DE2739922A1

DE2739922A1 - Penicillansaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2739922A1
Application number: DE19772739922
Authority: DE
Inventors: Uli Dr Schwarz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1977-09-05
Filing date: 1977-09-05
Publication date: 1979-03-08
Also published as: DE2854319A1

Description

Max-Planck-Gesellschaft - 4 -

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft Penicillansäurederivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Antibiotika.

Es ist bereits bekannt, daß sich Penicillin mit bestimmten Proteinen in Bakterien zu einem sehr stabilen Komplex verbinden kann, wodurch diese Proteine, die überwiegend enzymatisch aktiv sind, inaktiviert werden. Zu diesen Proteinen gehören auch Enzyme, die für die Zellwandbiosynthese verantwortlich sind, so daß die Komplexbildung mit Penicillin zur Folge hat, daß die Zellwand deffekt wird und platzt, wodurch die Bakterien abgetötet werden.

Zur näheren Untersuchung dieses Phänomens ist es erforderlich, die Produkte, die sich bei der Bindung des Penicillins an bestimmte Proteine bilden, chromatographisch aufzutrennen und zu untersuchen. Insbesondere erscheint der Einsatz radioaktiv markierter Penicillinderivate geeignet, da sich hierdurch die Produkte anhand ihrer Radioaktivität feststellen lassen, wobei sich unter standardisierten Bedingungen ein ganz bestimmtes Radioaktivitätsmuster ergibt. Hierfür sind jedoch radioaktiv markierte Penicillinderivate mit hoher spezifischer Aktivität erforderlich. Mit radioaktivem Kohlen-

14
stoff ( C) markiertes Penicillin ist bereits bekannt und auf dem Markt erhältlich. Dieses Präparat besitzt jedoch eine geringe spezifische Aktivität, die für den angestrebten Zweck unzureichend ist.

909810/0489

Max-Planck-Gesellschaft

Es besteht daher ein Bedürfnis für radioaktiv markierte Penicillinderivate, die eine hohe spezifische Aktivität besitzen und insbesondere mit in die Zellwandbildung eingreifenden Enzymen reagieren und diese inaktivieren.

Insbesondere aus der Aminosäureforschung ist es bekannt, zur radioaktiven Markierung von Aminogruppen aufwei-

1 25

senden Substanzen mit radioaktivem Jod ( J) markiertes Bolton- und Hunter-Reagens (das heißt den N-Hydroxysuccinimidester der 3-(p-Hydroxyphenyl)-propionsäure) einzusetzen (A.E.Bolton und W.M.Hunter, Biochem.J. Vol. 133 (1973) 529 bis 539). Dieses Reagens wurde jedoch offenbar noch nicht zur Markierung von Penicillinderivaten verwendet.

Bei der Markierung von Penicillansäurederivaten, insbesondere Ampicillin und 6-Aminopenicillansäure mit

125

J unter Verwendung des Bolton- und Hunter-Reagens

wurden nun Penicillansäurederivate gebildet, die nicht nur eine sehr hohe spezifische Aktivität aufweisen und daher für die wissenschaftliche Untersuchung der oben angesprochenen Phänomene hervorragend geeignet sind, sondern die auch offenbar aufgrund der eingefügten Substituentengruppe ganz andersartige antibiotische Wirkungen entfalten als das als Ausgangsmaterial eingesetzte Penicillansäurederivat, was auch für die nicht radioaktiv markierten entsprechenden Derivate und davon abgeleitete Derivate zutrifft.

Gegenstand der Erfindung sind daher Penicillansäurederivate der allgemeinen Formel I

909810/0A89

Max-Plnnck-Gesellschaft

Il

) -C-A-CH CH

i -N-

-c-

CH₃

CH₃ -COOH

(D

in der

η eine ganze Zahl mit einem Viert von 1 bis 11 ,

vorzugsweise von 1 bis 5 und insbesondere von 2, R ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, wie ein Fluoratom, ein Chloratom, ein Bromatom oder ein

125 Jodatom und insbesondere ein J-Atom, eine

Hydroxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Methoxygruppe oder eine Äthoxygruppe oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, A eine Gruppe der Formeln

-N-H

oder

-NH-CH-CO-NH -

bedeuten.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Penicillansäurederivate in Bakterien mit einem für die Zellwandsynthese offenbar besonders wichtigen Enzym einen Komplex bilden und dieses für die Lebenstätigkeit des Bakteriums essentielle Enzym vollständig blockieren und damit inaktivieren, was zur Folge hat, daß sie eine unerwartet starke antibiotische Wirksamkeit entfalten.

So bilden sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Penicillansäurederivate mit Proteinen Produkte, die nach

Auftrennung ein Radioaktivitätsmuster auf-

909810/0489

Max-Planck-Gesellschaft - 7 -

weisen, das deutlich verschieden ist von dem Muster, das mit dem zugrundeliegenden Penicillansäurederivat selbst erhalten wird. Insbesondere wird im Fall der erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Penicillansäurederivate einer der markierten Flecken wesentlich verstärkt, was darauf schließen läßt, daß es sich hierbei um einen Komplex mit einem für die Zellwandsynthese besonders wichtigen Enzym handelt.

Die entsprechenden nicht radioaktiv markierten und jodfreien erfindungsgemäßen Penicillansäurederivate ergeben bei der Untersuchung an Mikroorganismen morphologische Veränderungen. Hierbei wird die Zellteilung unterdrückt und es bilden sich Fäden, die Knoten aufweisen. Dies bedeutet, daß die mit den erfindungsgemäßen Penicillansäurederivaten behandelten Zellen nicht mehr in der Lage sind, sich voneinander zu trennen, was offenbar auf einer ungenügenden Zellwandbildung beruht. Die erfindungsgemäßen Penicillansäurederivate üben somit einen auf die Zellteilung negativ einwirkenden Effekt aus. Diese an gramnegativen Organismen durchgeführten Untersuchungsergebnisse lassen auch darauf schließen, daß die erfindungsgemäßen Penicillansäurederivate gegenüber grampositiven oder anderen Bakterien eine noch stärkere Wirkung ausüben.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung der oben definierten Penicillansäurederivate der allgemeinen Formel I als Antibiotika bzw. Arzneimittel oder Reagenzien, die diese Verbindungen als Wirkstoffe neben üblichen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen enthalten.

909810/0489

Max-piarck-Gesellschaft

Die erfindungsgemäßen Penicillansäurederivate sind dadurch erhältlich, daß man irgendein Penicillinderivat, das freie Aminogruppen trägt, insbesondere Ampicillin und 6-Aminopenicillansäure mit einem N-Hydroxysuccinimidester einer araliphatischen Carbonsäure umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der oben definierten allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen N-Hydroxysuccinimidester der allgemeinen Formel II

^K\ 0 C CH₂

HO-<^JV4CH₂)_n-C-O-N j (II)

CCH

mit einem Penicillansäurederivat der allgemeinen Formel III

S. ,^CH3

H-A^-CH CH C /___%

I ^CH3 C N C—COOH

/^ I

0 H

umsetzt, in welchen allgemeinen Formeln n, R und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Die Umsetzung wird insbesondere bei einer Temperatur von O⁰C bis Raumtemperatur in einem geeigneten Lösungsmittel, insbesondere in einem wäßrigen Lösungsmittelsystem bewerkstelligt, wobei man vorzugsweise bei einer Temperatur von O⁰C und in einem Puffer mit einem schwach alkalischen pH-Wert, insbesondere in einem Borat-Puffer

909810/0489

Max-Planck-Gesellschaft

mit einem pH-Wert von 8,5, arbeitet,

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1 25

J-markiertes Ampicillinderivat der Formel

HO^V-CH₂-CH₂-C-NH-CH-CO-NH-Ch CH

cj H

CH₃ CH₃ COOH

In 100 μΐ eiskaltem Boratpuffer (0,1 m mit einem pH-Wert von 8,5) löst man 50 μg Ampicillin. Bei O⁰C setzt man diese Lösung mit 1 mCi Bolton- und Hunter-Reagens (1400 Ci/mMol, erhältlich von dem Radiochemical Center Amersham) um. Hierbei wird das Bolton- und Hunter-Reagens zunächst in Benzin gelöst und durch Abdampfen des Lösungsmittels auf die Wand des Reaktionsgefäßes aufgetrocknet. Nach 20minütigem Stehenlassen bei O⁰C trennt man das Reaktionsgemisch gelchromatographisch auf einer Säule mit einem Durchmesser von 0,8 cm und einer Länge von 17 cm (die mit Bio-Gel P-2, der BioRad Laboratories, Richmond, California, USA, beschickt ist) nach der Molekülgröße auf, wobei man mit destilliertem Wasser eluiert. Bei der Elution erhält man drei radioaktive Fraktionen, von denen die zuerst eluierte das erfindungsgemäße, mit radioaktivem Jod markierte Ampicillinderivat enthält. Das in dieser Fraktion enthaltene Material wird gefriergetrocknet und luftdicht verschlossen bei -20⁰C aufbewahrt.

909810/0489

Max-Planck-Gesellschaft

Beispiel 2

J-markiertes 6-Aminopenicillansäurederivat der

Formel 125.

HO-

'/ VCH₂-CH₂-C-NH-CH CH

C N

CH.

C —-COOH H

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von 50 μg 6-Aminopenicillansäure das Derivat der obigen Formel.

Beispiel 3 Ampicillinderivat der Formel

0 HO-/ VCH₀-CH₀-C-NH-CH-CO-Nh-CH

Man löst 10 mg 3-(p-Hydroxyphenyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester in 1 ml kaltem Aceton. Man gibt die Lösung tropfenweise zu einer bei 0⁰C gehaltenen Lösung von 5 mg Ampicillin in 5 ml 0,1m Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5. Nach 30minütigem Stehenlassen unter Rühren bei O⁰C wird das Reaktionsgemisch nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise fraktioniert. Hierbei wird jedoch eine Säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm und eine Länge von 59 cm verwendet, die ebenfalls mit Bio-Gel P-2 gefüllt ist und mit Wasser

909810/0489

Max-Planck-Gesellschaft

eluiert wird. Die Elution der Komponenten wird über das UV-Absorptionsspektrum verfolgt. Auch hier erhält man mehrere Fraktionen, von denen die die Säule zuerst verlassende das gewünschte Ampicillinderivat enthält. Die das erfindungsgemäße Derivat enthaltende Fraktion wird ebenfalls gefriergetrocknet und unter absolut trockenen Bedingungen bei -20°C gelagert.

Beispiel 4
6-Aminopenicillansäurederivat der Formel

O / \ CH,

HO-// \y CH₀-CH₀-C-NH-CH CH

²² Il

N C COOH

ti
0

Nach der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise bereitet man ausgehend von 5 mg 6-Aminopenicillansäure das Derivat der obigen Formel, das ebenfalls gefriergetrocknet und bei -20⁰C gelagert wird.

909810/0489

Claims

Patentanwälte

Dipl.-Img. H.Wficxmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

Dr.-Inq. H. Lfate.:

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

HtM/th

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Göttingen, Bunsenstr. 10

Penicillansäurederivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

PATENTANSPRÜCHE

ii Penicillansäurederivate der allgemeinen Formel I

H Q)M \V4CHo) -C-A-CH CH

(D

909810/0489

Ka;c- Planck-Gesellschaft

in der

η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 11, R ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine

Hydroxygruppe, eine Nitrogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und A eine Gruppe der Formeln

-N- oder -NH-CH-CO-NH- ,

I"

bedeuten.
2. Verbindungen nach Anspruch 1,dadurch g e kennzeichnet, daß R für ein Jodatom, eine Methoxygruppe oder eine Äthoxygruppe steht.
3. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für ein J-Atom steht,
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen N-Hydroxysuccinimidester der folgenden allgemeinen Formel II

0
-C-O-N

-CH,

(II)

mit einem Penicillansäurederivat der allgemeinen Formel III

H-A-CH CH C^ (III)

909810/0489

Max-PJ anck-Gesellschaft - 3 -

in welchen Formeln η, R und A die in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebenen Bedeutungen besitzen, umsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 4,dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Temperatur von O⁰C in einem Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5 bewirkt.
6. Verwendung"der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 als Antibiotika.

909810/0489