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Verwendung von Dichlormethan-diphosphonatverbindungen bei
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der Bekämpfung von Collagen-Erkrankungen und zur Wundheilung.
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Vorliegende Erfindung betrifft die in den Ansprüchen wiedergegebenen
Gegenstände.
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Erfindungsgemäß werden Dichlormethan-diphosphonatverbindungen (im
folgenden abgekürzt als Cl2MDP bezeichnet) zur erwünschten Beeinflussung der Collagen-Biosynthese
in der Human- und Vereinärmedizin verwendet.
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Aus der Fachliteratur geht hervor, daß viele Krankheitszustände das
Collagen und die Biosynthese des Collagens beeinflussen. In dem einführenden Teil
von "Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 86, Art. Nr. 4, Seiten 875
-1132, mit dem Titel "Connective Tissue and Diseases of Connective Tissus", 1960,
werden Erkrankungen u.a. des Bindegewebes, einschließlich der Faserbildung und Wundheilung
unter dem Begriff "Collagen-Erkrankungen" zusammengefaßt. Beispiele für Collagen-Erkrankungen
sind die rheumatoide Arthritis (Wirbeisäuleverstellfung) usteoarthrltls, Aflyio
-sponeylltlsA, rheumatisches Fieber, systemischer Lupus usw.
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Erfindungsgemäß werden zur Behandlung von Collagen-Krankheiten Dichlormethan-diphosphonatverbindungen
verwendet.
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In der Fachliteratur wird berichtet, daß verschiedene Phosphonatverbindungen
bei der Behandlung von einer anomalen
Mobilisierung und Ablagerung
von Calciumphosphatsalzen (Knochenmineralien) beim Menschen und anderen Lebewesen
brauchbar sind (vgl. US-PSn 3 678 164, 3 662 o66, 3 553 314, 3 553 315, 3 584 124,
3 584 325 und 3 641 246 sowie DE-PAn 2360-798 und 2343-146; ferner BE-PS 822-929.
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Gemäß der US-PS 3 683 080 ist die Verbindung C12MDP eines der Phosphonatmat
erialien, welche zur Verwendung bei der Behandlung einer anomalen Calcifizierung
im Zusammenhang mit Weichgeweben und arthritischen Zuständen offenbart wird.
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Im Gegensatz zu den bisherigen Offenbarungen der Verwendung verschiedener
Phosphonatmaterialien zur Verhütung der Bildung anomaler, calcifizierter Mineralablagerungen
in Knochen, Gelenken und Weichgeweben liegt vorliegender Erfindung die überraschende
Entdeckung zugrunde, daß Cl2MDP auf einzigartige Weise die Biosynthese von Collagen
wesentlich beeinflußt.
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ErfindungsgemäR wird eine sichere und wirksame Menge einer pharmazeutisch
brauchbaren Dichlormethan-diphosphonatverbindung der im folgenden näher beschriebenen
Art zur Behandlung von Collagen-Krankheiten bei Menschen und niederen Lebewesen
verwendet.
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Hierdurch werden Krankheitszustände, bei denen Abnormalitäten oder
ein progressiver Verfall des normalen Collagenspiegels des Körpers auftreten, z.B.
bei Gelenken, zwischen Wirbeln und dergleichen, wirksam behandelt. Überdies wird
die Wundheilung durch die ClMDP-Verbindungen in wünschenswerter Weise erhöht, wobei
der Begriff "Wundheilung" vom Gattungsbegriff Collagen-Krankheit umfaßt wird.
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Zur Behandlung von Collagen-Krankheiten beim Menschen und bei niederen
Lebewesen, welche eine derartige Behandlung benötigen, wird eine pharmazeutisch
brauchbare Dichlormethandiphosphonatverbindung in einer sicheren und wirksamen Menge
verwendet.
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Hierbei wird unter "eine sichere und wirksame Menge einer CltIDP-\rerbindung"
eine solche Menge verstanden, welche in erwünschter Weise die Biosynthese von Collagen
beeinflußt und steigert, und zwar bei einem vernünftigen Verhältnis von Vorteil
zu Risiko, welch'letzteres mit jedem Heilverfahren verbunden ist. Innerhalb des
Spielraums einer vernünftigen ärztlichen Beurteilung schwankt die Dosierung an Cl2MDP
in Abhängigkeit von dem besonderen zu behandelnden Zustand, der Ernsthaftigkeit
desselben, der Behandlungsdauer, der speziellen verwendeten Cl2MDP-Verbindung und
von ähnlichen, im folgenden näher erörterten Erwägungen.
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Unter "pharmazeutisch brauchbar" wird im vorliegenden verstanden,
daß die Cl2MDP-Verbindung des Arzneimittels und andere in den Zusammensetzungen
verwendete Bestandteile zur Anwendung in Berührung mit den menschlichen und tierischen
Geweben ohne unzulässige Toxizität, Reizung oder allergische Reaktion, entsprechend
einem vernünftigen Verhältnis von Vorteil zu Risiko, geeignet sind.
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Eine geeignete Verabreichung der Cl2r4DP-Verbindungen umfaßt die systemische
Anwendung, wie z.B. durch Injektion (insbesondere parenterale Injektion), intravenöse
Infusion, die Anwendung von Suppositorien und per os, ebenso wie die topische Anwendung
der Verbindungen an der befallenen Stelle.
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Unter 11topische Anwendung wird ein direktes Aufbringen oder Verteilen
der C12MDP-Verbindungen und -zusammensetzungen auf
das Epidermisgewebe
(einschließlich die äußere Haut und Mund-, Zahnfleisch- sowie Nasalgewebe) verstanden.
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Unter befallene Stelle" wird im vorliegenden einelokalisierte Fläche,
welche die Collagen-Biosynthese eingeht, insbesondere eine Wunde und die unmittelbar
umgebende Fläche, verstanden.
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Unter dem Begriff " enthaltend" bzw. umfasend1, wird im vorliegenden
verstanden, daß verschiedene andere, verträgliche Arzneimittel und Medikamente sowie
inerte Bestandteile gleichzeitig bei der Anwendung gemäß der Erfindung verwendet
werden können, solange die kritischen Cl2MDP-Verbindungen in der offenbarten Weise
verwendet werden.
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Unter "verträglich" wird im vorliegenden verstanden, daß die Komponenten
der Zusammensetzungen, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, miteinander
vermischt werden können3 ohne daß sie untereinander auf eine Weise in Wechselwirkung
treten, die die Wirksamkeit der Cl2MDP-Zusammensetzungen unter üblichen Anwendungssituationen
wesentlich herabsetzt.
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sind Im folgenden! alle Prozentangaben, wenn nicht anders angegeben
auf das Gewicht bezogen.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Cl2MDP-Verbindungen besitzen die allgemeine
Formel
worin M ein Wasserstoffatom, ein pharmazeutisch brauchbares Kation,
wie z.B. ein Alkalimetall, insbesondere Na oder K, oder eine Alkyl- oder Arylgruppe
bedeutet, wie z.B. die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Phenylgruppe.
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Die Dichlormethan-diphosphonate können auf die in "Organic Phosphorus
Compounds", Bd. 7, Kosolapoff und Maier, 1976, Seite 258 (vgl. Literaturangaben)
hergestellt werden. Im allgemeinen umfaßt die Reaktionsfolge zur Herstellung der
Cl2MDP-Verbindungen eine Arbuzov-artige Umlagerung von Dibrommethan mit Triisopropyl-phosphit,
gefolgt von einer Chlorierung und einem Ansäuern zur Herstellung des Cl2MDP in Form
der freien Säure. Die Säureform kann mit einer beliebigen gewünschten (pharmazeutisch
brauchbaren) Base neutralisiert oder verestert werden, um die erfindungsgemäß verwendeten
Cl2MDP-Verbindungen zu liefern.
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Nachfolgende Experimente zeigen die völlig unerwartete Brauchbarkeit
von Cl2MDP zur erwünschten Beeinflussung der Biosynthese von Collagen. In diesen
wird unter dem Begriff "NXRI" ein angeborener (inbred) Stamm von Mäusen verstanden,
welcher von dem MRC Laboratory-Animal Centre, Arshalton, Surrey, England erhalten
wurde; unter dem Begriff "SDS" wird Natriumdodecylsulfat, unter "ßAPN" ß-Aminopropionitril,
und unter "EHDP" Dinatriumethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonat verstanden, während die
Bedeutungen aller anderen Begriffe und Abkürzungen definiert werden oder aus dem
Text heraus verständlich sind.
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Materialien und Methoden A) Organkultur 1 Tag alte NMRI-Mäuse oder
Wistar-Ratten (aufgezogen in unserem Institut) wurden täglich mit EHDP oder Cl2MDP
in Konzentrationen von 1 und 10 mg Phosphor/kg Körpergewicht injiziert. Die beiden
Diphosphonate wurden in normaler Kochsalzlösung gelöst und subkutan verabreicht.
Die Kontrolltiere erhielten äquivalente Volumina Kochsalzlösung. Die Körpergewichte
wurden jeden Tag vor den Injektionen ermittelt.
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Die Tiere wurden ad libitum mit Laborfutter (Handelsprodukt Altromin;
Schweiz) gefüttert. Nach 8 Tagen wurden die Mäuse oder Ratten durch Köpfen getötet,
wonach die Schädeldecken und Tibiae herausgeschnitten und unmittelbar in ein "Minimum
Essential Medium (Gibco) gebracht wurden, bis. alle Explantate präpariert waren.
Die Gewebe wurden sodann dreimal mit FEM gewaschen, wonach neues Medium zugegeben
wurde (4 ml/ 10 Explantate), welches 3Prolin mit 50 pCi/ml,100 pg/ml Ascorbinsäure,
10 % Kälberfötusserum und 1 mMol ß-Aminopropionitril, jedoch keine Diphosphonate,
enthielt. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37 0C und in einer Gasatmosphäre aus 5
% C02 und 95 % Luft wurden die Explantate aus den Medium entnommen und dreimal mit
5 ml kaltem entionisiertem Wasser, welches 1 mg/ml kaltes Prolin enthielt, gewaschen.
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Isolierung von Collagen Die gewaschenen Knochen wurden sorgfältig
von Facia und anhaftenden Zellen und Zelltrümmern gesäubert. Im Falle der Tibiae
wurden die Knorpelköpfe von den Schäften abgetrennt, und das Knochenmark wurde unter
Verwendung einer Spritze, welche mit einer feinen Injektionsnadel versehen war,
entfernt. Die Tibiae-Köpfe von diesen 9 Tage alten Tieren waren noch nicht mineralisiert
und stellten reinen Knorpel dar.
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Ab diesem Punkt wurden die 3 Gewebe - Schädeldach (lamellarer Knochen),
Tibia (kortikaler Knochen) und Tibia-Köpfe (Epiphysenknorpel) - getrennt verarbeitet.
Alle 3 Gewebe wurden sodann unter flüssigem Stickstoff pulverisiert, und die erhaltenen
Knochen- und Knorpelpulver wurden gefriergetrocknet, bis ein stabiles Trockengewicht
erhalten wurde.
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Gleiche Teile der getrockneten Pulver wurden in Sn nHC1 18 Stunden
bei 180 C h-fdrolysiert, und es wurden Hydroxyprolin-und Calciumbestimmungen durchgeführt,
um den Collagengehalt und den Mineralisierungsgrad der Ausgangsmaterialien zu ermitteln.
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Essigsäureextraktion Die Hauptteile der Gewebepulver wurden sodann
48 Stunden bei 400 einer Behandlung mit 0,5 m Essigsäure (10 mg/ml) unterworfen,
durch die die Proben wirksam entmineralisiert wurden, und das säurelösliche Collagen
extrahiert wurde. Der Extrakt und die essigsäureunlöslichen Rückstände wurden durch
entrifugieren (bei 10.000 x g) getrennt. Der Uberstand wurde sodann in 2 EIälften
geteilt, von denen 1 Teil zur Bestimmung der Collagenmenge, welche durch Essigsäure
gelöst worden war, benutzt, während der andere Teil zur Bestimmung der Radioaktivität,
welche in neusynthetisiertes Collagen eingebaut worden war, weiter verarbeitet.
Der Solubilisierungsgrad des Collagens wurde nach Hydrolyse des undialysierten Säureextraktes
in 6n HOl ermittelt7 und eine nachfolgende Hydroxyprolinbestimmung erfolgte gemäß
einer modifizierten Methode nach Stegemann mit einer automatischen Analysenvorrichtung
(Technicon-analyser). Zur Ermittlung des Einbaus von 3K-Prolin in das Collagenmolekül
wurde der Essigsäure-Extrakt intensiv gegen 0,5 m und 0,1 m Essigsäure zur Entfernung
von freien, verunreinigenden 3H-Prolin-Aktivitäten dialysiert.
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Um eine quantitative Gewinnung von radioaktivem Collagens
welches
an den Wänden der Dialysenrohre haften kann, zu gewährleisten, wurde kaltes säurelösliches
Ratten- oder Mäusehautcollagen in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Die
Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Scintillations-Zählers (Packard TriCarb-scintillation
counter) ermittelt.
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Pepsinextraktion Die Rückstände von der Essigsäure-Extraktionsstufe
wurden mit Pepsin, das in 0,5 m Essigsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst
war, behandelt. Die Extraktion wurde 24 Stunden bei 40C durehgeführt. Der Extrakt
und der Rückstand wurden abermals durch Zentrifugieren getrennt. Wie es beim Essigsäure-Extrakt
der Fall war, wurde der überstand in 2 Hälften geteilt, von denen eine zur Ermittlung
des Solubilisierungsgrädes von Collagen durch Pepsin hydrolysiert wurde; die andere
Hälfte wurde einer intensiven Dialyse unterworfen.
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Jedoch wurde, bevor die Dialyse begonnen wurde, der pH-Wert des Pepsinextrakts
mit 1 m Natronlauge auf 7,6 eingestellt, um das Pepsin zu inaktivieren, und es wurde
neutrales salzlösliches Ratten- oder Mäusehautcllagen zugegeben. Die Dialyse wurde
gegen 1 m NaCl- 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,6 durchgeführt.
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Bestimmung von Hydroxyprolin Nach Hydrolyse des saure und pepsinlöslichen
Collagens und nach Abdampfen der HCl wurden die Proben in 0,1 m Citratpuffer vom
pH-Wert 2,9 gelöst und auf eine mit Dowex 50w-8X gepackte Kolonne der Abmessungen
0,8 x 25 cm gebracht. Die Trennung der hydroxylierten von der nicht-hydroxylierten
Aminosäure wurde durch Elution der Kolonne mit dem Puffer, in welchem die Proben
gelöst waren, erreicht.
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Bestimmung der Kettenzusammensetzung des Collagens Die Identifizierung
der Kettenzusammensetzung von Knochen-(Typ I) und Knorpel- (Typ II)Collagen wurde
durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) nach Guenther et alwerreicht.
Kurz gesagt, die radioaktiv markierten Collagenproben wurden auf 5 %ige Gele aufgebracht,
welche mit 100 Mol Tris-Boratpuffer vom pH-Wert 8,6, welcher 0,1 % SDS enthielt,
hergestellt worden waren. Nach Abschluß des Versuchs, welcher mit durch Fluram#-markiertem
Collagen überwacht wurde, wurden die Gele mit einer Gelscheibenschneidvorrichtung,
die durch Benya et al'beschrieben wurde, in Scheiben von 1 mm geschnitten. Die Gelscheiben
wurden in Scintillationsampullen, die 0,5 ml einer 3 eigen H202-Lösung enthielten,
gebracht. Die Ampullen.wurden sodann in einen Trockenofen gebracht und dort 2 Stunden
bei 600C gehalten.
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Die Scheiben wurden unter Verwendung eines Scintillationsgemischs
ausgezählt, welches 10 % Triton X-100 enthielt, um die 0,5 ml Wasserstoffperoxid
unterzubringen (accomodate).
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Calciumbestimmung Die in den ursprünglichen Geweben enthaltene Calciummenge
wurde mit einem Calciumanalysengerät (Corning Calcium Analyser 940) ermittelt, nachdem
das Gewebepulver hydrolysiert worden war.
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B) Zellkultur Isolierung von Schädeldachzellen Frisch präparierte
Schädeldächer von 2 bis 3 Tage alten Wistar-Ratten wurden von der schleimigen Zellschicht
gereinigt und sodann in tEM gebracht, welches 227 mg/l NaHC03> Antibiotika, und
3 mg/ml Collagenase enthielt. Die Explantate
wurden 2 Stunden in
einem Wasserbad bei 370C geschüttelt.
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Die erhaltene Suspension wurde sodann mit frischem MEM verdünnt und
verschiedene Male in eine sterile Pasteur-Pipette aus dieser ein- und/herausgesaugt,
um das Gewebe und die Zellklumpen aufzubrechen. Die-Suspension wurde sodann in sterile
Teströhrchen übergeführt, wo man größere Gewebestücke absetzen ließ. Die oberen
8-Zehntel der Suspension wurden sodann entnommen und 7 Minuten bei 350 x g zentrifugiert.
Die Pellets wurden in MEM wieder suspendiert, und die Abtrennung von großen Teilchen
wurde wiederholt. Das letze Zellpellet wurde sodann in MEM, welches 2,2 g/l NaHC03,
10 % Kälberfötusserum und Antibiotika enthielt, suspendiert und sodann mit einer
Dichte von 1,5 x 105 Zellen/Schale in Schalen ausgebreitet (plated). Die Zellen
wurden bei 370C in 5 % C02 inkubiert.
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Sobald die Zellen an der Schale anhafteten, wurde das alte Medium
abgezogen und durch neues Medium, welches 0»5 m Diphosphonat enthielt, ersetzt,
Das Medium wurde jeden 3. Tag gewechselt. Am 7. oder 8. Tag erreichten die Zellen
Konfluenz; es wurde sodann frisches Medium mit einem Gehalt an 0,25 mMol EHDP oder
Cl2MDP, 30 FCi 3H-Prolin, 100 rg Vitamin C und 1 mMol ßAPN zugegeben. Nach 18 Stunden
Inkubationszeit wurden die Zellschichten trypsinisiert.
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Mit der erhaltenen Zellsuspension wurde zunächst eine Zellzählung
durchgeführt; sodann wurden die Zellen zentrifugiert.
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Der Überstand wurde zur Collogenbestimmung und auch zur Ermittlung
des Einbaus von 3H-Prolin verwendet. Das angewandte Verfahren ist im Kapitel "Isolierung
von Collagen" beschrieben.
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Die Zellpellets wurden in einer ausgewogenen (balanced) Salzlösung
wieder suspendiert. Eine Hälfte wurde zur Bestimmung von DNA verwendet; die andere
Hälfte wurde zur Bestimmung von intrazellularem, neusynthetisiertem Collagen benutzt.
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Isolierung von Ohrenknorpelzellen Die Isolierung von Ohrenchondrocyten
und die Untersuchung der Collagensynthese mit Kaninchenohrenknorpel wurde auf die
gleiche Weise durchgeführt, wie bei der Untersuchung der Schädeldachknochenzellen.
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Ermebn sse Organkultur Die im vorliegenden erhaltenen Ergebnisse stammen
lediglich von Ratten. Jedoch sind diese Daten solchen, die mit Mäusen erhalten werden,
sehr adequat. Ferner wurden die in den Tabellen I bis V zusammengefaßten Ergebnisse
mit lediglich einer Diphosphonatkonzentration, nämlich einer solchen von 10 mg P/kg
Körpergewicht, erhalten. Konzentrationen von 1 mg P/kg ergaben keine signifikanten
Wirkungen im Vergleich zu den Versuchstieren der Kontrollgruppe, zumindest nicht
während einer 8-tägigen Behandlung mit EHDP oder Cl2MDP.
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Die Werte in Tabelle I zeigen die Collagen- und Calciumgehalte der
Ausgangsgewebeproben, ausgedrückt in mg/g Gewebe.
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Wie erwartet, zeigten die mit EHDP behandelten Tiere eine verminderte
Calciummenge innerhalb des Knochengewebes, was somit eine Erniedrigung der Mineralisierung
anzeigt. Die mit Cl2MDP behandelten Versuchstiere zeigten einen mit den Kontrolltieren
vergleichbaren Mineralisierungsgrad. Ferner kann ersehen werden, daß der Collagengehalt
sowohl der mit EHDP als auch der mit Cl2MDP behandelten Gewebe höhere Collagenwerte
aufweist , wenn man den niedrigeren Mineralgehalt berücksichtigt, wie es bei EHDP
der Fall ist.
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Die aufeinanderfolgende Collagenextraktion (vgl. Tabelle II) unter
Verwendung von Essigsäure bzw. pepsinhaltiger Essigsäure, zeigte interessante Ergebnisse.
Aus den Experimenten ergibt sich, daß EHDP die Gesamtextrahierbarkeit von Knochen-
Collagen
nicht verändert; dies war jedoch nicht der Fall bei den mit Cl2MDP hehandelten Versuchstieren,
wo die Löslichkeit von Knochen-Collagen drastisch erhöht war. Das Knorpel-Collagen
wich in dieser Hinsicht ab; es zeigte einen geringen bis überhaupt keinen Effekt
mit Cl2MDP, jedoch einen Abfall bei der Extraktion mit EHDP.
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Der Einbau von 3H-Prolin in Knochen- und Knorpel-Collagen von isolierten
Explantaten aus der Kultur zeigte Unterschiede bei den mit Diphosphonat behandelten
Ratten gegenüber den Kontrollen. Wie sich aus Tabelle III ergibt, wird das mit dem
Isotop markierte Prolin in Knochen-Collagen in einem viel größeren Ausmaß von den
mit EHDP behandelten Tieren aufgenommen und eingebaut, als es bei den Kontrolltieren
der Fall war. Mit Cl2MDP wurde eine bemerkenswerte Erhöhung des 3H-Prolineinbaus
beobachtet. Was das Knorpel-Collagen betrifft, so fördert EHDP den Einbau von 3H-Prolin
in einem geringen Ausmaß, während mit Cl2MDP eine Vergrößerung von annähernd 700
% errechnet wurde.
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Zellkultur Tabelle TV zeigt den Einbau von 3H-Prolin in Collagen durch
isolierte Knochen- und Knorpelzellen in der Kultur. Wie es in der Organkultur evident
war, ist auch hier der Einfluß von Cl2MDP derart, daß ein Anstieg der Radioaktivität
von isoliertem Collagen gefunden wurde. Wie aus Tabelle IVa zu ersehen ist, wurde
ein dreifacher Anstieg bei der Synthese von Collagen aus Ohrenknorpelchondrocyten
gemessen. Schließlich war bei beiden Diphosphonaten keine Veränderung im Hydroxylierungsgrad
von Prolin zu sehen. Wie sich aus Tabelle V ergibt, liegen alle Werte der Verhältnisse
von Hydroxyprolin zu Prolin innerhalb des normalen Bereichs.
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Die Kettenzusammensetzung von Knochencollagen, welches aus 2α1
- und 1 α2-Ketten [α1(I)]2α2 bestand, sowie von Knorpelcollagen
mit der Kettenzusammensetzung [α1(II)]x wurde nicht verändert (vgl. Tabelle
V). Die Werte für die Kettenzusammensetzung wurden mit Mäusegeweben erhalten, welche
keinen Unterschied zu Rattengeweben zeigten.
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Tabelle I Collagen- und Calciumgehalt von gezüchteten Rattenexplantaten
vor der Demineralisierung und Extraktion Collagen (mg/g) Calcium (mg/g) Kontrolle
Schädeldach 186,5 # 3,31 232,69 # 3,53 Tibia 122,21 # 11,15 182,27 # 8,12 Knorpel
156,70 # 3,36 26,17 + 1,11 EHDP, 10 mg P Schädeldach 326,3 # 5,99 107,35 # 4,32
Tibia 276,8 + 5,71 103,31 # 7,83 Knorpel 249,4 # 15,71 7,57 # 2,39 C12MDP, 10 mg
P Schädeldach 216,5 # 7,23 204,20 # 6,17 Tibia 115,7 + 2,72 - 208?50 # 5,19 Knorpel
241,0 # 14,76 16,99 # 1,99 Durchschnitt + SD Anzahl von Experimenten: 3; 8 bis 9
Tiere/Experiment
Tabelle II Aufeinanderfolgende Collgenextraktion
(Ratten) Essigsäure Pepsin Gesamtextraktion % #% (mg/g Collagen) (mg/g Collagen)
(mg/g Collagen) Extrakt. auf Gehalt Kontrolle Schädeldach 7,15 # 0,97* 55,00 # 4,12
62,15 6,22 100 Tibia 10,71 1,23 60,26 3,77 70,97 7,10 100 Knorpel 2,99 0,83 72,90
6,19 75,89 7,59 100 EHDP, 10 mg P Schädeldach 1,41 0,09 64,60 3,98 66,01 6,60 100
Tibia 4,82 0,75 67,28 5,57 72,10 7,21 100 Knorpel 0,97 0,17 26,84 7,11 27,81 2,78
36,3 Cl2MDP, 10 mg P Schädeldach 16,29 2,17 116,88 6,11 133,17 13,32 214,1 Tibia
11,58 2,01 107,39 6,39 118,97 11,89 167,7 Knorpel 17,23 3,11 44,34 7,32 61,57 6,16
81,1 * S.D.
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Anzahl von Experimenten: 3; 8 bis 9 Tiere/Experiment
Tabelle
III Einbau von ³H-Prolin Organische Gesamte Zählim- CMP/mg+ Einbau (%) Matrix+ pulse
pro Min. organische Matrix (mg gesamt) (CMP), eingebaut Kontrolle Schädeldach 86,06
8,68 x 105 10,01 x 10³ # 1,20 100 Tibia 91,11 3,25 x 105 3,57 x 10³ # 0,51 100 Knorpel
85,60 1,23 x 105 1,44 x 10³ # 0,40 100 EHDP, 10 mg P Schädeldach 70,14 4,18 x 105
5,96 x 10³ # 0,89 59,54 # 5,31 Tibia 73,11 1,92 x 105 2,62 x 10³ # 0,35 82,07 #
6,01 Knorpel 62,19 1,08 x 105 1,74 x 10³ # 0,10 120,83 # 3,17 Cl2MDP, 10 mg P Schädeldach
72,50 17,01 x 105 23,46 x 10³ # 3,17 234,37 # 9,77 Tibia 71,63 3,79 x 105 5,29 x
10³ # 0,95 148,18 # 11,13 Knorpel 73,17 8,33 x 105 11,38 x 10³ # 2,91 790,27 # 89,90
Durchschnitt # SD + Stellt die organische Matrix von Explantaten dar, die mit ³H-Prolin
gezüchtet wurden.
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Anzahl von Experimenten: 3; 8 bis 9 Tiere/Experiment
Tabelle
IV Zellkuturaufnahme von ³H-Prolin in Collagen+ Gesamte Zählimpulse pro Min., DNA
(µg) CMP/µg DNA eingebaut (CMP) Kaninchen-Ohrenknorpelzellen Kontrolle 14,41 x 104
11,1 12,9 x 10³ EHDP 0,25 mM 21,36 x 104 13,1 16,3 x 10³ Cl2 MDP 0,25 mM 163,14
x 104 11,4 143,1 x 10³ Gesamte Zählimpulse pro Min., Anzahl der Zellen CMP/106 Zellen
eingebaut (CMP) in Mill.
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Isolierte Rattenschädeldachzellen Kontrolle 4,86 x 106 9,96 4,88 x
105 EHDP 0,25 mM 4,69 x 106 10,72 5,83 x 105 Cl2 MDP 0,25 mM 6,26 x 106 3,64 12,89
x 105 + Angegebene Zählimpulse für nicht-dialysierbares, vermutlich in Collagen
eingebautes ³H-Prolin
Tabelle IVa+ Einbau von ³H-Prolin bei der
Colagensynthese durch Kanischen-Ohrenknorpel-Chondrocyten CMP/10 µg DNA µg synth.
Coll./10µg DNA Sp. Aktivität von synth. Collagen Kontrolle 12,9 x 104 2,837 4,54
x 104 EHDP 0,25 mM 16,3 x 104 3,992 4,08 x 104 Cl2MDP 0,25 143,1 x 104 7,561 18,92
x 104 mM + Vorläufige, lediglich in 2 Experimenten erhalene Werte.
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Tabelle V Hydoxylierung von Prolin zu Hydroxyprolin Schädeldach Tibia
Knorpel Kontrolle 0,77*) 0,76 0,73 EHDP 0,77 0,76 0,67 Cl2MDP 0,76 0,77 0,75 *)
Verhältnis Hydroxyprolin/Prolin Verhältnisse einzelner Ketten Typ I Typ I Typ II
Schädeldach Tibia Knorpel Kontrolle 2,15: 1*) 1,96: 1 8: 1 EHDP 2,34: 1 1,94: 1
10: 1 Cl2MDP 1,91: 1 2,39: 1 11,5: 1 *) Verhältnis α1/ α2 Collagene
von Mäusegeweben
Innerhalb des Bereichs einer vernünftigen medizinischen
Beurteilung schwankt die Dosierung an C122tDP in Abhängigkeit von dem speziellen
zu behandelnden Zustand, der Ernsthaftigkeit des Zustands, der Behandlungsdauer
und ähnlichen Faktoren innerhalb der speziellen Kenntnis des behandelnden Arztes.
Typischerweise können jedoch Einzeldosen im Bereich von 0,01 bis 500 mg pro kg Körpergewicht,
vorzugsweise von 0,5 bis 50 mg/kg liegen, (wenn nicht anders angegeben, bezieht
sich im vorliegenden die Einheit "mg/kg" auf mg pro kg Körpergewicht). Die höheren
Dosierungen innerhalb dieses Bereiches sind gewöhnlich im Falle einer oralen Verabreichung
erwünscht, weil eine etwas begrenzte Absorption des C12MDP durch den Darm stattfindet.
Routinemäßig können bis zu 4 Dosierungen pro Tag gegeben werden, jedoch kann dies
je nach den Bedürfnissen des Patienten in Übereinstimmung mit einem vernünftigen
Verhältnis von Vorteil zu Risiko schwanken.
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Dosierungen von mehr als etwa 500 mg/kg können zu ungünstigen Symptomen
führen und werden in der Regel vermieden; überdies sind Tagesdosierungen von mehr
als etwa 2000 mg/kg gewöhnlich nicht zur Hervorrufung des gewünschten Vorteils erforderlich;
sie können vielmehr toxische Nebenwirkungen hervorbringen.
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Auch hier sind wieder Schwankungen hinsichtlich der Reaktion von Patient
zu Patient zu erwarten. So geringe Dosierungen wie etwa 0,01 mg/kg sind brauchbar,
insbesondere bei einer intravenösen Verabreichung.
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Wenn das Cl2MDP oral verabreicht wird, werden Dosierungen im Bereich
von -= etwa 10 bis etwa 100 mg/kg bevorzugt.
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Bei einer parenteralen Verabreichung (subkutan, intraperitoneal und
intramuskulär) betragen die Dosierungen von C12MDP vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa
20 mg/kg/Tag. Bei einer parenteralen Dauerinfusion (intravenös) liegt die am meisten
bevorzugte
Dosierung im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 mg/kgl Tag.
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Zwecks oraler Verabreichung kann das Cl2MDP als Kapseln, Tabletten
oder Granalien formuliert werden. Zur Behandlung von Lebewesen außer Menschen wird
das Cl2MDP vorzugsweise in das Tierfutter, Futterergänzungen oder Futterkonzentrate
eingearbeitet. Das C12MDP kann auch in Dosierungseinheitsform zusammen mit einem
pharmazeutischen Träger zubereitet werden, wobei jede Dosierungseinheitsform etwa
15 bis 10 g C12!MDP enthält. Der bevorzugte Konzentrationsbereich von C12MDP in
Dosierungseinheitsformen für Menschen und kleinere Haustiere beträgt 15 bis 1000
mg, insbesondere 100 bis 500 mg. Ein höherer Konzentrationsbereich, d.h. 1 g bis
5 gt wird in Dosierungseinheitsformen bevorzugt, welche zur Behandlung von größeren
Tieren, wie z.B. Rinder und Pferde, vorgesehen sind.
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Im vorliegenden wird unter dem Begriff 'pharmazeutischer Träger" ein
fester oder flüssiger Füllstoff, Verdünnungsmittel oder Einkapselungsstoff verstanden.
Beispiele für Stoffe, welche als pharmazeutische Träger dienen können, sind Zucker,
wie z.B. Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie z.B. Mais- und Kartoffelstärke;
Cellulose und deren Derivate, wie Natrium z.B./ Carboxymethylcellulose, Ethylcellulose
und Celluloseacetat; pulverisiertes Tragant; Malz; Gelatine; Talg; Stearinsäure;
Magnesiumstearat; Calciumsulfat; Pflanzenöle, wie z.B. Erdnußöl, Baumwollsamenöl,
Sesamöl, Olivenöl Maisöl und Kakaobutter; Polyole, wie z.B.
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Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol;
Agar; Alginsäure; destilliertes Wasser zur Injektion; isotonische Kochsalzlösung;
Phosphatpufferlösungen sowie andere nicht toxische verträgliche Stoffe, welche bei
pharmazeutischen
Formulierungen verwendet werden. Es können auch Benetzungsmittel und Gleitmittel,
wie z.B. Natriumlaurylsulfat, sowie Färbemittelß Geschmacksstoffe und Konservierungsstoffe
vorliegen. Das Tablettieren wird unter Anwendung herkömmlicher Verfahren vorgenommen.
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Der zusammen mit dem C12MDP verwendete pharmazeutische Träger wird
in einer Konzentration angewandt, welche ausreicht, ein praktisches Verhältnis von
Größe zu Dosierung zu liefern.
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Vorzugsweise umfaßt der pharmazeutische Träger etwa 0>1 bis 99
Gew.-% der Gesamtzusammensetzung.
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Tierfutterzusammensetzungen, welchen das Gl2MDP zugesetzt werden kann,
umfassen in der Regel als Futterstoffe eine cellulosische Streufutterkomponente.,
wie z.B. Heu, Stroh, Pflanzenhülsen, Maiskolben und dergleichen. Proteinhaltige
Komponenten, wie z.B. ganze Körner, einschließlich Mais, Weizen, Gerste, Hafer,
Roggen, Hirse und Alfalfa, sind typischerweise darin enthalten.
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Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel 1 Gelatinekapseln werden nach herkömmlichen Verfahren wie
folgt hergestellt: Bestandteil mg pro Kapsel Cl2MDP+) 350,00 Stärke 50,00 Gemisch
von Di- und Trinatriumsalzen
Die obigen Kapseln erhöhen bei einer
Verabreichung von zweimal täglich die Collagen-Biosynthese bei Patienten, welche
eine derartige Behandlung benötigen, wesentlich.
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Bei der erfindungsgemäßen Verwendung wird das Natriumsalz von C12MDP
bevorzugt benutzt. Jedoch können auch mit guten Ergebnissen in der Zusammensetzung
des Beispiels 1 das Kaliumsalz von C12MDP und die C1- bis C4-Alkylester von C12MDP
anstelle der Natriumsalze verwendet werden.
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Beispiel 2 Nach herkömmlichen Verfahren können wie folgt formulierte
Tabletten hergestellt werden: Bestandteil mg pro Tablette C12MDP ) 250,00 Lactose
40,00 Stärke 2,50 Magnesiumstearat 1,00 Dinatriumsalz Zur Förderung der Wundheilung
kann die obige Zusammensetzung viermal täglich einem Patienten mit einem Körpergewicht
von annähernd 70 kg zur Erhöhung der Collagen-Biosynthese verabreicht werden.
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Zur Ausübung einer erwünschten Wirkung auf die Collagen-Biosynthese
werden die Tabletten des Beispiels 2 viermal täglich an Patienten verabreicht, welche
unter Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Ankylo -Spondylitis, rheumatischem
Fieber oder systemischem Lupus leiden.
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Beispiel 3 Eine vollständige Futterzusammensetzung, welche zur Behandlung
von Gelenkerkrankungen von Tieren, mit denen ein anomaler Collagen-Stoffwechsel
verbunden ist, brauchbar ist, hat folgende Zusammensetzung: Komponente Geis. -Teile
Timothy-Heu 960 entwässertes Alfalfa 40.
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gelber Mais 600 Maisstärke 310 Salz mit Iodzusatz 10 Knochenmehl 20
Cl2MDP (Säureform) 40 Beispiel 4 Lösungen zur parenteralen oder topischen Verabreichung
von C12MDP werden hergestellt, indem man C12MDP (Säureform) in Wasser in Konzentrationen
von etwa 1 bis 10 % auflöst, indem man den pH-Wert auf etwa 7,4 mit einer pharmazeutisch
brauchbaren Base einstellt, welche der gewünschten Salzform entspricht, und die
erhaltene Lösung nach herkömmlichen Sterilisationsverfahren sterilisiert.
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Die auf diese Weise hergestellten C12MDP-Lösungen können parenteral
durch subkutane, intradermale, intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreicht
werden. Die Ublichen und bevorzugten Dosierungen bei diesen Verabreichungsarten
liegen in folgenden Bereichen:
subkutan 0,05 - 10 mg/kg intradermal
0,05 - 10 mg/kg intramuskulär 0,05 - 5 mg/kg intravenös 0,05 - 5 mg/kg Lösungen
des zuvor genannten Typs können auch direkt (topisch) auf eine befallene Stelle,
wie z.B. einen Schnitt, Einstich, eine Schürfung, einen Ausschlag oder eine Wunde,
aufgebracht werden, um den Collagen-Stoffwechsel und die Heilung zu fördern.