DE2803044B2 - Identifizierung von Stämmen von Mikroorganismen - Google Patents

Identifizierung von Stämmen von Mikroorganismen

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DE2803044B2
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Gattungsbegriff des Patentanspruchs.
Das Verfahren und die Vorrichtung zum Messen der Anfälligkeit von Bakterien gegenüber von Antibiotika gemäß US-PS 38 32 532 eignen sich für die Identifizierung verschiedener Stämme von Bakterien durch die Bestimmung der Lichtstreuindices (LSI) für eine spezielle Gruppe von mikrowellen Substanzen, welche besonders signifikante Eigenschaften bezüglich der Identifizierung von Stämmen von Mikroorganismen haben, sowie deren Analyse mittels eines Computerverfahrens, beispielsweise nach der statistischen Methode der quadratischen Diskriminantenfunktion, zur Identifizierung der Mikroorganismen, auf welche die antimikrobiellen Agenzien angewendet werden.
Es wurde gefunden, daß 14 anlimikrobielle Agenzien eine äußerst zuverlässige Identifizierung zulassen. Man glaubt, daß die identifizierende Gruppe von Agenzien verringert werden kann, ohne daß die Zuverlässigkeit der Ermittlung zu sehr beeinträchtigt wird. Die Agenzien sollten am besten solche sein, die nicht im üblichen therapeutischen Einsatz sind, um Fehler zu vermeiden, die sich bei Stämmen ergeben, die gegenüber verschiedenen therapeutisch benutzten Antibiotika immun geworden sind. Eine gegenwärtig bestimmte Gruppe derartiger Agenzien umfaßt etwa 36 Mitglieder (die nachfolgend angegeben werden und aus welchen eine Anzahl für die zuverlässige Identifikation mittels statistischer Techniken ausgewählt werden kann).
Das Konzept der Benutzung der Wachstumshemmungs- oder antibakteriellen Anfälligkeitsvorgänge für die bakterielle Identifikation ist nicht neu. Im Jahre 1971 fang Gilardi (Gilardi, G. L 1971; Appl. Microbiol. 22, 821 —823), daß Anfälligkeitsquerschnitte zur Unterstützung der Identifikation von Laktose nicht fermentierender gram-negativer Bakterien benutzt werden können. Er benutzte die Anfälligkeitsinformation für 16 Antibiotika, ermittelt auf Grund der Scheiben-Agar-Diffusionsmethode. Sutter und Finegold (Sutter, V. L. und S. M. Finegold, 1971; Appl. Microbiol., 21, 13 — 20) verwendeten Anfälligkeitsquerschnitte, um gramnegative anaerobe Bazillen in 5 unterschiedliche Gruppen einzuordnen Zur vollständigen Identifikation waren weitere Untersuchungen erforderlich.
Von Friedman und MacLowry (Friedman, R. und J MacLowry, 1973; Appl. Microbiol. 26, 314 — 317) wurde ein mathematisches Modell nach Bavsean zur Klassifi-
ίϊ'ί DJ
zierung von Bakterien benutzt Ihre Datengrundlage enthält Wahrscheinlichkeitsdaten über die Anfälligkeitsquerschnitte von 31 Arten von Bakterien. Diese Daten wurden über einen Zeitraum vcn mehreren Jahren gesammelt Bei der Klassifizierung von 100 klinischen Isolationen wurde eine 86%ige Übereinstimmung mit -der Identifikation nach üblichen biochemischen Verfahren festgestellt
Die US-iPS 38 32 532 beschreibt ein Verfahren und eine Vorriditung für die Ermittlung antibiotischer Anfälligkeit: in Verbindung mit der Bestimmung des Lichtstreuindex (LSI) der untersuchten Bakterien. Hilfsverfahren und -anlagen für derartige Bestimmungen sind in den US-PS 38 32 532, 38 95 661, 38 89 011, 39 01 588, 39 34 753, 39 42 899 und Des. 2 30 587 wiedergegeben. Die im Zusammenhang mit dem vorerwähnten System beschriebene Anlage betrifft die Geschwindigkeit der Automation verbunden mit der Flexibilität der Ausführung von Verfahren von Hand. Sie dient der simultanen Bestimmung der Anfälligkeit von Bakterien gegenüber bis zu 12 antimikrobiellen Agenzien. Das Ergebnis für jedes antimikrobielle Agenz ist ein Index der Anfälligkeit (Suspentibilität), »Lichtstreuindex« (LSI) genannt. Der Index liegt zwischen 0,00 (resistent) und 1,00 (anfällig oder empfindlich) in Schritten von 0,01. Die Testergebnisse sind, ausgenommen für bestimmte langsam wachsende Organismen, innerhalb von 3 bis 5 Stunden nach Testbeginn erhältlich.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein zuverlässiges i:nd einfaches Verfahren und dabei die Verwendung geeigneter Agenzien für die Identifizierung von Bakterien durch Bestimmung von LSI-Werten von Probenlösungen, die mit den Agenzien reagieren, vorzuschlagen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß nach Maßgabe des kennzeichnenden Teils des Patentanspruchs gelöst.
Nach der Erfindung wird also eine ausgewählte Anzahl einer bestimmten Gruppe von speziellen, das Organismenwachstum hemmenden Agenzien, beispielsweise antimikrobiellen Agenzien bei der Bestimmung von Wachstums-LSI-Werten für Probenlösungen von Bakterien benutzt, die mit den Agenzien reagiert haben (vgl. Patentanspruch). Die numerischen Wachstumsdaten, die mittels der Lichtstreuvergleiche erhältlich sind, werden analysiert, beispielsweise mittels computer-unterstützter Techniken, um die Arten von Bakterien zu ermiueln. Eine sehr nützliche Methode für die Computeranwendung ist die statistische Methode der quadratischen Diskriminantenfunktion. Diese Technik wird im Zusammenhang mit der Erfindung mit großem Erfolg eingesetzt, aber auch andere statistische Methoden können mit geringerem Maß an Erfolg eingesetzt werden.
Diese Methodik ist insbesondere geeignet für die Anwendung bei dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß US-PS 38 32 532. Sie kann jedoch auch von jedem Fachmann bei jedem anderen Verfahren zur Anfälligkeitsbestimmung angewendet werden, welches vernünftige quantitative Messungen des Organismenwachstums in Anwesenheit von inhibitorischen Substanzen liefert.
Die Erfindung kann grundsätzlich Anwendung finden bei jedem beliebigen Testverfahren, welches eine quantitative Bestimmung des bakteriellen Wachstums bezüglich verschiedener inhibitorischer Agenzien zuläßt. Eine zweckmäßige Ausführungsform ist die Kombination des unten beschriebenen Analvseverfahrens mit einem schnell arbeitenden System zur Bestimmung der Anfälligkeit, wie es beispielsweise in der US-PS 38 32 532 beschrieben ist Die allgemeine Nützlichkeit des Konzepts ist jedoch nicht beschränkt auf irgendeine Methodik zur quantitativen Bestimmung der Anfälligkeit, sei sie von der schnellen oder der herkömmlichen Art
An Hand der Zeichnung werden Ausfüiirungsbeispie-Ie der Erfindung näher erläutert Es zeigt
in Fig. 1 ein teilweise schematisches Diagramm der Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
F i g. 2 eine dreidimensionale Ansicht einer Ausführungsform eines Gerätes, welches die Zentralkonsole
Ii für die Ausführung der Erfindung enthält
Gemäß Fig. 1 enthält ein erstes System 10 zur Bestimmung der relativen Effektivität eine Anzahl von unterschiedlichen Antibiotika (z. B. 12) zur Verhinderung des Wachstums von Bakterien: Eine zum
2(i einmaligen Gebrauch bestimmte Kunststoffküvette 12, in welcher die Anfälligkeitstests ausgeführt werden, einen Scheibeneinsetzer 14 für das Einsetzen von Scheiben in die Küvette 12, einen Inkubator-Schüttler 30 für die Inkubation und Bewegung der Küvetten 12
2> und einen automatischen Lichtstreu-Fotometer-Analysator 62 für die Ermittlung des bakteriellen Wachstums und das Ausdrucken der Ergebnisse auf einem vorgedruckten Formblatt oder Band 22 gemäß US-PS 38 22 532. Es können jedoch andere Verfahren zur
in Ermittlung des Wachstums benutzt werden, beispielsweise die optische Absorption, Zellzählung, Impedanzmessung, ATP-Konzentration, Radioisotopenaufnahme oder die Erzeugung aus markierten Verbindungen, Sauerstoffaufnahme, CO?-Produktion und chemischen
π Reaktionen entsprechend der metabolischen Nutzanwendung oder Abfallmetaboliten. Während diese Methoden in Bequemlichkeit und Genauigkeit unterschiedlich sein mögen, so lehrt die vorliegende Erfindung, daß das Identifikationsverfahren so lange
4(1 unabhängig von dem Verfahren zur Bestimmung des Wachstums oder dem Ermitteln der Inhibitionsrate ist, wie das Verfahren geeignet ist, ein quantitatives Ergebnis zu liefern, welches bei der statistischen Berechnung benutzt werden kann.
4i Vor der Ausführung des Testverfahrens wird ein klinisches Isolat auf eine Petri-Schale 20 gegeben und über Nacht inkubiert. Mehrere Kolonien ähnlicher Morpholige werden dann vom Bakteriologen von der Platte mit Hilfe einer Schlinge 24 aufgenommen und
-,ο durch Umrühren in einer Salzlösung in dem Röhrchen 13 suspendiert. Dieser Schritt kann in bestimmten Fällen entfallen, wenn mit hoher Wahrscheinlichkeit ein einziger Organismus die Infektion verursacht hat. In einem solchen Fall kann der Impfstoff in einer
-,·-> geeigneten Verdünnung von zentrifugiertem Blut, cerebrospinaler Flüssigkeit oder gefiltertem Urin zubereitet werden. Mittels der Fotometer-'nstrumenten-Standardisierungsmethode wird die Suspension in dem Röhrchen 13 auf eine Standard-Bakterienkonzen-
ho tration gebracht, welche in einem Analysator 62 durch Einsetzen in eine öffnung in der Abdeckung 74 und Ablesung auf dem Meßinstrument 68 geprüft wird. Zwei Millimeter dieser Suspension werden zu 18 ml in einer eugonischen Nährbrühe in einem mit oberem Schraubte gewinde versehenen Teströhrchen 78 gegeben. Das Teströhrchen 78 läßt sich in die Kunststoffküvette 12 schrauben. Eine einfache Handhabung überträgt den Inhalt des Teströhrchens 78 gleichmäßig auf 13
Testküvettenkammern. Aritimikrobielle Agenzien, am besten auf Papierscheiben absorbiert, werden nun über öffnungen, nach Beseitigung des Verschlusses, mittels des Scheibenabgabegerätes 14 hinzugegeben und in dem Nährmedium in 12 miteinander nicht in Verbindung stehenden Abschnitten der Kammern durch rohrförmige Kunststoff-Finger in der Oberseite der Küvette 12 suspendiert gehalten. Die 13. Kammer ist die Kontrollkammer. Die Küvette 12 wird nun zweckmäßig für drei Stunden in dem Inkubator-Schüttler 30 inkubiert, welcher bis zu 30 Küvetten aufnehmen kann. Nach drei Stunden wird eine Küvette 12 in das Analysatorgerät 62 eingesetzt und das Wachstum in jeder Kammer ermittelt. Durch Vergleich mit der Kontrollkammer wird der relative änhäbitorische Effekt jedes antimikrobiellen Agens der Kammern berechnet und gemäß US-PS 38 32 532 ausgedruckt. Die folgenden Teile des Gerätes sind in der US-PS 38 32 532 im einzelnen beschrieben; Patronenröhrchen 39, Haltearme 42, Hebel 51, Gestelle 54, Sicherheitslhermostat 60, Geschwindigkeitssteuerknopf 63, Temperatursteuerknopf 65, Meßgerät 65a, Kontrolltafel 66, Druckerschlitz 70, Instrumentengehäuse 72, Tür 75 und Notschalter 77.
In F i g. 2 ist eine Konsole 62Λ für die Ausführung in Verbindung mit dieser Erfindung veranschaulicht, die ähnlich dem Gerät gemäß US-PS 38 32 532 und den zugehörigen Patenten ist. Die Konsole 62A hat folgende Ähnlichkeiten und Unterschiede im Vergleich zu dem vorbekannten Gerät.
1. Fronttafel: Die Größe der Fronttafel wurde auf die gesamte Breite des Instrumentes ausgedehnt, um Platz für die Tastatur E und die numerische Anzeige Dzu schaffen.
2. Der frühere Satz von Schaltern zum Einschalten der Maschinenbasiskonstante wurde durch das Tastenfeld A ersetzt.
3. Der Druckerschlitz B. der Impfstoffmesser Fund die Kontrolltafel C sind im wesentlichen unverändert.
Die Betriebsweise ist folgende:
1. Nach Auswahl des Verfahrens und Einstellung der Basiskonstanten läuft der Betrieb genauso wie bei dem Gerät gemäß US-PS 38 32 532.
2. Der Betriebsmode wird durch Drücken des entsprechenden Knopfes an der Tastatur E ausgewählt. Beispielsweise wird das Gerät für die Ausführung eines Standard-Susceptibilitätstests durch aufeinanderfolgendes Drücken der Knöpfe mit den Bezeichnungen AEROB, SUSCEPTIBILI- TÄT und TEST. Beim Drücken des Knopfes erscheint ein geeignetes Licht zum Anzeigen des ausgewählten Instrumentenmode. Ein Mode »AEROBER ΙΩΕΝΉΠΚΑΉΟΝ TEST« würde beispielsweise durch aufeinanderfolgendes Drükken der Knöpfe AEROB; IDENTIFIKATIONund TESrausgelöst
3. Die Berechnung und Eingabe der Basiskonstante wird nach der Anzeige des Testmode durch Drücken der Taste BERECHNUNG an Stelle von TEST ausgelöst Zur Berechnung der Basis- oder Untergrundkonstante, die in dem gegenwärtigen Susceptibflitätsvorgang erforderlich ist, werden die Tasten AEROB, SUSCEFTIB1LITÄT und BE RECHNUNG gedruckt Die Bedienungsperson läßt dann zwei oder mehrere Küvetten, die in der oben beschriebenen Weise geimpft sind, zur Kalibrierung durchlaufen. Das Gerät bestimmt automatisch den Kammermittelwert für jede Küvette und den Gesamtdurchschnitt für alle ■s Küvetten und gibt diese Ziffer auf der Digitalanzeige Dan. Wenn diese Anzahl für die Bedienungsperson zufriedenstellend ist, drückt sie den Knopf EINGABE auf dem Tastenfeld fund die Zahl wird im Gedächtnis für die spätere Verwendung
in gespeichert. Das Drücken des Knopfes TFSrführt das Gerät in den normalen Betriebsmode zurück.
Wenn eine Untergrundkonstante von spezifischem Wert erforderlich ist, so kann dieser über das Tastenfeld A und den EINGABE-Knopf am -, Tastenfeld feingegeben werden.
Jede Küvette, die mehr als zwei Kammern hat, die von dem berechneten mittleren Lichtstreuwert mehr als um einen vorbestimmten Betrag abweicht, wird automatisch ausgestoßen und die Bedienungsperson soll eine zusätzliche Küvette laufen lassen.
4. Die freigelassenen Räume des Tastenfeldes f lassen 20 weitere Verfahrensgänge zu, wenn derartige Tasten gedrückt werden und die elektrische Schaltung durch entsprechende Modulein-Schübe ergänzt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt praktisch ausgeführt. Die Kunststoffküvetten, beschrieben in der US-PS 38 95 661 und Des. 2 30 587, die in
jo Plastikbehältern aufbewahrt sind, werden aus ihren Behältern entnommen. Ein weißer flexibler Plastikverschluß wird von der Oberseite der Küvette abgestreift. Die Küvette wird dann in das Scheibenausgabegerät eingesetzt, wie es in der US-PS 38 99 011 beschrieben
ji ist, und das Scheibenausgabegerät wird angeschaltet. Es gibt dann ausgewählte antimikrobielle Scheiben in jedes der Kammern der Küvette. In jede Kammer wird nur eine Scheibe eingeführt. Das Material, welches in diesen Scheiben enthalten ist, wurde zuvor nach ihrer antimikrobiellen Susceptibilität oder ihrer Aufnahmefähigkeit ausgewählt, um zwischen verschiedenen Bakterienarten unterscheiden zu können. Der weiße Streifenverschluß wird dann wieder auf die Küvette gegeben.
Der nächste Schritt ist die Auswahl eines Bakterien-Stammes von der primären Isolationsplatte. Eine Kolonne wird in ein Röhrchen mit zweckmäßig phosphatgepufferter Salzlösung eingeimpft. Dieses Salzlösungsröhrchen wird dann in den Lichtstreufotometer eingesetzt, welcher Teil der Zentraleinheit des Systems darstellt, um die Impfstoffe zu standardisieren und die Standardisationsmeßnadel wird auf ihre Abweichung hin beobachtet. Wenn die Nadel im mittleren Bereich der markierten Meßskala liegt ist die Standardisierung eingetreten. Zwei ml des Standardisierungsimpfstoffes werden dann in ein Röhrchen mit eugonischer Nährbrühe pipettiert Während die Küvette vertikal gehalten wird, wird das Röhrchen mit der eugonischen Nährflüssigkeit in die Küvette eingeschraubt Die Küvette wird dann in die Waagerechte
ω gedreht so daß die gesamte Nährflüssigkeit die in dem Röhrchen enthalten ist in eine Aufnahmekammer verteilt wird, die an einem Ende der Küvette sitzt Wenn dieser Vorgang eintritt, steht die Küvette am Ende vertikal. Es werden zwei weitere Manipulationen mit der Küvette vorgenommen, nämlich einmal für die Verarbeitung der Nährflüssigkeit gleichmäßig über die Länge der Küvette und zum anderen zur Verteilung von gleichen 1—1/2-ml-Anteilen der Nährflüssigkeit in die
einzelnen Kammern der Küvette, die zuvor mit den antimikrobischen Scheiben ausgerüstet wurden.
Die Küvette wird dann in den Inkubator-Schüttler eingesetzt und dann bei 220 Umdrehungen pro Minute in einer Umgebung von 36° für etwa drei Stunden rotiert. Am Ende der Inkubationszeit wird die Küvette in einen Haltebügel oder -wagen in dem Lichtstreufotometerteil des Systems eingesetzt. Die Fotometerklappe wird geschlossen. Eine Karte wird für die Aufzeichnung der Ergebnisse eingesetzt und das Gerät beginnt mit seiner Berechnung. In der Kontrollkammer muß ein genügendes Wachstum erfolgt sein, anderenfalls weist der Fotometer den Test automatisch zurück. Im Falle einer solchen Zurückweisung wird die Küvette zu dem Inkubator zurückgeführt, und es erfolgt eine weitere Inkubationszeit. Wenn ein genügendes Wachstum in der Kontrollkammer vorliegt, wird ein Lichtstreuindex mittels eines Minicomputers in dem Fotometergehäuse berechnet. Dieser Lichtstreuindex ist ein Wert zwischen 0 und 1. Basierend auf diesem numerischen Wert wird eine Interpretation für jedes antimikrobielle Abgens bezüglich Anfälligkeit, mittlerer Anfälligkeit oder Resistenz berechnet.
Wie zuvor erwähnt, liegen die Ergebnisse der dieser Anfälligkeitsmessung günstig im Vergleich mit der standardisierten Kirby-Bauer-Scheiben-Diffusionsmethode (Bauer, A. W., W. M. M. Kirby, J. C. Sherris und M. Turck, 1966; Am. J. Clin. Path. 45, 493-496; und National Committee For Clinical Laboratory Standards Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 1974; In A. Balows (ed), Current Techniques for Antibiotic Susceptibility Testing: Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, Seiten 138—155) und mit der standardisierten Agar-Verdünnungs-Technik nach der International Collaborative Studie (Ericsson, H. und }. C. Sherris. 1971, Acta Pathol. Microbiol.Scand.Suppl. 217).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann gleichermaßen gut mit anderen Wachstumsmeßsystemen ausgeführt werden, vorausgesetzt, daß solche Systeme eine angemessen quantitative antimikrobielle Messung ausführen können.
Die Identifikationsmethode benutzt die Ergebnisse jedes getesteten antimikrobiellen Agens. Der Lichtstreuindex, der von —0.5 bis 1,5 in Schritten von 0,01 läuft, wird in einem Vielfach-Variationsanalyse-Vorgang, genannt quadratische Diskriminantenfunktion (QDF) benutzt. Dies entspricht einer zweckmäßigen Ausführungsform der Erfindung, jedoch nicht der einzig möglichen. Das QDF-Verfahren beruht auf der Annahme, das Mitglieder jedes der bakteriellen Gruppen einer charakteristischen Normalverteilung bei jeder der getesteten antimikrobiellen Verbindungen, die in dem Analysesystem verwendet wurde, zu folgen neigen (Sielaff, B. H, Johson, E. A. und Matsen, J. M. 1976, J. Clin. MicrobioL 3, 05—109, 1976). Wenn zwei Gruppen von Bakterien zufällig überlappende Verteilungskurven haben, dann entsteht ein Punkt gleicher Wahrscheinlichkeit in dem Überlappungsbereich. Dieser Punkt von gleicher Wahrscheinlichkeit kann als Grenze für die Klassifikation benutzt werden. Wenn eine hinreichende Überlappung vorliegt, kann auch eine hochentwickelte Computertechnik die Bakteriengruppen mit einer Variablen nicht trennen. Wenn man weitere Variable hinzufügt, dann ist die Wahrscheinlichkeit der Trennung von Gruppen größer. Wenn die Gruppen, die getrennt werden sollen, sehr unterschiedliche Werte bei jedem der verschiedenen antimikrobiellen Agenzien haben, dann ist eine Fehlklassifikation gering und die Identifikation schnell und einfach.
Das Ziel ist also, Verbindungen zu finden, welche die Fähigkeit haben, eine weite Diskriminierung auf der Basis der Lichtstreuindexwerte vorzusehen, die bei ■ί jedem der antimikrobiellen Agenzien erreicht wird, oder wenigstens eine antimikrobische Substanz zu haben, bei welcher eine klare Trennung erfolgen kann. Anfängliche Bemühungen betrafen die Benutzung lediglich solcher Agenzien, die therapeutisch bei
κι Menschen gegen bakterielle Organismen eingesetzt wurden. Die Arbeit begann mit gram-negativen Organismen wegen der erwarteten größeren Schwierigkeit der Trennung solcher Organismen in die verschiedenen klinisch signifikanten Arten. Diese Gruppe von
is Organismen enthält schwierig trennbare Genera wie Citrobacter, Enterobacter, Escherichia und Klebsieila sowie die vier Species des Proteus Genus. Die verwendeten antimikrobiellen Verbindungen bei der Querschnittsermittlung waren Ampicillin*, Bacitracin*, zwei Konzentrationen von Carbenicillin*, Cephalothin*, Colistinsulphat bei zwei Konzentrationen, Erythromycin*, Furazolidon*, Kanamycin*, Mehtenamin-Mandelat, Nalidixsäure, Neomycin*, Nitrofurantoin*, Novobiocin*, Polymixin B*, Streptomycib* und Tetracyclin*. Die
2) Matrix oder Datengrundlage, die in dem Computerprogramm der quadratischen Diskriminantenfunktion zur Analyse der Testergebnisse benutzt wurde, wurde durch Eingabe der Lichtstreuindexwerte bekannter Organismen innerhalb dieser bakteriellen Gruppierungen in den
j« Computer erzeugt. Alle hier und im folgenden mit * gekennzeichneten Bezeichnungen stellen die am Prioritätstag üblichen Handelsnamen dar.)
Bei der Benutzung dieses 18-Agenzienprofils bei 481 Organismentests wurde eine Genauigkeit des Quer-
js schnittes von 97,3% erreicht. Probleme bestehen jedoch bezüglich der Größe dieses Querschnittes, bezüglich der begrenzten Zahl von Species, die bei dem Identifikationsvorgang beteiligt sind, und bezüglich des Umstandes. daß immer spontane Resistenz in einer Krankenhausumgebung für Agenzien eintreten kann, die therapeutisch auf bakterielle Organismen angewendet werden, die innerhalb der Population menschlicher Patienten gefunden wurden oder in der Umgebung insgesamt, beispielsweise des Tierfutters, in der Veterinärmedizin usw.
Der nächste Schritt der Untersuchung war der Versuch, den antimikrobischen Querschnitt zu verringern, um die Anzahl der Variablen auf ein Minimum ohne Beeinträchtigung der prozentualen Genauigkeit
so zu verkleinern. Bei dieser besonderen Bemühung wurden verschiedene Untergruppen unterschiedlicher Größe der 18 ursprünglichen antimikrobischen Agenzien benutzt. Eine besondere Gruppierung von 14 antimikrobischen Agenzien benutzte die 481 Organis men, die zuvor erörtert wurden. Es wurde ein Verlust an prozentualer Übereinstimmung von weniger als 2% ermittelt Bei der Erniedrigung der Variablen unter 14 fiel die prozentuale Übereinstimmung jedoch stark ab. Für alle Versuche und Anwendungen erschien dann die Untergruppe von 14 antimikrobiellen Agenzien die kleinste Gruppe darzustellen, die noch eine akzeptable Übereinstimmung ergab. Wiederum sind in dieser Untergruppe nur Agenzien, welche therapeutisch benutzt sind.
Der nächste Versuch war die Entwicklung eines Planes an Agenzien, die antimikrobische Wirkung haben, die aber nicht in die Klassifikation der Antibiotika oder therapeutischen antimikrobischen
Verbindungen passen. Bei diesem Abschnitt der Untersuchung wurden mehr als 600 Verbindungen auf mögliche antibakterielle Aktivität untersucht. In dieser Liste von Verbindungen waren Chemikalien aller Typen, von denen irgendeine Art eines antibakteriellen Spektrums berichtet worden war. Aus den durchgesehenen Verbindungen wurden etwa 15% für die nähere Untersuchung ausgewählt, um ihre differentielle Selektivität bezüglich des antibakteriellen Spektrums zu bestimmen. Es wurden 104 Verbindungen bei 20 unterschiedlichen Species, einschließlich der Mehrheit der Enterobacteriaceae, sowie üblich isolierte Mitglieder der nicht fermentierenden gram-negativen Gruppen geprüft. Diese Verbindungen wurden mit Hilfe geringster Hemmungskonzentrationen untersucht, um diejenigen Mengen zu bestimmen, bei welchen eine antibakterielle Aktivität bei verschiedenen Mitgliedern jeder Gruppe der Auswahl auftrat. Hierbei wurden über 10 000 Studien bezüglich der minimalen Hemmungskonzentration ausgeführt. Solche Verbindungen, die die Fähigkeit der Differenzierung bakterieller Gruppen zeigten, wurden für die weitere Analyse mit dem Computersystem in Betracht gezogen.
Der anfängliche Schritt in dieser Richtung bestand in der Verwendung einer kleinen Anzahl dieser Verbindungen zusammen mit einem Querschnitt der zuvor untersuchten Agenzien, um auf diskriminierende Fähigkeit zu testen. Bei diesem Abschnitt der Untersuchung wurden 12 Verbindungen benutzt. Diese Verbindungen schlossen 4 Verbindungen, die für klassische antibiotische Agenzien substituiert waren, ein. Diese 4 Verbindungen waren Brilliantgrün*, Chlorhexidin, Cycloserin* und Trihydroxyacetophenon. Eingeschlossen ist auch Methenaminmandelat, ein Agens, welches nicht in den üblichen antimikrobiellen Anfälligkeitsquerschnitten enthalten ist, welches sich aber in dem erfindungsgemäßen System als sehr nützlich bei den Differenzierungsquerschnitten erwies. 14 der ursprünglichen 20 bakteriellen Gruppen wurden dann mit 24 oder 24 Isolaten pro Gruppe benutzt, um die Fähigkeit der Trennung dieser gemeinsam isolierten und etwas schwierig zu trennenden Gruppen zu bestimmen. Absichtlich waren Organismen eingeschlossen, welche bei der Separation Probleme zeigen, wie Escherichia, Citrobacter, Enterobacter und Proteus Genera.
Bei Benutzung des oben erwähnten Satzes an antimikrobiellen Agenzien gegenüber diesen Organismen wurde eine Genauigkeit von 97,1% mit Hilfe des Computerprogramms unter Verwendung der berechneten Regeln erreicht. Die schlechtesten Ergebnisse lagen bei Escherichia CoIi, wo nur 20 von 24 Arten identifiziert wurden. Drei Citrcbacter-Freundii-Organismen wurden fehlidentifiziert, bei Enterobacter war es eine Art und zwei bei Proteus-Vulgaris-Arten. Das Problem, welches bei Escherichia CoIi auftrat, bestand in der Trennung des Shigella Genus. Unter den Verbindungen, die ausgewählt wurden, befinden sich Anzeigen, die diese besonderen Genera trennen. Wenn dieser Faktor in Rechnung gesetzt wird, nähert sich die Genauigkeit innerhalb des Identifikationsschemas dieser 14 Species den Werten 98 bis 99%.
Das Ziel dieser Untersuchungen bestand darin festzustellen, ob die Benutzung maschinenlesbaren bakteriellen Wachstums, wie es in Anwesenheit verschiedener chemischer Verbindungen mehr oder weniger eintreten kann, für die Erzeugung eines Identifikationsquerschnittes von Bakterien durchführbar ist Dieses Ziel wurde erreicht Innerhalb zweier
Jahre wurde eine beachtliche Zahl für die Identifizierung von Verbindungen, die verwendet werden können, verbracht sowie für die Erstellung eines Computerprogramms für die Verwendung der maschinenerzeugten Werte. Hierbei war es notwendig, die Anzahl der studierten Gruppen zu beschränken. Aus mehreren Gründen wurde der Schwerpunkt auf die gram-negativen Bakterien gelegt. Zunächst ist der Gram-Stamm schnell und einfach als Gruppe von anderen bakteriellen Gruppen zu unterscheiden. Außerdem sind die Mitglieder dieser Gruppe im allgemeinen am schwierigsten in den klinischen mikrobiologischen Laboratorien zu identifizieren. Sie benötigen die größte Anforderung an das Identifikationssystem. Drittens umfassen die gramnegativen Bakterien die Mehrheit der Identifikationen, die derzeit in klinischen mikrobiologischen Laboratorien ausgeführt werden.
Die Untersuchungen haben insgesamt gezeigt, daß ein automatisiertes Instrumentenverfahren für die antimikrobiell Anfälligkeitsuntersuchung benutzt werden kann, um eine Bakterienidentifikation auch in drei bis fünf Stunden zu erhalten, die für die Anfälligkeitsbestimmung erforderlich war. Das Identifikationssystem benutzte antimikrobielle Anfälligkeitsergebnisse und Wachstumsmuster von anderen chemischen Wachstums-Nichtwachtums-Substanzen. Ein Computerprogramm wurde entwickelt, welches diese Ergebnisse mittels der statistischen Technik der quadratischen Diskriminantenfunktion analysiert. Die Genauigkeit der Identifikation für verschiedene taxonomische Gruppierungen von Bakterien ist 95% oder größer, verglichen mit biochemischen Standardmethoden.
Es folgt eine Liste von effektiven antimikrobiellen Agenzien und wirksamen Konzentrationen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wirkungsvoll eingesetzt werden können:
Verbindung Scheiben Bereich wirk
masse samer Konzen
trationen in
Mikrogramm
pro ml
Acri flavin* 7,5 meg 5,0
■Ti Acriflavin* 30,0 meg 20,0
v-Äminoacriiiin 10,0 meg 6,7
Auramin O* 160,0 meg 106,7
Brillantgrün* 1,5 meg 1,0
Ϊ0 Brillantgrün* 3.0 meg 2,0
Brillantgrün* 5,0 meg 3,3
Cetrimid* 120,0 meg 80,0
Cobaltchlorid 375,0 meg 250,0
55 Kupfer(II)-Chlorid 375,0 meg 250,0
Cycloserin* 120,0 meg 80,0
Cycloserin* 240,0 meg 160,0
3,5-Dibromosalicyl- 750,0 meg 500,0
b0 säure
Dodecylamin-HCl 18,75 meg IV
Dodecylamin-HCL 75,0 meg 50,0
5-Fluorouracil 8,0 meg 5,3
65 Floxuridin* 9,0 meg 6,0
Floxuridin* 36,0 meg 24,0
Malachitgrün* 3,0 meg 2,0
l-'ortscl/unu
Verbindung
Scheibenmasse
Bereich wirksamer Konzen-Iralionen in Mikrogramm pro ml
Methylenblau*
Omadindisulfid
Natriumomadin
Natriumazid
Thalliumacetat
2',3',4'-Trihydroxyacetophenon
Bacitracin*
Carbenicillin*
Cephalothin*
Colistin*
Kanamycin*
Methenaminmandelat
Nalidixsäure
Nitrofurantoin*
Novobiocin*
Polymyxin B*
Tetracyclin*
255,0 meg
5,5 meg
7,5 meg
75,0 meg
150,0 meg
375,0 meg
18,0 Einheit
50,0 meg
15,0 meg
13,0 meg
5,0 meg
1,0 meg
6,0 meg
15,0 meg
30,0 meg
50,0 Einheit
0,5 meg
170,0
3,7
5,0
50,0
100,0
250,0
12,0 Einheit
33,3
10,0
8,7
3,3 667,0
4,0 10,0 20,0 33,3 Einheit
0,3
Die Identifikation wird am günstigsten mittels einer statistischen Mehrfach-Variationstechnik, bekannt als quadratische Diskriminantenfunktion, verwirklicht. Die quadratische Diskriminantenfunktion beruht auf dem normalen Mehrfach-Variationsmodell. Zwei aneinandergrenzende sich schneidende, durch mehrere Variable bestimmte Normalverteilungen haben einen Punkt gleicher Wahrscheinlichkeit in dem Überlappungsbereich. Dieser Punkt der gleichen Wahrscheinlichkeit kann als Grenze für die Klassifikation verwendet werden. Zur Klassifizierung eines Individuums ist lediglich die Bestimmung notwendig, auf welcher Seite der Grenze das Individuum liegt. Diese Grenze der gleichen Wahrscheinlichkeit verringert eine Fehlklassifikation unter der Voraussetzung, daß die Größe der Population in beiden Fällen etwa gleich ist. Wenn die zwei Populationen sehr unterschiedliche Größe haben, dann wird das Verhältnis jeder Population, die fehlklassifiziert wird, auf ein Minimum gebracht, nicht jedoch die Gesamtzahl der Fehlklassifikationen. Es muß dann eine Berücksichtigung der Differenz in der Populationsgröße erfolgen.
Der Vorgang beginnt mit der Berechnung der Kovarianzmatrizen für die verschiedenen Gruppen. Die Formel für die Berechnung der Elemente der Kovarianzmatrix ist die Standard-Kovarianzformel:
_ k-i
t = ι t = ι
η2-«
wobei 5„ydie Kovarianz zwischen den Variablen χ,-und xy (wenn / = j reduziert sich die Formel auf die Varianz der Variablen xj und π die Anzahl der Beobachtungen bezüglich der Variablen x, und x} (diese Zahl ist die gleiche für x-, und x,; sie repräsentiert die Zahl der Individuen in dem Datensatz) sind. Diese Matrizen enthalten die Varianzen und Kovarianzen für die verschiedenen Variablen in jeder Gruppe.
Es werden auch mittlere Vektoren für die Gruppe
■) berechnet. Sie enthalten die Mittelwerte für die verschiedenen Variablen jeder Gruppe. Wenn der Satz an Variablen für die Klassifikation geändert wird, muß ein neuer Satz von Matrizen aufgestellt werden. Diese Matrizen werden unter Verwendung nur der LSI-Werte
κι für solche Variable in dem neuen Variablensatz berechnet.
Für die Klassifizierung eines Individuums in eine von NG-Gruppen wird die folgende Funktion für jede Gruppe berechnet:
/(X)1. = p,(2.-7) "2 |S,|-l/2e": (2)
wobei p, entweder der Anteil der Probe in der Gruppe / oder die erste Wahrscheinlichkeit der Gruppe /ist; NV ist die Anzahl der Variablen; 5, ist die Determinante der Kovarianzmatrix für die Gruppe i; ς, = (X- Xi)1Sr YA-- χι), wobei X der Vektor der LSI-Werte für den zu klassifizierenden den Organismus ist; x, ist der Mittelwertvektor für die /-te Gruppe; ' bedeutet die
r> Matrizentransponierung; 5,-' Inverse der Kovarianzmatrix für die /-te Gruppe. Man sieht, daß Gleichung (2) ohne p, gerade die Wahrscheinlichkeitsdichtfunktion für das Mehrfach-Variationsnormalmodell ist.
Nach dieser Berechnung für alle Gruppen wird die
κι Gruppe mit dem größten Wert für ((X) als Gruppenidentifikation für unbekannte Organismen ausgewählt. Da in der Praxis die relative Größe, die für den Vergleich zwischen Gruppen verwendet wird, von größerem Interesse als der absolute Wert ist, wird der
i") konstante Faktor mit π aus der Berechnung weggelassen.
In der Wirklichkeit sind die meisten Mehrfach-Variantenverteilungen nicht normal. Das Verfahren nach der quadratischen Diskriminantenfunktion ist aber auch
4(i dann sehr zuverlässig. So können sehr gute Klassifikationsregeln auch für sehr unnormale Populationen erreicht werden. Zur weiteren Diskussion der Mehrfach-Variantennormalität und der quadratischen Diskriminantenfunktion wird auf Anderson (Anderson, T. W.
·»> 1958; John Wiley & Sons, Inc., New York) Grams et al. (Grams, R. R. E. A. Johnson und E. S. Benson, 1972, Am. J. Clin. Pathol. 58, 188-200, und Grams, R. R., E. A. Johnson und E. S. Benson, 1972, Am. J. Clin. Pathol. 58, 201—207) und Michaelis (Michaelis, J. 1973, Academic
ίο Press, Inc., New York) verwiesen.
Ergebnisse:
Eine Gesamtzahl von 31 antimikrobieller Agenzien wurde untersucht Da vielfältige Konzentrationen für bestimmte Agenzien benutzt wurden, sind insgesamt 48 mögliche Variable (Tabelle 1) im Laufe der Untersuchungen geprüft worden. Viele dieser Variablen wurden eliminiert, da sie Iceine nützliche Information für die Differentiation ergaben. Die meisten der Arten aller
Wi Gruppen waren entweder alle anfällig oder alle resistent gegenüber dem antimikrobiellen Agens bei dieser Konzentration. Andere Variable lieferten redundante Information (die gleiche Information wie andere Variable) und konnten daher eliminiert werden. Tabelle
b5 2 zeigt eine Untergruppe des gesamten Variablensatzes, der am vielversprechendsten erschien.
Die antimikrobiellen Agenzien wurden gegen eine Probe von 481 bakteriellen Isolaten geprüft Die
Zusammensetzung dieser Probe ist in Tabelle 3 gezeigt Die Ergebnisse wurden für die Aufstellung der Matrizen für die Klassifikation verwendet Wenn die 481 Isolate in Tabelle 3 entsprechend den 18 antimikrobiellen Agenzien in Tabelle 2 klassifiziert wurden, bestand eine größere Obereinstimmung als 97% mit der Identifikation, die im klinischen Laboratorium mittels üblicher Identifikationsverfahren erzielt wird. Diese Ergebnisse Tabelle 1
Untersuchte Antibiotika
gehen aus Tabelle 4 hervor. Nahezu 80% der Nichtübereinstimmung bestand bei Organismen, die als Citrobacter oder Enterobacter vom klinischen Laboratorium und zum Teil mittels eines Anfälligkeitsquerschnitts identifiziert wurden. Diese beiden Genera wurden durchgehend als am schwierigsten zu identifizieren gefunden.
Agens Scheiben Agens Scheiben Agens Scheiben
masse masse masse
HS μβ HS
Ampicillin* 3,6 Kanamycin* 5,0 Penicillin G* 0,2")
Bacitracin* 18,0a) Kanamycin* 18,0 Penicillin G* 2,0a)
Carbenicillin* 50,0 Lincomycin* 2,0 Penicillin G* 10,0a)
Carbenicillin* 120,0 Methenamin-
mandelat		 1,0") Polymyxin B* 12,53I
Cephalotin* 15,0 Methacyclin* 30,0 Polymyxin B* 50,0a)
Chloramphenicol 5,0 Methicillin* 5,0 Polymyxin B* 300,0a)
Clindamycin* 2,0 Nafcillin* 1,0 Streptomycin* 2,0
Cloxacillin* 1,0 Nalidixsäure 5,0 Streptomycin* 10,0
Colistin* 2,0 Nalidixsäure 15,0 Streptomycin* 20,0
Colistin* 13,0 Neomycin* 5,0 Tetracyclin* 0,5
Doxycyclin* 0,5 Neomycin* 20,0 Tetracyclin* 1,5
Doxycyclin* 1,6 Nitrofurantoin* 15,0 Trimethoprim/ 23,75
sulfamethoxazol
Erythromycin* 2,5 Novobiocin* 5,0 Vancomycin* 10,0
Erythromycin* 15,0 Novobiocin* 30,0 Vancomycin* 30,0
Furizolidon* 100,0 Oleandomycin* 6,0 Viomycin* 2,0
Gentamicin* 9,0 Oleandomycin* 15,0 Viomycin* 10,0
a) Masse gemessen in Einheiten.
b) Masse gemessen in Milligramm.
Tabelle 2
Untergruppe von Antibiotika
Tabelle 3
Zusammensetzung der Probe
Scheiben- Agens
masse
Scheibenmasse
Organismus
Ampicillin* 3,6 Kanamycin* 5,0
Bacitracin* 18,0") Methanamin- 1,0")
mandelat
Carbeni 50,0 Nalidixsäure 5,0
cillin*
Carbeni 120,0 Neomycin* 5,0
cillin*
Cephalotin* 15,0 Nitro 15,0
furantoin*
Colistin* 2,0 Novobiocin* 30,0
Colistin* 13,0 Polymyxin B* 50,0")
Erythro 15,0 Strepto 10,0
mycin* mycin*
Furizolidon* 100,0 Tetracyclin* 0,5
Nr. des
Organismus
CITROBACTER 50
ENTEROBACTER 48
ESCHERICHIA COLI 75
HERELLEA 35
KLEBSIELLA 59
PROTEUS MIRABILIS 49
PROTEUS INDOL-POSITIV 51
P. morganii (19)
P. rettgeri (17)
P. vulgaris (15)
PSEUDOMONAS 62
P. ceruginosa (35)
P. fluorescens (15)
P. maltophilia (12)
SERRATIA 52
a) Masse gemessen in Einheiten.
b) Masse gemessen in Milligramm.
") Zahlen in Klammern sind nicht in den Gesamtwerten der getesteten Organismen eingeschlossen.
15 16
Tabelle 4 Gruppengegenüberstellung durch Anfalligkeitsquerschnitt und konventionelles Verfahren - 18 Variable")
(U
υ 		Bi
UJ
H 		O <
UJ 		LLA HLI > to
< 		< - durch Anfalligkeitsquer
β BAC υ UJ Oi I schnitt
ο O ICHI, »J. 53 S
to 		En I <
Bi UJ CQ -PO Oi
- durch konventionelles ω UJ ei UJ U) O UJ Oi
Verfahren U H X UJ
X 		H SlNI Ε/3
CU		 UJ
OD
45 U] U O 1 O D O O
4 2 to
UJ 		O O £ UJ O O
O 43 2 O O O H O 1
O 1 1 35 O O O O O
O O 73 O 59 O Oi
α.		 O O
CITROBACTER O O O O O O O O O
ENTEROBACTER O O O O O O O O O
ESCHERICHIA COLI O O O O O 51 O 62 O
HERELLEA O O O O O 1 O O 52
KLEBSIELLA O O O O
PROTEUS MIRABILIS O O O
PROTEUS INDOL-POSITIV 48
PSEUDOMONAS O
SERRATIA O
a) Siehe Tabelle 2. Die prozentuale Übereinstimmung zwischen Anfalligkeitsquerschnitt und konventionellen Verfahren betrug 97,3%.
Tabelle 5 Gruppengegenüberstellung durch Anfälligkeitsquerschnitt und konventionelles Verfahren - 14 Variable")
3 S
- durch konventionelles
Verfahren 		CITROBACTER ENTEROBACTER ESCHERICHIA CO HERELLEA KLEBSIELLA PROTEUS MIRABI PROTEUS INDOL-I PSEUDOMONAS SERRATIA - durch Anfälligkeilsquer
schnitt
CITROBACTER 42 4 2 O 1 O 1 O O
ENTEROBACTER 2 44 2 O O O O O O
ESCHERICHIA COLI 1 1 72 O O O O O O
HERELLEA O O O 35 O O O O O
KLEBSIELLA O 1 1 O 57 O O O O
PROTEUS MIRABILIS O O O O O 51 O O O
PROTEUS INDOL-POSITIV O O O O ü 1 48 O O
PSEUDOMONAS O O O O 1 O O 61 O
SERRATIA O 1 O O O O 1 O 50
") Die Variablen schließen AMPICILLIN, BACITRACIN.CARBENICILLIN 50 und 120, CEPHALOTIN, COLISTIN 2 und 13, ERYTHROMYCIN 15, KANAMYCIN 5, METHENAMINMANDELAT, NEOMYCIN 5, NITROFURANTOIN, NOVOBIOCIN 30 und TETRACYCLIN 0,5 ein. Die prozentuale Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren lag bei 95,6%.
Hierzu 2 BhUt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Identifizierung von Stämmen von Mikroorganismen in einer flüssigen Probe aus folgenden Schritten: Teilen der Probe in Unterproben, simultanes Beimpfen jeder Unterprobe mit einem anderen speziellen wachstumshemmenden Agens, dessen Reaktion mit den Unterproben Eigenschaften hat, die eine Identifizierung des Stammes des Mikroorganismus in der Unterprobe zulassen, wobei die speziellen antimikrobiellen Agenzien üblicherweise nicht für therapeutische Zwecke bezüglich der Mikroorganismen angewendet werden. Inkubieren der Unterproben für eine kurze Zeitperiode zur Entwicklung möglicher signifikanter Differenzen im Wachstum der Mikroorganismen in jeder der Unterproben, aufeinanderfolgendes fotometrisches oder sonstiges Bestimmen des Wachstums der Mikroorganismen in jeder Unterprobe, Vervollständigung der Ablesewerte alier Unterproben in einer kurzen Zeit, so daß die Differenzen im Wachstum in jeder der Unterproben bezüglich der Zeitdifferenzen im wesentlichen vernachlässigbar sind, Vergleich der Wachstumsmeßwerte mit einem Wertevorrat von mikroorganismenidentifizierenden Daten bezüglich der spezieilen wachstumshemmenden Agenzien, wodurch der Stamm des Mikroorganismus in der Probe identifiziert wird, dadurch gekennzeich- jo net, daß man als Agenzien mindestens:
    Acriflavin* (30,0 mcg/Scheibe, 20,0 mcg/ml); Auramin 0* (160,0 mcg/Scheibe, 106,7 mcg/ml); Brilliantgrün* (3,0 mcg/Scheibe, 2,0 mcg/ml); Carbenicillin* (50.0 mcg/Scheibe, 33,3 mcg/ml); Cephalothin* (15,0 r, mcg/Scheibe, 10,0 mcg/ml); Cobalt-Chlorid (375,0 mcg/Scheibe, 250,0 mcg/ml); Cycloserin* (120,0 mcg/Scheibe, 80,0 mcg/ml); 3,5-Dibromsalicylsiiure (750,0 mcg/Scheibe, 500,0 mcg/ml; Dodecylaminhydrochlorid (18,75 mcg/Scheibe, 12,5 mcg/ml); 5-Fluoruracil (8,0 mcg/Scheibe, 5,3 mcg/ml); Malachitgrün* (3,0 mcg/Scheibe, 2,0 mcg/ml); Methylblau* (255,0 mcg/Scheibe, 170,0 mcg/ml); Natriumazid (75,0 mcg/Scheibe, 50,0 mcg/ml) und Thalliumazetat (150,0 mcg/Scheibe, 100 mcg/ml) aus folgen- 4> den:
    Acriflavin* (7,5 mcg/Scheibe, 5,0 mcg/ml); Acriflavin* (30,0 mcg/Scheibe, 20,0 20,0 mcg/ml); 9-Aminoacridin (10,0 mcg/Scheibe, 6,7 mcg/ml); Auramin O* (160,0 mcg/Scheibe, 106,7 mcg/ml); Brilliantgrün* w (1,5 mcg/Scheibe, 1,0 mcg/ml); Brilliantgrün· (3,0 mcg/Scheibe, 2,0 mcg/ml); Brilliantgrün* (5,0 meg/ Scheibe, 3,3 mcg/ml); Cetrimid* (120,0 mcg/Scheibe, 80,0 mcg/ml); Cobaltchlorid (375,0 mcg/Scheibe, 250,0 mcg/ml); Kupfer(ll)chlorid (375,0 mcg/Scheibe, γ, 250,0 mcg/ml); Cycloserin* (120,0 mcg/Scheibe, 80,0 mcg/ml); Cycloserin* (240,0 mcg/Scheibe, 160,0 mcg/ml); 3,5-Dibromosalicylsäure (750,0 mcg/Scheibe, 500 mcg/ml); Dodecylamin-HCl (18,75 meg/ Scheibe, 12,5 mcg/ml); Dodecylamin-HCl (75,0 bo mcg/Scheibe, 50,0 mcg/ml); 5-Fluoruracil (8,0 meg/ Scheibe, 5,3 mcg/ml); Floxuridin (9,0 mcg/Scheibe, 6,0 mcg/ml); Floxuridin (36,0 mcg/Scheibe, 24,0 mcg/ml); Malachitgrün* (3,0 mcg/Scheibe, 2,0 mcg/ml); Methylenblau* (255,0 mcg/Scheibe, 170,0 « mcg/ml); Omadinsulfid (5,5 mcg/Scheibe, 3,7 meg/ ml); Natriumomadin (7,5 mcg/Scheibe, 5,0 mcg/ml); Natriumazid (75.0 mcg/Scheibe, 50,0 mcg/ml); Thalliumazetat (150,0 mcg/Scheibe, 100,0 mcg/ml); 2', 3', 4'-Trihydroxyacetophenon (375,0 mcg/Scheibe, 250,0 mcg/ml); Bacitracin* (18,0 Einheit/Scheibe, 12.0 Einheit/Scheibe); Carbenicillin* (50,0 meg/ Scheibe, 33,3 mcg/ml); Cephalothin* (15,0 meg/ Scheibe, 10,0 mcg/ml); Colistin* (13,0 mcg/Scheibe, 8,7 mcg/ml); Kanamycin* (5,0 mcg/Scheibe, 33 mcg/ml); Methenaminmandelat (1,0 mcg/Scheibe, 667,0 mcg/ml); Nalidixsäure (6,0 mcg/Scheibe, 4,0 mcg/ml); Nitrofurantoin* (15,0 mcg/Scheibe, 10,0 mcg/ml); Novobiocin* (30,0 mcg/Scheibe, 20,0 mcg/ml); Polymyxin* B (50,0 Einheit/Scheibe, 33,3 Einheit/ml); Tetracyclin* (0,5 mcg'Scheibe, 0,3 mcg/ml) auswählt, wobei die mit * versehenen Bezeichnungen die am Prioritätstag üblichen Handelsnamen darstellen.
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