DE3341806A1

DE3341806A1 - Radioaktiv mit (pfeil hoch)1(pfeil hoch)(pfeil hoch)2(pfeil hoch)(pfeil hoch)5(pfeil hoch)i-markierte 1,4-dihydropyridinderivate und 1,4-dihydrochinolinderivate, ihre herstellung und ihre verwendung zur auspruefung von arzneimitteln

Info

Publication number: DE3341806A1
Application number: DE19833341806
Authority: DE
Inventors: David R. 6300 Gießen Ferry; Hartmut Prof. Dr.med. 6301 Heuchelheim Glossmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-11-19
Filing date: 1983-11-19
Publication date: 1985-05-30
Also published as: GB2150137B; JPS60123470A; GB8429054D0; JPS6224423B2; DE3341806C2; US4784958A; FR2555175A1; FR2555175B1; GB2150137A

Description

RADIOAKTIV MIT ¹²⁵I-MARKIERTE 1,4-DIHYDROFYRIDIN-DERIVATE WiD 1,4-DIHYDROCHINOLINDERIVATe, IHRE HERSTELLUNG UND IHRE VERWENDUNG ZUR AUSPRÜFUNG VON ARZNEIMITTELN

125 Die Erfindung betrifft hochradioaktiv mit "Ί markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1^-Dihydrochinolinderivate, ihre Herstellung durch Umsetzung von an Estergruppen endständig eine Aminogruppe tragenden 1,4-Dihydropyridinestern oder 1,4-Dihydrochinolinestern

mit '²^l markierten acylierenden Verbindungen und die Verwendung der durch präparative chromatographische Methoden abgetrennten Verbindungen zur Ausprüfung von Arzneimitteln oder anderen Stoffen mit Hilfe von Rezeptoren (Arzneimittelscreening mit Hilfe des Radiorezeptorassays) und zur Plasmaspiegelbestimmung von calciumkanalwirksamen Arzneimitteln.

auch
Dadurch istYeine rasche autoradiographische Darstellung von Rezeptorbindungsstellen von Arzneimitteln und anderen Stoffen, die mit 1,4-Dihydropyridin- oder 1,4-Dihydrochinolinbihdungsstellen (Rezeptoren) wechselwirken, möglich.

33 AfSO 6]

Unter dem Oberbegriff organische Calciumantagonisten (A. Fleckenstein: Calcium Antagonism in Heart and Smooth Muscle, John-Wiley and Sons, New York, Clinchester, Bristone, Singapure, 1983; D.J. Triggle: Calcium Antagonists: Basic Chemical and Pharmacological Aspects (pp 1-18) in G.B. Weiss (Editor): New Perspectives on Calcium Antagonists, American Physiological Society, Bethesda, Maryland USA, 1981; D.J. Triggle: Chemical Pharmacology of Calcium Antagonists (pp 17-38) in R.G. Rahwan and D.T. Witiak (eds.): Calcium Regulation by Calcium Antagonists. ACS

■ΊΟ Symposium Series 201. American Chemical Society, Washington DC, 1982) werden Stoffe zusammengefasst, die als Therapeutika beim Menschen angewendet werden und zur Zeit folgende Anwendungsgebiete haben: Angina pectoris, supraventrikuläre Tachykardie, ventriculäre Herzrhythmusstörungen, Vorhofflattern und Vorhoff1 immern, erhöhter Blutdruck, und für folgende mögliche Anwendungsgebiete genannt werden: Cerebrale Insuffizenz und Vasospasmus, pulmonaler Hochdruck, Asthma bronchiale, Frühgeburt, Dysmenorrhoe, Kardioprotection, Arteriosklerose und Blockade der Freisetzung von sogenannten Mediatoren (Thromboxan A^) bei allergischen, entzündlichen oder mit Aggregation der Blutplättchen einhergehenden Erkrankungen (A. Fleckenstein in: Calcium Antagonism in Heart and Smooth Muscle, 1983 und R.A. Jariis and D.J. Triggle in: New Developments in Ca²⁺ Channel Antagonists. J. Med. Chem. 26, 775-785, 1983).

Die therapeutisch verwendeten bzw. in klinischer Erprobung oder in Entwicklung befindliche Calciumantagonisten gehören verschiedenen chemischen Stoffklassen an. Von den bisher bekannten Calcium-J

■ Λ-s ■- ix»

-a-

antagonisten sind die 1,4-Dihydropyridine und 1,4-Dihydrochinoline die weitaus wirksamsten.

-AO "3

Schön in Konzentrationen von 10 - 10 Mol/l blockieren diese Stoffe den Druchtritt von Calcium durch die Calciumkanäle der Zellmembran der glatten Muskulatur (A. Fleckenstein, 1983; D.J. Triggle, 1981, 1982; R.A. Janis and D.J. Triggle, 1983). Im Falle chiraler 1,4-Dihydropyridine ist die Blockade stereoselektiv (Towart, R., Wehinger, E. and Meyer, H. (1981): Effects of unsymmetrical ester substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and their optical isomers on contraction of smooth muscle. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 317: 183-185; Towart R., Wehinger, E., Meyer, H., Kazda, S. (1982): The effects of nimodipine, its optical isomers and metabolites on isolated vascular smooth muscle. Arzneim. Forsch. (Drug Res) 32: 338-346).

Die Publikationen (Glossmann, H., Ferry, D.R., Lübbecke," F., Mewes, R., Hofmann, F. (1982): Calcium channels: direct identification with radioligand binding studies. TIPS 3: 431-437; Glossmann, H. and Ferry, D.R. (1983): Molecular approach to the calcium channel. Drug Development 9: 63-98; Janis, R.A., Triggle, D.J. (1983): New developments in Ca²⁺ channel antagonists. J. Med. Cem. 26: 775-785; Janis, R.A., Scriabine, A. (1983): Sites of action of Ca²⁺ channel inhibitors. Biochem. Pharmacol, (in press); Ferry, D.R., GoIl, A., Glossmann, H. (1983): Differential labelling of putative skeletal

3 3 3

muscle calcium channels by H -nifedipine, H -nitrendipine, H nimodipine and ^H -PN 200-110. Naunyn-Schmiedeberg's Arch.

Pharmacol. 323: 276-277; Bellemann, P., Ferry, D.R., Lübbecke, F.,

-ßa-

Glossmann, H. (1981): ³H -Nitrendipine, a potent calcium antagonist binds with high affinity to cardiac membranes. Arzneim-Forsch (Drug Res) 31: 2064-2067; Ferry, D.R., Glossmann, H. (1982a): Identification of putative calcium channels in skeletal muscle microsomes. FEBS Lett 148: 331-337; Ferry, D.R., Glossmann, H. (1982b): Evidence for multiple drug receptor sites within the putative calcium channel. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 321: 80-83) beschreiben z.T. in Übersichtsartikeln die Verwendung tritiierter (spezifische Aktivität ca. 3 - ca. 160 Ci/mmol) 1,4-Dihydropyridine zur Charakterisierung der Bindungsstellen (Rezeptoren) für diese Pharmaka. Tritiierte 1,4-Dihydropyridine können nach diesen Erkenntnissen zum in vitro Screening von neuen Stoffen, zur Abklärung von bestimmten Nebenwirkungen bekannter Arzneimittel oder zur Plasmaspiegelbestimmung von Calciumantagonisten verwendet werden. (Beispiele: R.J. Gould, K.M.M. Murphy, I.J. Reynolds and S.H. Snyder: Thioridazine: Calcium channel blockade may explain peripheral side effects. American J. Psychiatrics (in press) and R.J. Gould, K.M.M. Murphy and S.H. Snyder: A simple radioreceptor assay for calcium antagonist drugs. Life Sciences (in press)). Ferner werden die tritiierten 1,4-Dihydropyridine zur autoradiographischen Darstellung ihrer Rezeptoren benutzt (z.B. Quirion, R. (1983): Autoradiographic localization of a calcium channel antagonist, ³H -nitrendipine, binding site in rat brain (Neuroscience Lett 36: 267-271).

' /yi ■
Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik und den geltenden

Bestimmungen zur Beseitigung radioaktiven Abfalls sind tritiierte Verbindungen für die obengenannten Anwendungsbeispiele als nicht mehr optimal anzusehen. Nachteile des ³H z.B. gegenüber ¹²^I sind die lange Halbwertszeit, die relativ niedrige spezifische Aktivität und damit geringere Empfindlichkeit, die Notwendigkeit organische Scintillatoren zu verwenden, die geringe Zähleffizienz und die lange Expositionsdauer zum Zwecke der Autoradiographie.

125 Die Probleme der hochradioaktiven Markierung mit ^I von Stoffen, die z.B. als Haptene fungieren und als Liganden in einem Radioimmunoassay eingesetzt v/erden, sind von J.E. Corrie und W.M. Hunter (Methods in Enzymology Vol. 73» Part B, Eds. J.L. Langone and H. van Vunakis, Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1981, pp79-112) erschöpfend dargestellt. Hiernach ist von absoluter Priorität, daß der hergestellte Ligand in dem Anwendungsgebiet analytisch wirksam ist, die radioaktive Markierung reproduzierbar ist, der Ligand niedrige unspezifische Bindung zeigt und für längere Zeit (Tag, Wochen, Monate) stabil aufbewahrt werden kann.

125 Es gibt grundsätzlich drei Wege, um stabile -Ί-markierte Liganden zu synthetisieren:

1. (und am wenigsten gebraucht) Halogen Austausch-

reaktionen (z.B. Science 205, pp1138-1140 -(1979))

125

2. Einführung des I in Phenol oder Imidazolderivate

mit Hilfe der Chloramin T-Methode nach Greenwood, Hunter und Glover oder elektrolytisch oder mit Hilfe von Lactoperoxidase (sehr häufig gebraucht) und

125

3. Die Einführung der radioaktiven ^J1 über ein Trägermolekül. Bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Aminoglykosidantibiotika, Clonazepam, Biotin, Bleomycin) ist diese dritte Methode, nämlich die Einführung dos

1 ^5
radioaktiven ^t-^J1 über ein Trügermolokül, z.B. mit

BAD ORIGINAL

^l-markierten N-succinimidyl 3-(4-HydroxyphenyD-

125
Propionat, di- ^l-markiertem Methyl p-Hydroxy-

125

"benzimidat und I-markiertem diazotierteni Anilin nur für Peptide und Proteine oder z.B. für Heparin "beschrieben (J.J. Langone in: Methods in Enzymology Vol. 73, Part B, Eds. J.L. Langone and H. van Vunakis, Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1981, pp112-127).

Die entscheidende Einschränkung der Methode ergibt sich aus der von J.E. Corrie und W.M. Hunter (ebenda) geforderten absoluten Priorität der Eigenschaften: Der hergestellte Ligand muß nicht nur radioaktiv, sondern auch analytisch brauchbar sein. Es ist also keinesfalls hinreichend, radioaktives Jod über eines der genannten Verfahren, insbesondere dem Verfahren 3, in ein Molekül einzuführen, sondern das markierte Produkt muß auch z.B. in einem Radioimmunoassay von einem gegen ihn gerichteten Antikörper erkannt und mit ausreichender Bindungsfestigkeit gebunden werden können. Je kleiner das radioaktiv zu markierende Molekül ist, desto schwieriger wird es sein, die strukturellen Erfordernisse, insbesondere für spezifische Bindungsstellen (Rezeptoren) der Arzneimittel zu erfüllen, wenn mit Hilfe der Methode 3 über Einführung eines Trägermoleküls ein relativ großer, radioaktiver Substituent die Struktur verändert. Diese Schwierigkeiten erklären, daß hoch-

125
radioaktiv mit ^I markierte 1,4-Dihydropyridine und 1,4-Dihydrοchinoline, die die erforderlichen Kriterien erfüllen, bisher nicht existieren.

Aufgabe der Erfindung ist es, neue ¹²⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate zu schaffen, die aufgrund ihrer Struktur hochaffin an Rezeptoren für Pharmaka dieser j

Stoffklasse in verschiedenen Geweben binden. |

-7-

Diese Aufgabe wird gelöst durch die radioaktiv mar kierten 1,4-Dihydr©pyridinderivate und 1,4-Dihydro chinolinderivate der nachstehend angegebenen allgemeinen Formeln:

R²OO Ο

und die 1,4-Dihydrochinolinderivate der allgemeinen Formel

,- COO R¹

1 2

in denen R und R gleich oder verschieden

sind und R¹ eine -£A)-NH-C-(Y)-R^x Gruppe, in der A und.Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen und

R^x ein in p-Stellung, nicht mit Halogen substituierter Phenylrest oder ein in 4-Stellung angefügter Imidazolrest ist, und wenn R¹ nicht R² ist, R NO₂, Nitril oder Alkoxy mit 1-4 Kohlenstoffatomen,

3 4
R^ und R gleich oder verschieden sind mit

H, NH₂ oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1-4 Kohlenstoffatomen R⁵ ein Arylrest, der ggfs. 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der

Gruppe Alkyl-, Alkoxy, Phenyl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält-, vorzugsweise ein Phenyl-, Naphthyl, Thenyl- oder Furylrest ist,

R^ H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten,

■χ 125

und in denen der Rest R noch mit -'Jod ein oder zweifach substituiert ist und die spezifische Aktivität etwa 2«200 -etwa 8.800 Ci/nMol beträgt.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere ihre Herstellung und Verwendung,sind in den Unteransprüchen beschrieben.

125 Die radioaktive Markierung mit ^I erfolgt durch Einbringen eines mit radioaktivem Jod ein oder zweifach substituierten Phenylrestes oder Imidazolrestes an bestimmten Stellen der 1,4-Dihydropyridin bzw. 1,4-Dihydrochinolinderivate. Der radioaktiv markierte Rest R^x ist vorzugsweise ein Rest der Formeln:

.125 I /r-<

N₃ oder-/ \-0H

oder

-/if-

Die dadurch erreichbaren Aktivitäten liegen zwischen etwa 2.200 und etwa 8.800 Ci/mMol, je nachdem, ob der Rest R^x ein oder zweifach mit -⁵I substituiert ist, und ob in die Pyridinderivate ein oder zwei markierte Reste R^x eingebracht werden. Bevorzugt ist es, eine Aktivität von 2.200 bis 6.600 Ci/mMol einzustellen. Ganz besonders bevorzugt, weil besonders stabil, sind Derivate mit Aktivitäten von etwa 2.200 bis etwa 4.400

Die Synthese der erfindungsgemäßen 1,4-Dihydropyridin-derivate und 1,4-Dihydrοcliinolinderivate geht von entsprechenden Carbonsäureesterderivaten aus, die an der Estergruppe eine endständige, nicht substituierte Aminogruppe tragen.

Die Herstellung der Grundkörper, sowohl der unsymmetrischen als auch der symmetrischen, ist in DE-OSs 21 17 573, 23 10 746 und 29 35 451 beschrieben.

Dabei werden Aldehyde der Formel R^CHO,in der R^ ein Arylrest, der ggfs. 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe der Alkyl-, Alkoxy, Pheyl, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, wobei Alkyl oder Alkoxy oder Alkylmercapto niedere Gruppen dieses Types mit 1-4 Kohlenstoffatomen sind, mit ß-Ketocarbon-

4 9

säureestern der Formel R CO-CHp-COO R und Enawin-

carbonsäureester der Formel R^-C = CH-COO R'

NH₂

in Gegenwart von V/asser oder inerten organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen zwischen 30 und 200 C umgesetzt.

""""33 Al 8 -ψ-

-A-

7
R ist in diesen Fällen eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Methyl oder Äthyl * die, abweichend von den in den Druckschriften beschriebenen Verbindüngen, endständig eine primäre Aminogruppe trägt.

R² kann gleich R oder NO₂, Nitril oder Alkoxy mit 1-4 Kohlenstoffatomen sein.

R? und R *" sind gleich oder verschieden und bedeuten H, NH₂ oder gradkettige oder verzweigte Alkylrest'e mit 1-4 Kohlenstoffatomen.

Für die Herstellung der 1,4-Dihydrochinolinderivate geht man von 2-Aminobenzylalkoholen der Formel

aus und setzt diese mit NH,

ρ-Dicarbonylverbindungen der Formel

CO R⁷

CH₂

in Gegenwart von inerten organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen zwischen 20 und 200° C um.

"5 5 7
R , R , R haben die vorstehend bereits angegebene Bedeutung. R ist H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxy mit jeweils 1-4 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Methyl, Äthyl, Methyloxy oder Äthyloxy.

Als acylierende Verbindungen zum Einbringen des

125 radioaktiv markierten Restes R dienen I-markierte Succinimidester der Formel

f 2

-O-C-(Y)-R^X
O

in denen Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1,2 oder 3 C-Atomen ist und R^x die bereits angegebene Bedeutung hat, und wobei dieser Rest ein oder zweifach mit -⁷I substituiert ist.

Die Umsetzung erfolgt, wie von J.J. Langone in Methods in Enzymology Vol. 70, S 221-243 (1980) beschrieben, unter milden Bedingungen zwischen 0° C und 25° C innerhalb von 5 oder mehr Minuten in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise im alkalischen Bereich. Z.B. unter Zusatz von Natriumboratpuffer, pH 8.4 - 8.5.

Die Reaktionsprodukte werden präparativ mit Hilfe chromatographischer Verfahren (HPLC oder Dünnschichtchromatographie) getrennt, die erfindungsgemäßen Dihydropyridin-und Dihydrochinolinderivate in Benzol oder absolutem Ethanol aufgenommen und bei -20° C unter Ausschluß von Licht und Sauerstoff gelagert. Die Derivate weisen die spezifische Aktivität des eingesetzten Succinimidester auf. Diese liegt bevorzugt zwischen 2.200 und 4.400 Ci/mMol.

Die Überprüfung der radiochemischen Reinheit erfolgt mit gängigen chromatographischen Methoden (HPLC oder Dünnschicht). Mit dem gleichen Verfahren kann auch

■ H'

die Prüfung über die erforderliche Stabilität unter den Bedingungen der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Arzneimittelausprüfung erfolgen.

Dabei werden die ^!-markierten 1,4-Dihydropyridin- und 1,4-DihydrochtodUrrlerivate im sogenannten Rezeptorassay (Puffern, erhöhte Temperatur zwischen 25° und 37° C) und Gewebehomogenaten, Plasma und Membranfraktionen ausgesetzt. Es wird die spezifische Bindung gemessen. Diese ist definiert als der Unterschied in der Bindung des markierten Derivates in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 uMol/1 eines Pharmazeutikums vergleichbarer oder analog wirkenden Struktur. Die Trennung von gebundenen und freien 125

~Ί-markierten Derivaten erfolgt durch übliche Filtrationstechnik, wie sie beispielsweise beschrieben ist von J.P. Bennett: Methods in binding studies, in: Neurotransmitter Rece.ptor Binding (Eds H.J. Yamamura, S.J. Enna und M.J. Kuhar, Raven Press, N.Y. 1978 PP57-9O).

Zur Abtrennung des freien vom gebundenen Liganden wurde eiskalter 10 mM TRIS HCl Puffer, pH 7.4, versetzt mit 10 % (w/v) Polyethylenglycol 6000, 20 mM MgCl₂ bemrtzt (3.5 ml), die Probe verdünnt, über einen Glasfaserfilter unter Vakuum abgesaugt und zweimal die Glasfaserfilter mit 3.5 ml desselben Puffers nachgewaschen. Anschließend wurde die partikelgebundene Radioaktivität, die auf dem Filter retiniert wurde, gemessen.

Die erfindungsgemäßen markierten Derivate sind besonders vorteilhafte Mittel zur Arzneimittelausprüfung durch in-vitro-Teste und eignen sich zur autoradiographischen Darstellung von Arzneimittelrezeptor-

-yf-

bindungsstellen und zur Blutplasmaspiegelbestimmung von calciumkanalwirksamen Arzneimitteln wie Ca-Antagonisten.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile sind wie folgt:

•^I-markierte Liganden sind für Anwendungsgebiete, wie von uns beschrieben, im Vergleich zu tritiierten Verbindungen zu bevorzugen, da

125

1. die spezifische Radioaktivität des I wesent-

lieh höher (bis zu 100-fach) als die für Tritium ist,

2. die Radioaktivität billiger bestimmt v/erden kann (keine Scintillatoren),

3. kein organischer Lösungsmittelabfall wie beim Tritium beseitigt werden muß,

4. höhere Empfindlichkeit im Radiorezeptorassay erzielt wird,

5. die Entsorgung des radioaktiven Abfalls wegen der kürzeren Halbwertszeit des ^D1 (60 Tage versus 12 Jahre) unproblematischer ist,

6. kürzere Expositionszeiten (statt 30 - QO Tagen nur 1-2 Tage) für die autoradiographische Darstellung benötigt werden,

7. die Herstellung'im technischen Haßstab möglich und außerdem einfach und reproduzierbar ist und

-IA-'S.CT-

8. die Kosten für die Herstellung weit unter denen der tritiierten Verbindungen liegen.

Stellt man unsymmetrische 1,4-Dihydropyridinderivate her, indem man Verbindungen synthetisiert, bei denen

1 ρ
die Reste R und R nicht gleich sind, entsteht ein Racemat. Die wegen der beiden möglichen Konfigurationen am C/-Atom des Dihydropyridinringes anfallenden Diastereomeren können nach den üblichen bekannten Methoden getrennt werden. Je nachdem, ob beide der Konfigurationen oder nur eine radioaktiv markiert werden sollen, kann man die Auftrennung vor oder nach der Umsetzung mit dem Succinimidester ausführen. Besonders vorteilhaft ist jedoch eine vorherige Auftrennung des Gemisches, um gezielt jeweils die gewünschte Form markieren zu können. Der besondere Vorteil besteht darin, daß die beiden Diastereomeren unterschiedliches Bindungsverhalten gegenüber Rezeptoren aufweisen, so daß Unterscheidungen möglich sind.

Die Erfindung wird in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.

-Vj-

Beispiel 1

1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4(2-trifluoromethylphenyl)-3,5-dicarboxylat-(2-Amino)äthylester-pyridin wird mit "¹²^I einfach markiertem Monoiodo-succinimidester nach folgender Gleichung umgesetzt:

H₂N(H₂C)₂OOC

CH

— CF

COO-(CH₂)₂-NH₂

CH

+ 2

N-OH

BAD ORIGINAL

Der Succinimidester wurde nach Bolton and Hunter (Biochem. J. (1973) 133, 529-533) hergestellt oder alternativ von Amersham-Buchler (Braunschweig) mit einer spezifischen Aktivität von ca. 2.200 Ci/mMol bezogen.

Herstellung von ¹²^Iocto |j ,4-Dihydro-2^ 6-dimethyl-4-(2-frifluoromethylphenyl)-3,5-dicarDoxylat-(2-(1-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)-3-oxo-propyl)amino)-äthylester-pyridin] (unter Na-Licht): j 10 0.3O ni'iol (-¹ImCi) dos Succinimides te rs (in Benzol)

wird unter Stickstoffstrom getrocknet und 2.5 nKol des 1,4-Dihydropyridinaminoäthylesters in 5 μΐ absolutem Ethanol dazugegeben. Nach Zugabe von 5 μΐ 100 inMol/1 \ Natriumboratpuffer (pH 8.4) und Inkubation für '15 20 Minuten auf Eis werden die Reaktionsprodukte prä-

parativ mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Natriumlicht getrennt. Als Fließmittel wurde Essigsäureethylester, Diethyläther (30:70 v/v) verwendet und als Träger Silikagel 60 (Merck AG, Darmstadt). Das jodierte 1,4-Dihydropyridinderivat läuft in diesem Fließmittel, während der nicht umgesetzte 1,4-Dihydropyridinaminoäthylester am Start hängenbleibt. Das erfindungsgemäße Derivat wird mit absolutem Ethanol extrahiert und entweder in Benzol oder absolutem ! 25 Ethanol bei -20 C aufbewahrt (unter Sauerstoffab- : Schluß und vor Licht geschützt). Somit besitzt das ⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat, welches mit guter Ausbeute (40 - 10 %; Mittelwert - Standardabweichung aus '; 3 Ansätzen, der eingesetzten Radioaktivität) erhalten : 30 wird, die spezifische Aktivität entsprechend der des eingesetzten Succinimidesters (ca. 2.200 CiyfnMol), d.h. 4.400 Ci/mMol. Die überprüfung auf radiochemische Reinheit erfolgte mit gängigen Verfahren (HPLC, Dünnschicht-Chromatographie).

! 8AD ORIGINAL

"33 41 8 O -yt-

Beispiel ?.

1,4-Dihydro-2,6-dimethy1-4 -(2-trifluoromethy!phenyl)-3-carboxylatäthylester - 5 -carboxylat-(2-amino)-äthyle ster-i· pyridin wird mit ' I einfach markiertem Monoiodosuccin- j j 5 imidester umgesetzt. Der Succinimidester ist der gleiche J wie in Beispiel 1 und hat eine spezifische Aktivität von ca. 2.200 Ci/mMol :

Herstellung von ¹²⁵IOdO [i ,/j-Dihydro-2,6-dii.icthyl-4(2-trifluoromethylphenyl)-3 -carboxylatäthylester — 5-carboxylat-(2-(1-(3-iodo-4 hydroxyphenyl)-3-oxopropyl)amino)-äthylester-pyridinjunter Na-Licht: Es wird im-wesentlichen wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch pro Mol Amino äthyle :■■ tor nur 1 KoI Succinimide ster eingesetzt.

15- 0.45 nMol (^ImCi) des Succinimide ster s (in Benzol) wird unter Stickstoffstrom getrocknet und 2.5 nMol des 1,4-Dihydropyridinaminoäthylesters in 5 μ! absolutem Ethanol dazugegeben. Nach Zugabe von 5 jul 100 mMol/1 Natriumboratpuffer (pH 8.4) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis v/erden die Reaktionsprodukte prä parativ mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Natriumlicht getrennt. Als Fließmittel wurde Essigsäureethylester, Diethylether (30:70 v/v) verwendet und als Träger Silikagel 60 (Merck AG, Darmstadt). Das jodierte j 25 1,4-Dihydropyridin hat einen Rp-Wert von 0.35 in diesem Fließmittel, während der nicht umgesetzte 1,4-Dihydropyridinaminoäthylester am Start hängenbleibt. Das erfindungsgemäße Derivat wird mit absolutem Ethanol extrahiert und entweder in Benzol oder absolutem

Ethanol bei -20° C aufbewahrt (unter Sauerstoffab-

<1 ΛΓ

schluß und vor Licht geschützt). Somit besitzt das -⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat, welches mit guter Ausbeute (40 - 10 %; Mittelwert - Standardabv/eichung aus 3 Ansätzen, der eingesetzten Radioaktivität) erhalten wird, die spezifische Aktivität entsprechend der des eingesetzten Succinimidesters (ca. 2.200 CiyfnMol), d.h. 2.200 Ci/mMol. Die Überprüfung auf radiochemische Reinheit erfolgte mit gängigen Verfahren (HPLC, Dünnschichtchromatographie) .

Verwendung des zuvor hergestellten Derivats zur Arzneimittelausprüfung:

125
Aliquote des erhaltenen und I-markierten 1,4-Dihydropyridins werden im Stickstoffstrom getrocknet, mit Puffer (50 mM TRIS-HCl, pH 7.4 versetzt mit dem Proteaseninhibitor (0.1 mMol/l) Phenylmethylsulfonylfluorid) und Membranfraktionen aus Meerschweinchenhirn, Herzmuskel und Skelettmuskel (zubereitet, wie beschrieben in Drug Development 9 : 63-98 (1983); Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 321 : 80-83 (1983) und FSBS Lett 148 : 331-337 (1982)) bei 25° C in 0.1 ml

j Volumen bis zum Erreichen des Gleichgewichtes inkubiert

und die spezifische Bindung (definiert als Unterschied

j in der Bindung des ^I-markierten 1,4-Dihydropyridins

j 15 in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 μΜοΐ/l Nimodipin)

mit Hilfe der Filtrationstechnik (zur Trennung von ge-

125
bundenern und freiem "Ί-markierten 1,4-Dihydropyridin) gemessen. Zur Abtrennung des freien vom gebundenen Liganden wurde eiskalter 10 mM TRIS HCl Puffer, pH 7.4, versetzt mit 10 % (w/v) Polyethylenglycol 6000,

20 mM MgCl₂ benutzt (3.5 ml)» die Probe verdünnt, über ein Glasfaserfilter unter Vakuum abgesaugt und zweimal die Glasfaserfilter mit 3.5 ml desselben Puffers nachgej waschen. Anschließend wurde die partikelgebundene Radioaktivität, die auf den Filtern retiniert wurde, gemessen.

. Abbildung 1 a zeigt beispielhaft die Saturationsanalyse \ (Konzentrationsbereich des freien, ^I-markierten 1,4-

■ Dihydropyridinderivates: 17-1276 pMol/l) der 1,4-

■ · Dihydropyridinrezeptoren in Meerschweinchenhirnmembranen 30 (20 lig Membranprotein pro Versuchsansatz) mit Hilfe des

Λ or ~ ^l

■ I-markierten 1,4-Dihydropyridinderivates.

; In Abbildung 1 a ist die gemessene Abhängigkeit der Konzentration des gebundenen Liganden von der Konzentration des freien Liganden aufgetragen, in 1 b

, 35 die Transformation der Bindungsdaten nach G. Scatchard

--20- j

I (Ann.N.Y. Acad Sei. 51, 660-672, 194g),'wobei B = I Konzentration des gebunden Liganden, F = freier Ligand, K₀ die Dissoziationsgleichgewichtskonstante und B die Konzentration der hochaffinen Bindungsstellen im 5 Versuchsansatz ist. Zur Berechnung der Konzentration des

freien Liganden wurde folgende Formel benutzt: j (T . a) - B , wobei T die totale Konzentration des I Liganden, a ein Faktor, der die Bindungsfähigkeit des

j Liganden beschreibt, und B die Konzentration des spezi-

J10 fisch gebundenen Liganden im Gleichgewicht ist. Der Faktor a wurde experimentell durch AufSättigung des

j radioaktiven Liganden mit Bindungsstellen (Rezeptoren)

; bestimmt (beschrieben in FEBS Lett. 148, 331-337, 1902;

j. Naunyn Schmiedeberg¹ s Arch Pharmacol 321, 7-10, 1982).

' 15 Der Faktor "a" war für das asymmetrische 1,4—Dihydro-

j pyridinderivat 0.5, in Übereinstimmung mit der

i theoretisch geforderten Fähigkeit des Rezeptors (R) und ! (S) Enantiomere des I-markierten. 1,4-Dihydropyridins

zu unterscheiden (Stereospezifitüt der Bindung). Das : 20 I-markierte 1,4-Dihydropyridin ist das racernische

Gemisch von (R) und (S) Enantiomeren. Für Muskelmem- ! branen (nicht dargestellt) wurde eine Dissoziations- ^; konstante von 350 pmol/l (25°C) gefunden. Die'Stabilität : des I-markierten 1,4-Dihydropyridins wurde unter ; 25 folgenden Bedingungen mit gängigen Verfahren (HPLC,

Dünnschichtchromatographie) überprüft: Puffer 50 mM j TRIS HCl, pH 7.4, 25°C, 4 Stunden; Muskelmembranen in ' Puffer, 25⁰C, 4 Stunden; sowie Aufbewahrung in Benzol

oder absolutem Ethanol bei -20° C für bis zu 21 Tagen I 30 nach der Herstellung des Liganden. In keinem Fall waren i die radiochemischen Verunreinigungen größer als 10 /ά.

Schlußfolgerung:

Dac I-markierte 1,4-Dihydropyridin bindet mit einer Dissoziationskonstante von unter 1 nHol/1 bei 25^eC an

Bad

-24-

Meerschweinchenhirnmembranen und Skelettmuskelinembranen. Es ist von ausreichender Stabilität.

Beispiel 3:

In analoger Weise wie in Beispiel 2. wurde ein 1,4-Dihydrochinolinderivat hergestellt.

1,4 Dihydro-2-methyl-4-(2-trifluoromethylphenyl)-3-chinolincarboxylat-(2-a.mino)öthylester wird mit dem gleichen Succinimidester wie in Beispiel 1 umgesetzt.

Die Reaktionsprodukte werden mittels Dünnschicht-Chromatographie unter Natriumlicht getrennt. Das abgetrennte erfindungsgemäße Derivat wird mit ab-

j solutem Ethanol extrahiert und entweder in diesem ■ Lösungsmittel oder Benzol bei -20° C unter Ausschluß von Licht und Sauerstoff für die Verwendung aufbewahrt. Die spez. Aktivität des eingesetzten Succinimidesters von etwa 2.200 Ci/mMol wurde übertragen. Die r&diochemische Reinheit wurde chromatographisch überprüft.

Beispiel H>

20 Tabelle 1 zeigt Ergebnisse von Kompetitionsexperimenten. Die Daten

j der Tabelle 1 sind Mittelwerte (± asymptotische Standard-

! abweichung) aus 3 unabhängigen Experimenten in denen verschiedene

Calciumantagonisten und Derivate oder Vorstufen von Calciumantagonisten mit dem aus Beispiel % erhaltenem ¹²⁵I -markiertem 1,4 ?-^lj> Dihydropyridin ("Ligand") als'Kompetitoren eingesetzt werden. Als

-32-

Rezeptormaterial dienten Meerschweinchenskelettmuskelmembranen. Die Konzentration des markierten Liganden war 20-30 pmol/1, die Versuchstemperatur war 25°C. 6-9 verschiedene Konzentrationen der überprüften Stoffe wurden eingesetzt (jeweils als Duplikat) und die gemessenen Bindungsdaten mit Hilfe eines Computerprogramms (DeLean A, Munson PJ, Rodbard D (1978). Simultaneous analysis of families of sigmoid curves: application to bioassay, radioligand assay and : physiological dose-response curves. Am J. Physiol. 4 E97-E102) I optimal angepasst. Es wurden, als wichtiges Kriterium für die

1 ?R

110 Rezeptorbindung des I -markierten 1,4-Dihydropyridins in der

i Gruppe 1 die Stereospezifität der Bindung für chirale 1,4-

j Dihydropryridine untersucht. In der Gruppe 2 finden sich zwei 1,4-

; Dihydropyridine, die Calciumkanäle aktivieren können, in der Gruppe

¹ 3 zwei 1,4-Dihydropyridine, die als Calciumkanalblocker nur schwach

j 15 wirksam sind, in der Gruppe 4 die Enantiomeren des Verapamils und

i des Methoxyverapamils, in der Gruppe 5 zwei Diastereoisomere des

^: Diltiazems, in der 6. Gruppe ein inorganischer Calciumantagonist.

i Der IC_rn Wert ist die Konzentration des Stoffes, die 50% Hemmung

bU
der spezifischen Bindung des Liganden im Radiorezeptorassay

;:ü bewirkt. Im Falle des d-cis-Diltiazems wurde bei 37°C gemessen und der EC_cn Wert bestimmt. Der EC₁.,, Wert ist die Konzentration des Stoffes, die halbmaximal die spezifische Bindung des Liganden stimuliert.

Schlußfolgerung: Das 125i -markierte 1,4-Dihydropyridin ("Ligand")

£5 ist für den Radiorezeptorassay verwendbar.

334Τ8Ό6

-23-

TABELLE 1
BINDUNGSKONSTANTEN FÜR UNMARKIERTE VERBINDUNGEN

ERMITTELT MIT DEM IM BEISPIELE HERGESTELLTEN ¹²⁵I -markierten 1,4-

Dihydropyridin.

GRUPPE STOFF IC₅₀ nmol/1

(+)205-033	2 ΐ	0.05
(-)205-034	198 ±	40
1. (-)Bay e 6927	3 ±	0.04
(+)Bay e 6927	420 ±	67
(+)Nicardipine	7 +	0.8
(-)Nicardipine	42 ±	3

2. Bay K 8644 37 ΐ 5

CGP 28392 1250 ± 180

T. Bay M 5579 1860 ± 3~ÖÖ~

Vo 2605 320 ± 35

4.

(-)Methoxyverapamil	21	±	8
(+JMethoxyverapami1	190	+	50
(-)Verapamil	98	±	22
(+)Verapamil	54	+	12

5. d-cis-Diltiazem 960 t 310 1-cis-Diltiazem 3000 + 1600

6. La³⁺ 110000 t 20000

Die einzelnen Stoffe waren:

(+) 205-033: (+) Enantiomer des PN 200-110 (isopropyl 4-(2,1,3-

benzoxadiazol^-yU-i^-dihydro^.o-dimethyl-S-methoxycarbonyl- |

j 5 pyridine-3-carboxylate) j

5 (-) 205-034: (-) Enantiomer des PN 200-110 (isopropyl 4-(2,1,3- ί

benzoxadiazol-4-yl)-1,4-dihydro-2,6-dimethyl-5-methoxycarbonyl- \ pyridine-3-carboxylate) ^;

(+) Bay e 6927: (+) Enantiomer des Bay e 6927 (isopropylmethyl 1,4- | 10 dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate) 10 (-) Bay e 6927: (-) Enantiomer des Bay e 6927 (isopropylmethyl 1,4-

j dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate) i ' (+) Enantiomer des Nicardipins (2,6-dimethyl-4-(3 nitrophenyl)-1,4- j

i dihydropyridine-S.S-tJicarboxylic acid 3-2(N-benzyl-N-methylamino)-

15 ethylester 5-methylester) j

ι . ι

i15 (-) Enantiomer des Nicardipins (2,6-dimethyl-4-(3 nitrophenyl)-1,4- ; i !

^! dihydropyridine-S.ö-ciicarboxylic acid 3-2(N-benzyl-N-methylamino)- j

ethylester 5-methylester) I

j !

j Bay K 8644: 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-trifluorometylphenyl)-3,5 , ! 20 pyridinecarboxylicacid 2-(aminoethyl)ethylester

; 20 CGP 28392: (4-(2-difluormethoxy)phenyl-1,4,5,7-tetrahydro-2-methyl- ; 5-oxofuro(3,4-b)pyridine-3-carboxylic acid ethylester Bay M 5579: Nitrendipinderivat mit freier Carboxylgruppe (siehe

j TIPS 3: 431-437; 1982) . ^;

^! 25 VO 2605: Bromderivat des PN 200-110 (siehe Drug Development 9: 63- \ '''Vj 98; 1982)

Beispiel 5 :

Abbildung 2 zeigt eine Eichkurve zur Bestimmung des 1,4-Dihydropyridins Nitrendipin im menschlichen Plasma. Hierzu wurde EDTA-Plasma einer nüchternen Versuchsperson mit Nitrendipin versetzt und mit Plasma ausverdünnt. Die verschiedenen Plasmaverdünnungen (10 ul) v/erden in einem Versuchsansatz von 0.25 ml mit Skelettmuskelmembranen (Meerschweinchen) (20 pg Protein) und dem I-markierten 1,4-Dihydropyridinderivat (20 pH, hergestellt wie in der Beschreibung dargestellt) versetzt und die spezifische Bindung nach Einstellung des Gleichgewichtes (2 Stunden) mit Hilfe der üblichen, in Beispiel 2 erläuterten Filtrationsmethode gemessen. Mit der üblichen Methode der logit-log Transformation (D.Rodbard and G.R. Frazier in: Methods in Enzymology, Vol. 37, Part B, eds. O'Malley and J.G. Hardman, Academic Press, Kev; York, San Francisco, London, -ppi-22, 1975) wurden die Daten der spezifischen Bindung (Punkte) gegen die im Originalplasma vorgelegte Nitrendipinkonzentration auf-O getragen. Die erhaltene Standardkurve (ausgezogene Linie) ist eine Gerade für die Nitrendipinkonzentrationen, die

125
die spezifische Bindung des I-markierten Liganden in Vergleich zum Leerplasma (= Plasma ohne Kitrendipin) zu 15 bzw. G5 /ό hemmen.

Schlußfolgerung:

125
Das I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat erlaubt die Bestimmung von Calciumantagonisten im Blutplasma mit Hilfe des liadiorezeptorassays. Die Empfindlichkeit ist ausreichend, da die üblichen therapeutischen Konzentrationen, z.B. für das 1,4-Dihydropyridinderivat Nifedipin zwischen 70 und200 nMol/l Plasma liegen.

! Die Beispiele zeigen die Herstellung und Verwendung der ; erfindunesgemäßen 1,4-Dihydropyridinderivate als Prüf-I rcagenz zum Ausprüfen von Arzneimitteln. Eine analoge Wirkung wurde für die erfindungsgemäßen 1,4-Dihydro-

5 chinolinderivate gefunden. Durch die Möglichkeit der

125 unterschiedlichen Zahl von I-Substituentcn am Rest

j R"'^c, nämlich ein- oder zweifach, und die bei den

symmetrischen Dihydropyridinderivaten noch vorhandene • Möglichkeit 1 oder 2, Moleküle Succinimidester mit ι 10 einem Molekül Dihydropyridincarbonsäureesterderivst : umzusetzen, eröffnet das erfindungsgemäße Verfahren ' in jedem Falle eine ausreichende Markierung und ihre i Anpassung an die strukturspezifischen Erfordernisse,

um stabile Verbindungen zu synthetisieren. ■

; 15 Die Rezeptoren sind in der Lage, nur bestimmte Molekülstrukturen zu binden. Die große Auswahl von Substitutionsmöglichkeiten am 1,4-Dihydropyridin- und am 1 ,4-Dihydrochinolingrundkörper erlaubt es, für alle üblichen und ^: bekannten Rezeptoren dieser Stoffklasse zur Bindung ge- ■ 120 eignete -^!-markierte Verbindungen herzustellen. i

Claims

Patentanwälte

Dr. Michael Hann

Dr. H.-G. Sternagel

Marburger Straße 38 (I67O) St/Is

63OO Gießen

Prof. Dr. med. Hartmut Glossmann Margeritenweg 4, D-63OI Heuchelheim

RADIOAKTIV MIT ¹²⁵I-MARKIERTE 1,4-DIHYDRO-PYRIDINDERIVATE UND 1,4-DIHYDR0CHIN0LIN-DERIVATE, IHRE HERSTELLUNG UND IHRE VER-WENDUNG ZUR AUSPRÜFUNG VON ARZNEIMITTELN

Patentansprüche

Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyrinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate, gekennzeichnet durch die 1,4-DihydropyridLinderivate der allgemeinen Formel

und die 1,4-Dihydrochinolinderivate der allgemeinen Formel

II

1 2
in denen R und R gleich oder verschieden

sind und R¹ eine -4A)-NH-C-(Y)-R^x Gruppe, in der A und Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen und

R^x ein in p-Stellung, nicht mit Halogen substituierter Phenylrest oder ein in 4-Stellung angefügter Imidazolrest ist,

1 2 und wenn R nicht R ist,

R² NO₂, Nitril oder Alkoxy mit 1-4 Kohlenstoffatomen,

■ζ λ
R-^ und R gleich oder verschieden sind mit

H, NHp oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1-4 Kohlenstoffatomen R ein Arylrest, der ggfs. 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der

Gruppe Alkyl-, Alkoxy, Phenyl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält , vorzugsweise ein Phenyl-, Naphthyl, Thenyl- oder Furylrest ist,

RH, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten,

χ 125

und in denen der Rest R noch mit ^J Jod ein oder zweifach substituiert ist und die spezifische Aktivität etwa 2.200 - etwa 8.800 Ci/mMol beträgt.

2. Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R^x

125 I /125 I

oder-/ Y_0H

^N 125 I

\ NH ist.

3. Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate nach Ansprüchen 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet, daß

R-^ ein Phenylrest ist, der ggfs. ein oder zweifach substituiert ist.durch Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Fluor, Chlor, Brom.

-4-

4. Verfahren zur Herstellung von radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivaten und 1,4-Dihydrochinolinderivaten,

dadurch gekennzeichnet, daß man 1^-Dihydropyridincarbonsäureester der Formeln

η
R²OOC -ff ])~βΘΘ-(Α·>-ΝΗ₂ III

oder

R⁵ H

ν/

N-4 A) OOGtf^^i -COO (A-HNH₂ IV

oder 1^-Dihydrochinolincarbonsäureester der Formel

^ R³

in denen

R NO₀, Nitril oder Alkoxy mit 1-4 Kohlenstoffatomen,

•ζ 4
R-^ und R gleich oder verschieden sind und H, NH.

oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1-4 Kohlenstoffatomen, A eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, R-^ ein Arylrest, der ggfs. 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Alkyl-, Alkoxy-, Phenyl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, vorzugsweise ein Phenyl-, Naphthyl-, Thenyl oder Furylrest ist,

R H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest "bedeuten,

1 pR
mit -'Ί-markierten acylierenden Verbindungen mit einer spezifischen Aktivität von 2.200 4.400 Ci/mMol der Formel

- O - C - (Y) - R^x

W 0

in der (Y) eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist und R ein in p-Stellung, nicht mit Halogen substituierter Phenylrest oder ein in 4-Stellung angefügter

Imidazolrest, der noch mit ^J1 ein oder zweifach substituiert ist

in einem Lösungsmittel unter Kühlung im Dunkeln umsetzt und die radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivate oder die 1,4-Dihydrochinolinderivate mittels präparativer DünnschichtChromatographie oder HPLC abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 4,

d a.d urch gekennzeichnet, daß in den acylierenden Verbindungen R""

„^125 I /125 I ^125

_Λ>-0Η oder-/ J-^₃ oder.^ \_0H

^N125

oder—/ / ^N3 ^0<ier 25 "125 I

Verfahren nach Ansprüchen 4 oder 5, d-adurch gekennzeichnet, daß

R^ ein Phenylrest ist, der ggfs. ein oder zweifach substituiert ist durch Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Fluor, Chlor, Brom.

7. Verwendung der radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate nach Ansprüchen 1-6 zur Ausprüfung von Arzneimitteln mit Hilfe von Rezeptoren durch Radiorezeptorassays.

8. Verwendung nach Anspruch 7 in in-vitrο-Prüfungen zur autoradiographischen Darstellung von Arzneimitte Irezeptorbindungsstellen.

9· Verwendung nach Anspruch 7 in in-vitrο-Prüfungen zur Plasmaspiegelbestimmung von calciumkanalwirksamen Arzneimitteln.