DE2758481C2

DE2758481C2 - α-Glucan und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2758481C2
Application number: DE2758481A
Authority: DE
Inventors: Akira Nishinomiya Hyogo Misaki; Shigeo Shizuoka Takaya; Yoichi Sakai Osaka Tsuburaya; Koji Okayama Yokobayashi
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: National Research Institute Of Vegetables Ornamen
Priority date: 1976-12-31
Filing date: 1977-12-28
Publication date: 1985-02-07
Also published as: US4202966A; GB1570644A; DE2758481A1; FR2376211B1; JPS5385000A; CA1098065A; FR2376211A1; JPS5527561B2

Description

worin G!c einen Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet, besteht und ein mittleres Molekulargewicht von ,5 5000 bis 10 000 000 aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der folgenden Stämme

Elsinoe leucospila FERM-P Nr. 3874

Elsinoe ampelina IFO 5283, IFO 6359

Elsinoe araliae IFO 6166, IFO 7162

Elsinoe fawcetti IFO 6442, IFO 8417

auf einem Nährmedium züchtet, das Saccharose und/oder mit heißem Wasser gewonnenen Kartoffelextrakt als Kohlenstoffquelle enthält, und das erzeugte «-Glucan abtrennt und gewinnt

Die Erfindung betrifft ein «-Glucan (Elsinan) aus wiederkehrenden Struktureinheiten der Forme!

worin GIc den Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die bekannten Polysaccharide, die in Alpha-Stellung verknüpfte D-Glucose enthalten, die Alpha-Glucane. umfassen aus Pflanzen stammende Stärke, aus tierischem Material stammendes Glycogen sowie mikrobielles Dextran und mikrobielles Pullulan.

Wenngleich diese Alpha-Glucane in großen Mengen verbraucht worden sind, so wurden sie doch hauptsachlich auf dem Gebiet der Nahrungsmittel und in der pharmazeutischen Industrie verwendet:

So werden Nahrungsmittel zur längeren Aufbewahrung häufig mit einem Formkörper aus einem künstlichen Polymerisat beispielsweise einer Folie oder einem Becher, verpackt; von derartigen künstlichen Polymerisaten, die eine zufriedenstellende Durchsichtigkeit, Löslichkeit in Wasser sowie physikalische und chemische Beständigkeit besitzen, gibt es derzeit die verschiedensten Formkörper. Künstliche Materialien mit zufriedenstellender Ungiftigkeit und Eßbarkeit sind jedoch bisher zur Herstellung derartiger Formkörper nicht bekannt.

Vom Standpunkt der Umweltverunreinigung sowie der wirksamen Nutzung natürlicher Quellen ist der Ersatz derartiger synthetischer Formkörper gegenwärtig von besonderer Bedeutung - auch auf dem Gebiet der Verpackungen nicht eßbarer Produkte. .

Um die genannten Unzuträglichkeiten zu beheben, hat man bereits die obenerwähnten, keine Umweltverschmutzung verursachenden, natürlichen Alpha-Glucane, wie beispielsweise Amylose und Amylopectin, die sich von Stärke ableiten oder das durch den Mikroorganismus Aureobasidium pullulans erzeugte Pullulan, zur Herstellung von Formkörpern oder zum Verpacken und Überziehen von Produkten verwendet. Wird Amylose für die Herstellung von Formkörpern, wie beispielsweise von Folien, verwendet, ist es erforderlich, die Amylose durch Erhitzen auf verhältnismäßig hohe Temperatur, wie beispielsweise 130 bis 150° C vorzugelatinieren. Selbst in derartigen Folien jedoch retrogradiert der Bestandteil Amylose jedoch leicht und wird in eine kristalline Form umgewandelt. Das Retrogradieren und diese Umwandlung verursachen, daß die Folie opak wird und ihre Sprödigkeit zunimmt, weshalb mit Amylose eine Folie, die eine zufriedenstellende Durchsichtigkeit, Zähigkeit und Festigkeit aufweist, nicht hergestellt werden kann. Anders als Formkörper aus Amylose unterliegen solche aus Pullulan nicht dem Retrogradieren, jedoch besitzen sie den Nachteil, daß sie wasserempfmdlich sind.

Demzufolge war die Entwicklung eines biologisch oder physikalisch abbaubaren, nicht zur Umweltverschmutzung beitragenden, natürlichen oder synthetischen Materials, das die genannten Schwierigkeilen in einem Formkörper nicht hervorruft, ein dringendes Problem.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Glucans, das sich nicht nur in der Nahrungsmitte!- und pharmazeutischen Industrie verwenden läßt, sondern auch auf anderen unterschiedlichen technischen

Es wurde gefunden daß das Polysaccharid, das durch Züchten von bestimmten Mikroorganismen der Gattung Elsinoe auf einem Nährmedium erhalten werden kann, ein neues wasserlösliches Glucan mit wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel

P)-GIc-(I - 4)-Glc-(1 — 4)-Glc-(l -]

darstellt und sich für eine Reihe von industriellen Verwendungszwecken eignet, einschließlich einer Verwendung in Folienform. Das neue Glucan wurde Elsinan genannt

Das Elsinan wurde als ein Alpha-Glucan identifiziert und besitzt die folgenden Eigenschaften:

Reinheit:

Durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese wurden keine Verunreinigungen entdeckt.

Analyse:	C	=43,7%,	H	= 6,16%,
Gef.	C	=44,4%,	H	=6,17%,
Ben

N < 0,1 °.b, Asche < 0,01%

Spezifische Drehung:

[λ] « + 175 bis 280° (t= 1,6,0,5 η NaOH)

Löslichkeit:

Leichtlöslich in Wasser, 0,1 η-Natronlauge, 90%ige Ameisensäure, Formamid und Dimethylsulfoxid. Unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform oder Essigester.

Aussehen:

Farbloses, feines Pulver, geruch- und geschmacklos.

Farbreaktionen:

Grünfärbung mit Anthron/Schwefelsäure,

Gelbfärbung mit Cystein/Schwefelsäure;

bleibt farblos bei der Morgan-Elson-Reaktion; Jodfärbung negativ.

Infrarot-Spektrum: Das Infrarotspektrum im KBr ist in F i g. 1 wiedergegeben. Die Absorption bei 840 cm-¹ ist für die Alphaverknüpfung charakteristisch.

Komponenten: Die analytischen Ergebnisse, die durch Papierchromatographie, Gaschromatographie, Flüssigkeitschromatographie und nach Anwendung der Glucose-Oxidase-Peroxidase-Methode erhalten wurden, zeigten, daß der bei der Hydrolisierung von Elsinan mit 1 n-Schwefelsäure, 1 η-Salzsäure oder 1 n-Trichloressigsäure erhaltene Zucker D-Glucose war.

Außerdem zeigten die Analyseergebnisse, die durch Anwendung chemischer Verfahren, wie der Methylierung. Oxidation mit Periodat, dem Smith-Abbau und dem gesteuerten Smith-Abbau, erhalten wurden, daß das Elsinan gemäß der Erfindung ein neues «-Glucan mit einer bisher unbekannten Struktur darstellt. Die Eigenschäften des neuen «-Glucans Elsinan werden im folgenden im einzelnen näher beschrieben.

1. Die hohe spezifische Drehung von [a] J' + 175 bis 280° sowie die Absorption bei 840 cm -' im Infrarotspektrum deuten darauf hin, daß die Gesamtheit oder die meisten der glucosidischen Bindungen des Eisinans vom Alphatyp sind.

2a) Qualitative und quantitative Analyse durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie des Hydrolysats von methyliertem Elsinan zeigen, daß die Hauptkomponenten 2,4,6-Tri-O-Methyl-D-Glucose (ca. 30%) und 2,3,6-Tri-O-Methyl-D-Glucose (ca. 68%) sind und außerdem geringe Mengen an 2,4-Di-O-Methyl-D-Glucose (ca. 1 %) und 2,3,4,6-Tetra-O-Methyl-D-Glucose (ca. 1 %) vorhanden sind.

b) Vollständige Oxidation des Eisinans mit Periodat ergab, daß 0,8 Mol Periodat je Glucoserest verbraucht wurden, wobei gleichzeitig 0,07 Mol Ameisensäure je Glucoserest gebildet wurden.

c) Qualitative und quantitative Analyse durch Papierchromatographie, Gaschromatographie und Flüssigkeitschromatographie der Produkte des Smith-Abbaus von Elsinan bestätigten die folgende Zusammensetzung: D-Erythrit68 bis 70%; D-Glucose 29 bis 30%; Glycerin.

Die obigen Ergebnisse bestätigen, daß die Glucosereste im Elsinan im wesentlichen lineare Moleküle darstellen, die im Mol-Verhältnis von 2,0 bis 2,3 :1,0 durch Alpha-1,4- und Alpha-1,3-Verknüpfungen miteinander verbunden sind.

Sehr wenige der Glucosereste, die mit den benachbarten Glucoseresten über das C-Atom 1 und das C-Atom 3 verknüpft sind, sind durch eine Alpha-1,6-Verknüpfung an C-Atom 6 verzweigt. Derartige Glucosereste sind höchstens in einer Menge von 1 : 70 Glucoseresten enthalten.

3. Die papierchromatographische und gaschromatographische Analyse der Produkte des gesteuerten Smith-Abbaus von Elsinan zeigt, daß D-Erythrit und 2-O-Alpha-D-Glucopyranosyl-D-Erythrit im Mol-Verhältnis von 1.0 bis 1,3 :1,0 vorhanden sind, wobei die Anwesenheit von 2-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-Erythrit zeigt, daß der Glucoserest am C-Atom 3 mit einem benachbarten Glucoserest über eine alpha-1,3-Verknüpfung und am Kohlenstoffatom 1 mit dem benachbarten Glucoserest auf der anderen Seite über eine a!pha-1.4-Verknüpfung verbunden ist. Außerdem wurde eine Spur Glycerin nachgewiesen, die von dem nicht reduzierenden endständigen Glucoserest stamm!

4. Partielle Hydrolyse von Elsinan mit verdünnter Säure ergibt, daß Maltotriose eine geringe Menge Maltote- en traose und andere Trisaccharide und Tetrasaccharide, die sowohl alpha-1.4- als auch alpha-1,3-Verknüpfungen einnähen, im Hydrolysat vorhanden sind.

Die obenerwähnten Beobachtungen 1, 2,3 und 4 zeigen, daß das erfindungsgemäße Elsinan ein Polysaccharid ist, das kaum verzweigt ist und alpha-1,3- und alpha-l,4-Verknüpfungen enthält, wobei die Hauptstruktur darin besteht, daß etwa drei alpha-1,4-verknüpfte Glucosereste wiederholt durch eine alpha-1,3-Verknüpfung aneinandergereiht sind. Mit anderen Worten besitzt das Elsinan eine praktisch linearkettige Struktur, in der Maltotriose-Einheiten wiederholt in alpha-1,3-Verknüpfung aneinandergereiht sind.

Die Feststellungen 2, 3 und 4 zeigen ferner, daß obwohl die wiederkehrenden Einheiten vorwiegend aus Maltotriose bestehen, in geringer Menge auch Maltotetraose-Reste vorhanden sind.

Somit sind die wiederkehrenden Einheiten des Elsinans die folgenden:

Die Struktur des Elsinans kann wie folgt dargestellt werden:

CH₂OH

CH₂OH j—0 H

CH₂OH H J-O H

-O

HO

H OH

CH₂OH CH₂OH

H J-O H H J-O H 'H M l/H '

OHH λ _Λ Κ OHH.

H OH

Maltotrioserest

Nigeroserest

Maltotrioserest

Das mittlere Molekulargewicht von Elsinan läßt sich im Bereich von etwa 5000 bis etwa 10 000 000 frei einstellen, weil das Glucan entweder chemisch oder biochemisch hergestellt werden kann und sich leicht mit Salzsäure oder Schwefelsäure hydrolisieren läßt.

Das erfindungsgemäße Elsinan läßt sich chemisch beispielsweise durch Polymerisieren von Maltotrioseeinheiten mit wiederholten alpha-1,3-Verknüpfungen herstellen.

Die biochemische Herstellung des Elsinans läßt sich durch Verwendung von bestimmten Mikroorganismen der Gattung Elsinoe durchführen. Beispielsweise läßt sich Elsinoe leucospila für eine wirksame Herstellung von Elsinan verwenden. Der Mikroorganismus ist aus Arq. Inst. Biol. S. Paulo, 17, Seiten 67-72 (1946) und Study of Tea, 49, Seiten 79—88 (1975) bekannt und wurde bei dem Fermentation Institute. Agency of Industrial Science and Technology, 8-1, 5-chome, Inagehigashi, Chiba, Japan unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM-P Nr. 3874 hinterlegt

Für die mikrobielle Herstellung von Elsinan sind außerdem verwendbar:

Elsinoe ampelina Elsinoe araliae Elsinoe fawcetti

IFO 5263, IFO 6359 IFO 6166, IFO 7162 IFO 6442, IFO 8417

Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung von Elsinan näher erläutert: Die erwähnten Mikroorganismen der Gattung Elsinoe werden auf einem Kulturmedium gezüchtet, das geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralien und andere zur Erzeugung von Elsinan erforderlichen Nährstoffe enthält, wonach das erhaltene Glucan abgetrennt und gewonnen wird.

Das Kulturmedium kann in fester oder flüssiger Form vorliegen. Im Falle eines flüssigen Mediums kann zwar auch eine statische Kultur durchgeführt werden, jedoch ergeben Schüttelkulturen oder Submersverfahren höhere Ausbeuten an Elsinan.

Für ein Kulturmedium eignen sich Kartoffelextrakt mit heißem Wasser und Saccharose. Synthetische Verbindungen, wie Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff und natürliche organische Substanzen, wie Polypeptone, Maiseimveichnüssigkeit (com steep liquor), Hefeextrakt, entfetteter Sojabohnenextrakt. Peptide oder Aminosäuren, können in beliebiger Weise als Stickstoffquellen verwendet werden.

Als Mineralien können Phosphate, Kaliumsalze, Sulfate und Magnesiumsalze verwendet werden. Nötigenfalls können auch andere Mineralien, wie Ferrite oder Ferrate, Kalziumsalze und Manganate verwendet werden.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums muß in einem Bereich liegen, der das mikrobielle Wachstum und die Elsinanproduktion begünstigt

Im allgemeinen wird ein pH-Wert von 5 bis 8 bevorzugt Analog muß die Züchtungstemperatur in einem Bereich liegen, der mikrobielles Wachstum und Elsinanproduktion begünstigt Im allgemeinen wird hierfür eine Temperatur von 20 bis 30⁰C bevorzugt Die Züchtung wird durchgeführt, bis die Maximalausbeute an Elsinan erreicht ist, was im allgemeinen 3 bis 7 Tage dauert

Die erhaltene Kulturbrühe, in der nach dem obenerwähnten Verfahren Elsinan erzeugt und angereichert wird, besitzt eine hohe Viskosität Die Brühe wird zur Entfernung der Zellen und Mycele filtriert oder zentrifugiert. wonach das Elsinan in dem auf diese Weise erhaltenen klären Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit in Form weißer Federn oder in Gummiform durch Zugabe geeigneter Ausfällungsmittel, beispielsweise organischer Ausfällungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton ausgefällt wird. Das Elsinan wird durch geeignete Verfahren, wie Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Das erhaltene Elsinan kann als solches verwendet werden oder nach weiterer Reinigung, die durch Auflösen in Wasser und wiederholtes Ausfällen

durch Zugabe organischer Ausfällungsmittel erfolgt, wonach das Produkt nötigenfalls getrocknet wird. Für das Trocknen eignen sich beispielsweise das Strömungstrocknen (Flow drying), Heißlufttrocknen, Sprühtrocknen, Trommeltrocknen. Vakuumtrocknen und Lyophylisieren.

Das Elsinan kann in fester Form mit herkömmlichen Verfahren leicht in verschiedene Formen gebracht werden. Die Formkörper, die unter Verwendung von Elsinan hergestellt werden, sind, anders als diejenigen aus Pullulan, feuchtigkeits- und wasserfest. Da Elsinan in gewünschter Weise verstreckbar ist, kann das Ausmaß der Dehnung frei verändert werden, indem man Art und Menge an mitverwendetem Weichmacher verändert. Anders als Amylose unterliegt Elsinan nicht der Retrogradierung, weshalb die aus Elsinan hergestellten Formkörper, wie beispielsweise Folien, lange Zeit über die anfängliche erwünschte Durchsichtigkeit, Biegsamkeit und Faltbarkeit beibehalten. Außerdem sind die Formkörper in der Hitze verschweißbar, zäh, biegsam, ölfest, gasdurchlässig, nicht leitend, farblos, geschmacklos, geruchlos, eßbar, ungiftig und von alpha-Amylase hydrolisierbar. Wie sich aus den genannten Eigenschaften ergibt, läßt sich Elsinan mit Vorteil auf verschiedenen Gebieten der Verpackung und Überziehung von Produkten oder der Herstellung von Formkörpern allgemein anstelle herkömmlicher alpha-Glucane, wie Amylose oder Pullulan, verwenden.

Das folgende Beispiel erläutert das Herstellungsverfahren für Elsinan.

Beispiel

Ein flüssiges Medium aus Saccharose (5 g/100 ml), Hefeextrakt (0,5 g/100 ml), Dinatriumhydrogenphosphat (0,042 g/100 ml). Kaliumdihydrogenphosphat (0,018 g/100 ml), einer durch eine semipermeable Membran geführten Lösung aus Kartoffelextrakt mit heißem Wasser (300 g frische Kartoffeln je 11 Medium) und Wasser wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert und anschließend gekühlt. Danach wurde das Medium mit Elsinoe leucospila, FERM-P Nr. 3874 bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,8 beimpft und bei 24⁰C 5 Tage lang einem Submers-Verfahren unterzogen. Nach Pasteurisieren der erhaltenen Brühe während 15 Minuten bei 85°C wurden Zellen und Mycele durch Zentrifugieren (20 Min, 5000 g) entfernt. Durch Zugabe von 1,5 Volumenteilen Äthanol zu der so erhaltenen klaren überstehenden Flüssigkeit wurde rohes Elsinan als Niederschlag in Form von Federn oder Gummi erhalten. Das rohe Elsinan wurde in Wasser gelöst und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen, wie vorstehend beschrieben, zu entfernen, wonach es erneut durch Zugabe von Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit ausgefällt wurde. Nach dreimaliger Wiederholung dieses Vorgehens wurde die Ausfällung lyophilisiert.

Man erhielt ein weißes Pulver aus gereinigtem Elsinan mit etwa 30%iger Ausbeute, bezogen auf die in dem Medium eingesetzte Saccharose.

Die Viskosität einer 3%igen (GewVGew.) wässerigen Lösung des gereinigten Elsinans, bestimmt bei 30⁰C unter Verwendung eines Brookfield-Rotations-Viskosimeters, betrug 4,07 Ns/m². Die Schätzung der Molekulargewichtsverteilung des gereinigten Elsinans durch Gelfiltration ergab einen Verteilungsbereich von etwa 10 000 bis etwa 10 000 000 oder darüber, wie aus F i g. 2 hervorgeht.

Eine 5%ige wässerige Lösung des gereinigten Elsinans wurde gleichmäßig auf eine klare Glasplatte vergossen und an Luft getrocknet. Man erhielt eine farblose, klare, intensive, biegsame und selbsttragende Folie; die ausgezeichnete Überzugs- und Folienbildung des Elsinans führt dazu, daß man es als Verpackungsfolie oder Überzugsmittel verwenden kann.

In der folgenden Fig. 1 ist das Infrarotspektrum des gereinigten Elsinans und in der folgenden Fig.2 die Molekulargewichtsverteilung des gereinigten Elsinans, ermittelt durch Gelfiltration, angegeben.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. «-Glucan, im wesentlichen bestehend aus wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel [3)-Glc-(l — 4)-Glc-(l - 4)-Glc-(l —],

worin GIc einen Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet, mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 bis 1Ω 000 000

2. Verfahren zur Herstellung eines «-Glucans, das im wesentlichen aus wiederkehrenden Struktureinheiten ίο der Formel