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Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf einem anorganischen
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Trägermateriall und Verwendung der Enzym-Immobilisate zur selektiven
enzymatischen Verseifung von-Acyl-Aminosäuren Zur Immobilisierung von Enzymen wurden
die verschiedenzten Methoden der Fixierung an ünlöslichen Trägern vorgeschlagen.Klassifiziert
man die bekanten Bindungsmethoden in Adsorption, physikelischen Einschluß, ionische
Bindung, hydrophobe Wechselwirkung, kovalente Bindung, so lassen sich hauptsächlich
in der Klasse der durch kovalente Bindung immobilisierten Enzyme zufriedenstellende
Langszeitaktivitäten erreichen.
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Betrachtet man die Immobilisierung von Enzymen durch Fixierung an
modifizierten anorganischen Trägern, so wurden bisher ausschließlich durch kovalente
Bindung über mehstufige Verfahren mit reaktiven Zwischenstufen befriedigende Langszeitaktivitäten
erreicht, So ist aus der DT-OS 26 38 467 bekannt, oxidische Formkörper, darunter
solche aus Kieselsäure mit solchen siliciumhaltigen Verbindungen zu pfropfen, welche
einen Substituenten mit einer Acetalgruppe enthalten. Eine genügende Reaktionsfähigkeit
der Enzyme mit den gepfropften Trägern wird nur erzielt, wenn zuvor die Acetalgruppe
mit z.B. Salzsäure i einer zweiten Stufe in eine Aldehydgruppe umgewandelt wird,
eine genügend hohe und zugleich über mehr als einige Tage nicht absinkende Enzymaktivität
wird nur erreicht, wenn der Komplex aus Träger und Enzym mit einem Hydriermittel
in eier weiteren Stufe behandelt wird.
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Offensichtlich sind dann nach DT-OS 26 38 467 die Enzyme kovalent
an den gepfropften Träger gebunden.
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Es bestand die Aufgabe, Enzymimmobilisate mit hoher Aktivität und
auf lange Zeit gleich bleibender Aktivität durch einfache Verfahren, wenn möglich
mit nur einstufiger Modifizierung des Trägers, zu finden.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Immobilisierung
von Enzymen aus einem anorganischen Trägermaterial, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß im wesentlichen aus amorphem SiO2 bestehende Formkörper einstufig durch
Behandlung mit einem primäre oder sekundäre Aminogruppen enthaltenden Alkoxisilanen
modifiziert und mit einer Enzymlösung in Kontakt gebracht werden.
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Die Silane können gelöst in inerten Lösungsmitteln oder unverdünnt
zur Modifizierung der Träger verwendet werden, doch sind 5 bis 40 Gew.-% Lösungen
ifl niederen Alkoholen bevorzugt.
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Sehr bevorzugt als amorphes SiO2 ist ein aus Aluminiumsilikaten 1
und/oder Magnesiumsilikaten mit Schichtgitterstruktur durch Behandlung mit Sauren
und Entfernung der Kationen hergestelltes amorphes SiO2, von dem ein aus Montmorillonit
hergestelltes, im wesentlichten amorphes SiO2 enthaltendes Produkt besonders bevorzugt
ist.
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Die chemische Modifizierung des Trägermaterials erfolgt sehr bevorzugt
durch Behandeln mit Aminogruppen enthaltenden Organosilanen der allgemeinen Formel
worin R einen Alkylrest mit 1 bis 4 C.-Atomen, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoffaton
unterbrochen sein kann, R " einen Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen oder den Rest
R o einen Alkylenrest mit 1 bis 4 C -Atomen oder ein Phenylrest Z1=H oder - (CH2)n
NH2 (n = 2 - 4 ) und Z2 = H oder ZI bedeuten.
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Entsprechende Aminosilane, sind beispielsweise γ-Aminopropyltrimethoxisilan,
γ-Aminopropyltriäthoxysilan, ß-Aminoäthyl-trimethoxisilan, N-Aminoäthyl-γ-γ-aminopropyltriäthoxysilan,
N-Aminoäthyl-γ-aminopropyltrimethoxisilan, p-Aminophenyltriäthoxisilan.
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Die Silane enthalten somit stets einen oder mehrere Substituenten
mit primären oder sekundären Aminogruppen neben Alkoxigruppen und gegebenenfalls
einer Alkylgruppe.
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Es ist der besondere Vorteil gemäß der Erfindung, daß eine nur eine
stufige Modifizierung notwendig ist.
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Gemäß der Erfindung ist es nicht erforderlich, nach der Modifizierung
auf chemischem Wege die Substituenten der Silane in reaktionsfähigers Gruppen umzuwandeln
oder das Enzym-Immobilisat chemisch zu aktivieren oder zu verändern.
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Diese Tatsache ist überraschend, denn keiner der Substituenten der
zur Modifizierung verwendeten Silane besitzt solche funkticnellen Gruppen, welchen
für die Ausbildung fester, kovalente Bindungen zu funktionellen Gruppen der Enzyme
bekannt sind.
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Wiewohl also nicht völlig die Ursache für die offenbar feste Verankerung
der Enzyme aud dem modifizierten Träger nach der Erfindung verstanden wird, können
wie feststellen, daß weitere Stufen der Modifizierung unter Bildung von z.B. Diazoniumgruppen
oder weitere Reaktionen mit z.B. Glutaraldehyd zum Zwecke der Herstellung von solchen
Gruppen, welche zur Bildung kovalenter Rindungen zu Enzymen fähig sind, gemäß der
Erfindung überflüssig werden.
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Es wird jedenfalls beobachtet, daß gleichzeitig eine sehr hohe oder
überlegene Aktivität der Immobilisate bei über Wochen bleibender Aktivität auftritt,
obwohl nur ein einfacher einstufiger Modifizierungsschrit erforderlich ist, und
bei der Modifizierung nIcht solche Gruppen eingeführt werden, die typisch zur die
chemische Bindung zu Enzymen sind.
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Die als Trägermaterial verwendeten im wesentlichen aus amorphem SiO2
bestehenden Formkörper weisen einen sehr geringen Abrichbei Gebrauch auf werden
beim Gebrauch in den verwendeten Salzlösungen bzw. Pufferlösungen auch nach Monaten
nur in nicht, nennenswerter Menge gelöst.
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Zur Herstellung kann amorphe Kieselsäure verschiedener Herkunft dienen,
beispielsweise pyrogen aus SiCl4 hergestellte oder durch Fällung aus Wasserglas
mittels Säure hergestellte und getrocknete Kieselsäure, welche im wesentlichen amorph
ist und nur geringe Anteile von Kationen und geringe Wassergehalt aufweist.
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Im allgemeiner, eignen sich besonders solche Trager, die eine große
innere Oberfläche hzw. ein großes Porenvolumen in einen Perengrößenbereich von ca.
500-10 000 Å aufweisen.
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Die Trägermaterialien werden als an sich beliebige Formkörper verwendet,
von denen z.B. Linsenform, Zylinder und besonders Kugeln bevorzugt sind.
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Als Träger besonders bevorzugt ist SiO2, welches aus aluminium-oder
magnesium-haltigen Schichtsilikaten, insbesondere Montmorilionit hergestellt wurde.
Hierbei werden die Kationen durch Behandlung mit Säure, besonders Salzsäure bei
Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur herausgelöst. Das in im wesentlichen amorpher
Form zurjckblejbende SiO, wird abfiltriert und gewaschen Nach Trocknen oder in noch
feuchter Form werden Formkörper z.B.
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durch Pressen hergestellt, die durch Temperaturbehandlung, im allgemeinen
bei 400 bis 8000C verfestigt werden.
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Der so hergestellte Formkörper enthält im allgemeinen wir noch weniger
als 5 Gew.-% Kationen, insbesondere unter 1 Gew.-% Aluminium und höchstens 0,5 Gew.-%
weitere Kationen.
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Eiii Gehalt an kristalliner Modifikation des SiO2 in Höhe von 4 bis
10 Gew.-% ist nöglich, welcher Begleitstoffen des Montmorillonits entstammen oder
bei der Temperaturbehandlung gebildet werden kann.
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An einer Anzahl von Proben der Träger bestand dieser kristallino Anteil
nach Röntgen-Untersuchungen aus α-Quarz neben hohen amorphen Anteilen.
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Als Enzyme werden bevorzugt N-Acyl-L-aminosäure-amidoyhdrolasen kurz
Aminoacylasen oder Acylasen genannt verwendet, welche in acylierten Gemischen von
D,T,-Aminosäuren selektiv die L-Form zur L-Amincsäure entacylieren.
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Die Art der Acylgruppen im Substrat ist an sich beliebig, doch sind
Acetylgruppen bevorzugt.
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Die Acylasen werden aus tierischen Organen, z.B. aus Schweinenieren
oder Rinderpankreas oder speziellen Stämmen von Mikroorganismen, wie Aspergillus
orgeae ( AMANO-Acylase ) als wasserlösliche Proteine gewonnen.
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Die Acylasen werden aus Lösungen, sehr bevorzugt aus wässrigen Lösungen
auf die Träger aufgebracht.
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Im allgeneinen werden 2 bis 20 Gew.-%iger, bevorzugt 5 bis 15 Gew.-%
ige Lösungen bei niedrigen Temperaturen, bevorzugt 0 bis 40°C verwendet. Die Pufferung
der Lösungen erfogt auf etwa neutralem bis schwach alkalischen pH, bevorzugt pH
6,7 bis 7,3.
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Diese Inkubation erfordert 1 bis 4 Tage, worauf nicht gebundenes Enzym
mit Pufferlösung ausgewaschen wird.
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Die N-Acyl-Derivate können natürlichen oder synthetische Aminosäuren
entstammen. Das Verfahren ist auf eine Vielzahl von Acyl-# derivaten essentieller
und nicht essentieller Aminosäuren anwend bar, z.B. auf acylierte optisch Isomeren
von Alanin, Serin, Phenyglycin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, wobei weitere
nicht genannte Aminosauren in gleich alter Weise der Reaktion zugängig sind.
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Beispiel 1 a) 100 g eines im wesentlichen aus amorphem S102 bestehenden,
Säurebehandlung von Montmorillonit, Waschen, Verformen und Hitzebehandlung hergestellten
Trägermaterials in Kugelform werden mit einer Lösung von 20 g γ-Aminopropyl-triäthoxisilan
in 100 ml Äthanol 2 Stunden am Rickfluß gekocht. Man wäscht zunächst mit Äthanol,
dann mit Wasser neutral. Die so modifivierten Kugeln werden getrocknet (120°C, 20
Std. ). Der Gehalt an Stickstoff beträgt 0, Gew.-%.
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b) 5,6 g mit nach a) modifizierten Katalysatorkugeln werden mit 8
ml einer 10 Gew.-%igen Lösung von AMANO-Acylase in Standard- 1 Fhosphatpuffer, pH
7, 3 Tage bei 10°C stehengelassen. Man wascht mit Pufferlösung.
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c) Das Enzym-Immobilisat wird mit 50 g 10 Gew.-%iger N-Acetyl-D,L
Phenylalanin-Lösung ( in wässriger NaOH, auf pH 7 eingestellt) # 24 Stunden bei
37°C inkubiert. Nach jeweils 24 Stunden wird die enzymatisch gespaltene Substratlösung
gegen frische Substrat lösung ausgetauscht. In 24 Stunden werden 0,15 bis 0,2 g
t-Phenylalanin pro 1 g feuchtes Enzym-Immobilisat gebildt. Überraschend ist die
enzymatische Aktivität nach 8 bis 10 Wochen des Gebrauchs noch so hoch wie nach
1 bis 2 Wochen.
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Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch die enzatische
Hydrolyse entsprechend 1 c) mit Teilmengen des Immobilisats mit einerseits N-Acetyl-D,L-Phenylglycin
und andererseits mit N-Acetyl-D,L-Tryptophan ausgeführt wurden. Beide L-Aminosäurem
wurden in guter und gleichbleibend hoher Ausbeute durch 6 Wochen hergestellt.
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Beispiel 3 Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch erfolgt die Modifizierung
mit (ß-Aminoäthyl)-γ-aminopropyltriäthoxysilan anstelle von γ-Aminopropyltriäthoxisilan.
Die Aktivität cter entsprechend 1 b) aufgebrachten AMANO - Acylase, gemessen an
der Bildung von L-?henyl-,
alanin aus N-Acetyl-D,L-phenylalanin,
ist die gleiche wie in Beispiel 1 c).
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Beispiel 4 a) 280 g der Trägerkugeln nach Beispiel 1 werden mit einer
Lösung von 56 g p-Aminopropyltriäthoxisilan in 280 ml Äthanol3 Stunden am Rückfluß
gekocht. Man wäscht zweimal mit je 300 ml Äthanol und zehnmal mit je 600 ml Wasser.
Die Katalysatorkugeln werden getrocknet.
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b) Der trockene Träger wird zu 400 ml einer 10 %igen Lösung von AMANO-Acylase
in 2%igem Na-Acetat-Puffer, pH 7, gegeben und 1 Tag bei 200C stehengelassen. Man
wäscht mit Puffer-Lösung.
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c) Das Enzym-Immobilisat wurde gesteilt und in einer Säule zur Spaltung
von einerseite N-Acetyl-DN-Phenylalanin und in einer weiteren Säule zul Spaltung
von N-Acetyl-DmL-Tryptophan 50 Tage lang verwendet.
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Täglich wurden neu 1,7 l 8%ige N-Acetyl-DL-Tryphtophan-Lösung eingesetzt,
wobei vom 25. bis zum 50. Tag der Versuchschreibe eine konstant bleibende Enzymaktivität
durch gleichbleibende Drehwerte der Lösungen von - 3,5 grad festgestellt wurde.
Der Umsatz von N-Acetyl-DL-Tryptophan zu L-Tryptophan und N-Acetyl-D-Tryptophan
beträgt konstant ca. 85 %.
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Beispiel 5 Beispiel 1 a wird wiederholt, wobei als Silan einerseits
eine 10 Gew.-%ige äthanolische Lösung von γ-Aminopropyl-trimethoxisilan und
andererseitz eine 12 Gew.-%ige Lösung in Äthanol/Dichlor äthan 50:50 Volumenteile
von ß-Aminoäthyl-triäthoxysilan verwendet wurde.
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Die Aktivität des Enzym-Immobilisats entspricht Beispiel 1 c.