durch ein Sieb Nr. 60 (B.S.) gesiebt und auf konstantes Gewicht
getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Körnchen durch ein Sieb Nr. 16 (B.S.) gesiebt
und zur Herstellung fei fließender Körnchen mit dem Magnesiumstearat gemischt. Das
Ganze wird dann mittels eines 11,11 mm-Stempels zu 100 mg Tabletten verpreßt. Die
Tabletten können, falls erforderlich, in üblicher Weise mit einem leicht löslichen
filmbildenden Überzug versehen werden.
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Beispiel 4 (Injektionslösung) 10 mg sterilen 1-Amino-2,4-äthanobicyclo[3,3,1]nonahydrochlorids
werden aseptisch in eine Phiole gefüllt. Diese wird dann zur Verhinderung eines
Feuchtigkeitszutritts und einer mikrobiellen Verunreinigung zugeschmolzen. Vor Gebrauch
wird der Phioleninhalt mit 2 ml einer 5 %-igen injizierbaren Glucoselösung gemischt.
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Beispiel 5 (Injektionslösung) 100 mg sterilen 1-Amino-2,4-thanobicycloS3,3,1]nonanhydrochlorids
werden aseptisch in eine Phiole gefüllt.
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Diese wird dann zur Verhinderung eines Feuchtigkeitszutritts und einer
mikrobiellen Verunreinigung zugeschweißt.
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Vor Gebrauch wird der Phioleninhalt mit 2 ml einer 0,9 %-igen physiologischen
Kochsalzlösung gemischt.