DE3341806C2

DE3341806C2 - Radioaktiv mit ↑1↑↑2↑↑5↑I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Ausprüfung von Arzneimitteln

Info

Publication number: DE3341806C2
Application number: DE3341806A
Authority: DE
Inventors: David R. 6300 Gießen Ferry; Hartmut Prof. Dr.med. 6301 Heuchelheim Glossmann
Original assignee: Glossmann, Hartmut, Prof.Dr.med., 6301 Heuchelheim
Priority date: 1983-11-19
Filing date: 1983-11-19
Publication date: 1987-01-08
Also published as: JPS6224423B2; GB2150137B; FR2555175A1; GB2150137A; GB8429054D0; JPS60123470A; FR2555175B1; DE3341806A1; US4784958A

Abstract

Ein einfaches Verfahren zur Herstellung von hochradioaktiven, mit ↑125I-markierten, 1,4-Dihydropyridin- und 1,4-Dihydrochinolinderivaten ermöglicht es, spezifische Radioaktivität: ca. 2200-8800 Ci/mMol zu erreichen. Dadurch wird hohe Empfindlichkeit beim Arzneimittelscreening mit Hilfe des Radiorezeptorassays, bei der Bestimmung von Plasmaspiegeln von 1,4-Dihydropyridin, 1,4-Dihydrochinolinen und anderen Stoffen, die mit Rezeptoren für 1,4-Dihydropyridine und 1,4-Dihydrochinoline wechselwirken, erreicht, so daß eine wesentlich kürzere Expositionsdauer bei der autoradiographischen Darstellung der Rezeptoren für diese Stoffe erzielt wird. Hierzu wird ein Aminoderivat eines 1,4-Dihydropyridins oder 1,4-Dihydrochinolins mit einem acylierenden Reagens, welches mit ↑125I radioaktiv (2200-4400 Ci/mMol) markiert ist, umgesetzt und das ↑125I-substituierte 1,4-Dihydropyridin- oder 1,4-Dihydrochinolinderivat, welches die spezifische Radioaktivität des acylierenden Reagens besitzt, durch übliche, bekannte Trennverfahren isoliert.

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft hochradioaktiv mit ¹²⁵I markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate, ihre Herstellung durch Umsetzung von an Estergruppen endständig eine Aminogruppe tragenden 1,4-Dihydropyridinestern oder 1,4-Dihydrochinolinestern mit ¹²⁵I markierten acylierenden Verbindungen und die Verwendung der durch präparative chromatographische Methoden abgetrennten Verbindungen zur Ausprüfung von Arzneimitteln oder anderen Stoffen mit Hilfe von Rezeptoren (Xrzneimittelscreening mit Hilfe des Radiorezeptorassays) und zur Plasmaspiegelbestimmung von calciumkanalwirksamen Arzneimitteln.

Dadurch ist auch eine rasche autoradiographische Darstellung von Rezeptorbindungsstellen von Arzneimitteln und anderen Stoffen, die mit 1,4-Dihydropyridin- oder 1,4-Dihydrochinolinbindungsstellen (Rezeptoren) wechselwirken, möglich.
Unter dem Oberbegriff organische Calciumantagonisten (A. Fleckenstein: Calcium Antagonism in Heart and Smooth Muscle, John-Wiley and Sons, New York, Clinchester, Bristone, Singapure, 1983; D. J. Triggle: Calcium Antagonists: Basic Chemical and Pharmacological Aspects (pp i —18) in G. B. Weiss (Editor): New Perspectives on Calcium Antagonists, American Physiological Society, Bethesd'l. Maryland USA, 1981; D. ]. Triggle: Chemical Pharmacology of Calcium Antagonists (pp 17—38) in R. G. Rahwan and D. T. Witiak (eds.): Calcium Regulation by Calcium Antagonists. ACS Symposium Series 201. American Chemical Society, Washington DC (1982) werden Stoffe zusammengefaßt, die als Therapeutika beim Menschen angewendet werden und zur Zeit folgende Anwendungsgebiete haben: Angina pectoris, supraventrikuläre Tachykardie, ventriculäre .Herzrhythmusstörungen, Vorhofflattern und Vorhofflimmern, erhöhter Blutdruck, und für folgende mögliche Anwendungsgebiete genannt werden: Cerebrale Insuffizenz und Vasospasmus, pulmonaler Hochdruck, Asthma bronchiale, Frühgeburt, Dysmenorrhoe, Kardioprotection, Arteriosklerose und Blockade der Freisetzung von sogenannten Mediatoren (Thromboxan A2) bei allergischen, entzündlichen oder mit Aggregation der Blutplättchen einhergehenden Erkrankungen (A. Fleckenstein in: Calcium Antagonism in Heart and Smooth Muscle, 1983 und R. A. Janis and D. J. Triggle in: New Developments in Ca²⁺ Channel Antagonists. J. Med.Chem.26,775—785,1983).

Die therapeutisch verwendeten bzw. in klinischer Erprobung oder in Entwicklung befindliche Calciumantagonisten gehören verschiedenen chemischen Stoffklassen an. Von den bisher bekannten Calciumantagonisten sind die 1,4-Dihydropyridine und 1,4-Dihydrochinoline die weitaus wirksamsten.

Schon in Konzentration von 10-'°— &Igr;&Ogr;-⁹ Mol/l blockieren diese Stoffe den Durchtritt von Calcium durch die Calciumkanäle der Zellmembran der glatten Muskulatur (A. Fleckenstein, 1983; D. J. Triggle, 1981,1982; R. A. Janis and D. J. Triggle, 1983). Im Falle chiraler 1,4-Dihydropyridine ist die Blockade stereoselektiv (Towart, R, Wehinger, E. and Meyer, H. (1981): Effects of unsymmetrical ester substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and their optical isomers on contraction of smooth muscle. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 317: 183—185; Towart R, Wehinger, E, Meyer, H, Kazda, S. (1982): The effects of nimodipine, its optical isomers and metabolites on isolated vascular smooth muscle. Arzneim. Forsch. (Drug Res) 32:338—346).

Die Publikationen (Glossmann, H, Ferry, D. R, Lübbecke, F, Mewes, R^ Hofmann, F. (1982): Calcium channels: direct identification with radioligand binding studies. TIPS 3: 431—437; Glossmann, H. and Ferry, D. R.

(1983): Molecrlar approach to the calcium channel. Drug Development 9: 63—98; Janis, R-A, Triggle, D. j. (1983): New developments in Ca²⁺ channel antagonists. J. Med. Chem. 26: 775—785; Janis, R. A, Scriabine, A. (1983): Sites of action of Ca²⁺ channel inhibitors. Biochem. Pharmacol, (in press); Ferry, D. FL, GoIl, A, Glossmann, H. (1983): Differential labelling of putative skeletal muscle calcium channels by ³H-nifedipine, ³H-nitrendipine, ³H-nimodipine and ³H-PN 200-110. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 323: 276—277; BeIIemann, P, Ferry, D. R, Lübbecke, F, Glossmann, H. (1981); ³H-Nitrendipine, a potent calcium antagonist binds with high affinity to cardiac membranes. Arzneim-Forsch (Drug Res) 31:2064—2067; Ferry. D. R, Glossmann, H. (1932a): Identification of putative calcium channels in skeletal muscle microsomes. FEBS Lett 148: 331 —337; Ferry, D. R^ Glossmann, H. (1982b): Evidence for multiple drug receptor sites within the putative calcium channel. Naunyn-Schmiedebergs Arch. PharmacoL 321: 80—83) beschreiben z.T. in Obersichtsartikeln die Verwendung tritiierter (spezifische Aktivität ca. 3 bis ca. 160 Ci/mmol) 1,4-Dihydropyridine zur Charakterisierung der Bindungsstellen (Rezeptoren) für diese Pharmaka. Tritiierte 1,4-Dihydropyridine können nach diesen Erkenntnissen zum in vitro Screening von neuen Stoffen, zur Abklärung von bestimmten Nebenwirkungen bekannter Arzneimittel oder zur Plasmaspiegelbestimmung von Calciumantagonisten verwendet werden (Beispiele: R. J. Gould, K. M. M. Murphy, I. J. Reynolds and S. H. Snyder: Tnioridazine: Calcium channel blockade may explain peripheral side effects. American J. Psychiatrics (in press) and R. J. Gould, K. M. M. Murphy and S. H. Snyder: A simple radioreceptor assay for calcium antagonist drugs. Life Sciences (in press)). Ferner werden die tritiierten 1,4-Dihydropyridine zur autoradiographischen Darstellung ihrer Rezeptoren benutzt (z. B. Quirion, R. (1983): Autoradiographic localization of a calcium channel antagonist, ³H-nitrendipine, binding site in rat

brain (Neuroscience Lett 36:267—271).

Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik und den geltenden Bestimmungen zur Beseitigung radionkiivcii Abfalls sind tritiierte Verbindungen für die obengenannten Anwendungsbeispiele als nicht mehr optimal anzusehen. Nachteile des ³H z. B. gegenüber ¹²⁵I sind die lange Halbwertszeit, die relativ niedrige spezifische Aktivität und damit geringere Empfindlichkeit, die Notwendigkeit organische Scintillatoren zu verwenden, die geringe Zähleffizienz und die lange Expositionsdauer zum Zwecke der Autoradiographie.

ppi Probleme der hochradioaktiven Markierung mit ¹²⁵I von Stoffen, die z. B. als Haptene fungieren und als Liganden in einem Radioimmunoassay eingesetzt werden, sind von J. E. Corrie und W. M. Hunter (Methods in Enzymology Vol. 73, Part B, Eds. J. L. Langone and H. van Vunakis, Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1981, pp 79 —112) erschöpfend dargestellt. Hiernach ist von absoluter Priorität, daß der hergestellte Ligand in dem Anwendungsgebiet analytisch wirksam ist, die radioaktive Markierung reproduzierbar ist, der Ligand niedrige unspezifische Bindung zeigt und für längere Zeit (Tag, Wochen, Monate) stabil aufbewahrt werden kann. Es gibt grundsätzlich drei Wege, um stabile ¹²⁵I-markierte Liganden zu synthetisieren:

l.(und am wenigsten gebraucht) Halogen Austauschreaktionen (z. B. Science 205, pp 1138— 1140[1979]),

2. Einführung des ¹²⁵I in Phenol oder Imidazolderivate mit Hilfe der Chloramin T-Methode nach Greenwood, i iunter und Giover oder elektrolytisch oder mit Hilfe von Lactoperoxidase(sehr häufig gebraucht) und

3. die Einführung der radioaktiven ¹²⁵I über ein Trägermolekül. Bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Aminogiykosidantibiotika. Clonazepam, Biotin, Bleomycin) ist diese dritte Methode, nämlich die Einführung des radioaktiven ¹²⁵I über ein Trägermolekül, z.B. mit ¹²⁵I-markierten N-succinimidyl 3-(4-Hydroxyphenyl)-Propionat, di-¹²⁵l-markiertem Methyl p-Hydroxybenzimidat und '"!-markiertem diazotiertem Anilin nur für Peptide und Proteine oder z. B. für Heparin beschrieben (J. J. Langone in: Methods in Enzymology, Vol. 73, Part B, Eds. J. L Langone and H. van Vunakis, Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1981, pp 112—127).

Die entscheidende Einschränkung der Methode ergibt sich aus der von J. E. Corrie und W. M. Hunter (ebenda) I

geforderten absoluten Priorität der Eigenschaften: Der hergestellte Ligand muß nicht nur radioaktiv, sondern &rgr;

auch analytisch brauchbar sein. Es ist also keinesfalls hinreichend, radioaktives Jod über eines der genannten »

Vi..-fuhren. insbesondere dem Verfahren 3, in ein Molekül einzuführen, sondern das markierte Produkt muß auch z. B. in einem Radioimmunoassay von einem gegen ihn gerichteten Antikörper erkannt und mit ausreichender Bindungsfestigkeit gebunden werden können. Je kleiner das radioaktiv zu markierende Molekül ist, desto schw ieriger wird es sein, die strukturellen Erfordernisse, insbesondere für spezifische Bindungsstellen (Rezeptoren) der Arzneimittel zu erfüllen, wenn mit Hilfe der Methode 3 über Einführung eines Trägermoleküls ein relativ großer, radioaktiver Substituent die Struktur verändert. Diese Schwierigkeiten erklären, daß hochradioaktiv mit ¹²³I markierte 1,4-Dihydropyridine und 1.4-Dihydrochinoline. die die erforderlichen Kriterien erfüllen, bisher nicht existieren.

Aufgabe der Erfindung ist es, neue ¹²⁵l-markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate zu schaffen, die aufgrund ihrer Struktur hochaffin an Rezeptoren für Pharmaka dieser Stoffklasse in verschiedenen Geweben binden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate der nachstehend angegebenen allgemeinen Formeln:

45 R^:OOC·—/ V-COOR¹ (D

50

und die 1.4-DihydrochinoIinderivate der allgemeinen Formel

R⁵ H

COOR¹ (H)

R₆ H

in denen R¹ und R² gleich oder verschieden sind und R' eine
O

I!

—fA I—NH — C —(Y)— RMjruppe,

in der A und Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen und

R" ein in p-Stellung, nicht mit Halogen substituierter Phenylrest oder ein |,i 4-StelIung angefügter Imidazolrest

ist, und wenn R¹ nicht R² ist,

R² NO2, Nitril oder Alkoxy mit 1 —4 Kohlenstoffatomen,

R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind mit H, NH2 oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1—4

Kohlenstoffatomen,

R⁵ ein Arylrest, der gegebenenfalls 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Alkyl-.

Alkoxy, Pheayl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, vorzugsweise ein Phenyl-.

Naphthyl, Thenyl- oder Furylrest ist,

R⁶ H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten,

und in denen der Rest R* noch mit ^l25Jod ein oder zweifach substituiert ist und die spezifische Aktivität etwa 2200

bis etwa 8800 Ci/mMol beträgt.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere ihre Herstellung und Verwendung, sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die radioaktive Markierung mit ¹²⁵I erfolgt durch Einbringen eines mit radioaktivem Jod ein oder zweifach substituierten Phenylrestes oder Imidazolrestes an bestimmten Stellen der 1,4-Dihydropyridin- bzw. 1.4-Dihydrochinolinderivate. Der radioaktiv markierte Rest R* ist vorzugsweise ein Rest der Formeln:

OH oder

oder

N₃ oder

OH

N₃ oder

Die dadurch erreichbaren Aktivitäten liegen zwischen etwa 2200 und etwa 8800 Ci/mMol, je nachdem, ob der Rest R^x ein oder zweifach mit ¹²⁵I substituiert ist, und ob in die Pyridinderivate ein oder zwei markierte Reste R^ eingebracht werden. Bevorzugt ist es, eine Aktivität von 2200 bis 6600 Ci/mMol einzustellen. Ganz besonders bevorzugt, weil besonders stabil, sind Derivate mit Aktivitäten von etwa 2200 bis etwa 4400 Ci/mMoi.

Die Synthese der erfindungsgemäßen 1,4-Dihydropyridin-derivate und 1,4-DihydrochinoIinderivate geht von entsprechenden Carbonsäureesterderivaten aus, die an der Estergruppe eine endständige, nicht substituierte Aminogruppe tragen.

Die Herstellung der Grundkörper, sowohl der unsymmetrischen als auch der symmetrischen, ist in DE-OS 21 17 573,23 10 746 und 29 35 451 beschrieben.

Dabei werden Aldehyde der Formel R⁵CHO, in der R⁵ ein Arylrest, der gegebenenfalls 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe der Alkyl-, Alkoxy, Phenyl, Halogen, Nitro, Cyano. Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, wobei Alkyl oder Alkoxy oder Alkylmercapto niedere Gruppen dieses Typs mit 1 —4 Kohlenstoffatomen sind, mit ß-Ketocarbonsäureestern der Formel R⁴CO-CH₂-COOR₂ und Enamincarbonsäureester der Formel

R³—C = CH-COOR⁷

NH,

in Gegenwart von Wasser oder inerten organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen zwischen 30 und 200⁰C umgesetzt.

R⁷ ist in diesen Fällen eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 —6 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Methyl oder Äthyl, die, abweichend von den in den Druckschriften beschriebenen Verbindungen, endständig eine primäre Aminogruppe trägt

R² kann gleich R¹ oder NO₂, Nitril oder Aikoxy mit 1 —4 Kohlenstoffatomen sein.

R³ und R⁴ sind gleich oder verschieden und bedeuten H, NH₂ oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1 —4 Kohlenstoffatomen.

Für die Herstellung der 1,4-Dihydrochinolinderivaiie geht man von 2-Aminobenzylalkoholen der Formel

NH₂

;ius und seizi diese mit /i-Diearbonylverbindungcn der Formel

COR⁷

CH₂

^{0 R3}

in Gegenwart von inerten organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen zwischen 20 und 200°C um. R³, R⁵, R^r haben die vorstehend bereits angegebene Bedeutung. R⁶ ist H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxy mit jeweils 1 —4 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Methyl, Äthyl, Methyloxy oder Äthyloxy.

Als acylierende Verbindungen zum Einbringen des radioaktiv markierten Restes R_x dienen ^l25l-markierte Succinimidester der Formel

/° 9

-< ii

N —O-C-(Y)—R^A

in denen Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit \—6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1, 2 oder 3 C-Atomen ist und R* die bereits angegebene Bedeutung hat, und wobei dieser Rest ein oder zweifach mit ¹²⁵I substituiert ist.

Die Umsetzung erfolgt, wie von J. J. Langone in Methods in Enzymology Vol. 70, S. 221 —243 (1980) beschrieben, unter milden Bedingungen zwischen O⁰C und 25° C innerhalb von 5 oder mehr Minuten in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise irr. alkalischen Bereich. Zum Beispiel unter Zusatz von Natriumboratpuffer, pH 8,4-8,5.

Die Reaktionsprodukte werden präparativ mit Hilfe chromatographischer Verfahren (HPLC oder Dünnschichtchromatographie) getrennt, die erfindungsgemäßen Dihydropyridin- und Dihydrochinolinderivate in Benzol oder absolutem Ethanol aufgenommen und bei —20°C unter Ausschluß von Licht und Sauerstoff gelagert. Die Derivate weisen die spezifische Aktivität des eingesetzten Succinimidesters auf. Diese liegt bevorzugt zwischen 2200 und 4400 Ci/mMol.

Die Überprüfung der radiochemischen Reinheit erfolgt mit gängigen chromatographischen Methoden (HPLC oder DünnschichtjTMit dem gleichen Verfahren kann auch die Prüfung über die erforderliche Stabilität unter den Bedingungen der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Arzne-mittelausprüfung erfolgen.

Dabei werden die ¹²⁵l-markierten 1,4-Dihydropyridin-und 1,4-Dihydrochinolinderivate im sogenannten Rezeptorassay (Puffern, erhöhte Temperatur zv/ischen 25°C und 37°C) und Gewebehomogenaten, Plasma und Membranfraktionen ausgesetzt. Es wird die spezifische Bindung gemessen. Diese ist definiert als der Unterschied in der Bindung des markierten Derivates in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 &mgr;&Mgr;&ogr;&Igr;/l eines Pharmazeutikums vergleichbarer oder analog wirkenden Struktur. Die Trennung von gebundenen und freien ^l2Si-markierten Derivaten erfolgt durch übliche Filtrationstechnik, wie sie beispielsweise beschrieben ist von J. P. Bennett: Methods in binding studies, in: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds H. ]. Yamamura, S. J. Enna und M. J. Kuhar, Raven Press, N. Y. 1978, pp 57-90).

Zur Abtrennung des freien vom gebundenen Liganden wurde eiskalter 1OmM TRIS HCl Puffer, pH 7,4, versetzt mit 10% (w/v) Polyethylenglycoi 6000, 20 mM MgCh benutzt (3,5 ml), die Probe verdünnt, über einen Glasfaserfilter unter Vakuum abgesaugt und zweimal die Glasfaserfilter mit 3,5 ml desselben Puffers nachgewaschen. Anschließend wurde die partikelgebundene Radioaktivität, die auf dem Filter retiniert wurde, gemessen.

Die erfindungsgemäßen markierten Derivate sind besonders vorteilhafte Mittel zur Arzneimittelausprüfung durch in-vitro-Teste und eignen sich zur autoradiographischen Darstellung von Arzneimittelrezeptorbindungsstellen und zur Blutplasmaspiegelbestimmung von calciumkanalwirksamen Arzneimitteln wie Ca-Antagonisten.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile sind wie folgt:

¹²⁵I-markierte Liganden sind für Anwendungsgebiete, wie von uns beschrieben, im Vergleich zu tritiierten Verbindungen zu bevorzugen, da

1. die spezifische Radioaktivität des ¹²⁵I wesentlich höher (bis zu lOOfach) als die für Tritium ist,

2. die Radioaktivität billiger bestimmt werden kann (keine Scintillatoren),

3. kein organischer Lösungsmittelabfall wie beim Tritium beseitigt werden muß,

4. höhere Empfindlichkeit im Radiorezeptorassay erzielt wird,

5. die Entsorgung des radioaktiven Abfalls wegen der kürzeren Halbwertszeit des ¹²⁵I (60 Tage versus 12 Jahre) unproblematischer ist,

6. kürzere Expositionszeiten (statt 30—90 Tagen nur 1 —2 Tage) für die autoradiographische Darstellung benötigt werden,

7. die Herstellung im technischen Maßstab möglich und außerdem einfach und reproduzierbar ist und

8. die Kosten für die Herstellung weit unter denen der tritiierten Verbindungen liegen.

Stellt man unsymmetrische 1,4-Dihydropyridinderivate her, indem man Verbindungen synthetisiert, bei denen die Reste R¹ und R² nicht gleich sind, entsteht ein Tiacemat Die wegen der beiden möglichen Konfigurationen

am Gi-Atom des Dihydropyridinringes anfallenden Diastereomeren können nach den üblichen bekannten Methoden getrennt werden. Je nachdem, ob beide der Konfigurationen oder nur eine radioaktiv markiert werden sollen, kann man die Auftrennung vor oder nach der Umsetzung mit dem Succinimidester ausführen. Besonders vorteilhaft ist jedoch eine vorherige Auftrennung des Gemisches, um gezielt jeweils die gewünschte Form markieren zu können. Der besondere Vorteil besteht darin, daß die beiden Diastereomeren unterschiedliches Bindungsverhalten gegenüber Rezeptoren aufweisen, so daß Unterscheidungen möglich sind. Die Erfindung wird in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.

Beispiel 1

1,4-Dihydro-2,6-dimeiihji-H2-trifluoromethylphenyl)-3^-dicarboxylat-(2-Amino)äthylester-pyridin wird mit ¹²⁵I einfach markiertem Monoiodo-succinimidester nach folgender Gleichung umgesetzt:

H₂N(H₂C)OOC

COO—(CH₂J₂-NH₂ + 2

^H0

CxT3 XJ CH3

—C—HN-

N-O-C-(CH₂),

CH₃

O H	US₁	+	2	O /
-C-(CH₂),-	>		^NN —OH

<	-OH

Der Succinimidester wurde nach Bolton and Hunter (Biochem. J. [1973] 133, 529—533) hergestellt oder alternativ von Amersham-Buchler (Braunschweig) mit einer spezifischen Aktivität von ca. 2200 Ci/mMol bezogen.

Herstellung von ^t25Iodo

[l,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-trifluoromethylphenyl)-3^-dicarboxylat-(2-(l-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)-3-oxo-

propyl)amino)-äthylester-pyridin] (unter Na-Licht):

0,90 nMol (~ 1 mCi) des Succinimidesters (in Benzol) wird unter Stickstoffstrom getrocknet und 2,5 nMol des 1,4-Dihydropyridinaminoäthylesters in 5 &mgr;&idiagr; absolutem Ethanol dazugegeben. Nach Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; 100 mMol/1 Natriumboratpuffer (pH 8,4) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis werden die Reaktionsprodukte präparativ mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Natriumlicht getrennt. Als Fließmittel wurde Essigsäureethylester, Diethyläther (30 :70 v/v) verwendet und als Träger Silikagel 60 (Merck AG, Darmstadt). Das jodierte 1,4-Dihydropyridinderivat läuft in diesem Fließmittel, während der nicht umgesetzte 1,4-Dihydropyridinaminoäthylester am Start hängenbleibt. Das erfindungsgemäße Derivat wird mit absolutem Ethanol extrahiert und entweder in Benzol oder absolutem Ethanol bei —20°C aufbewahrt (unter Sauerstoffabschluß und vor Licht geschützt). Somit besitzt das ^l25I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat, welches mit guter Ausbeute (40± 10%; Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 Ansätzen, der eingesetzten Radioaktivität) erhalten wird, die spezifische Aktivität entsprechend der des eingesetzten Succinimidesters (ca. 2200 Ci/mMol), d. h. 4&Lgr;00 Ci/mMol. Die Oberprüfung auf radiochemische Reinheit erfolgte mit gängigen Verfahren (HPLC, Dünnschichtchromatographie).

Beispiel 2

l,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-trifluoromethylphenyl)-3-carboxylatäthylester-5-carboxylat-(2-amino)-äthylcster-pyridin wird mit ¹²⁵I einfach markiertem Monoiodosuccinimidester umgesetzt. Der Succinimidester ist der gleiche wie in Beispiel 1 und hat eine spezifische Aktivität von ca. 2200 Ci/mMol.

Herstellung von ^I25Iodo

[1.4-Dihydro-2,6-dimethyl-4(2-trifluoromethylphenyl)-3-carboxylatäthyIester-5-carboxylat-2-(l-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)-3-oxo-propyl)amino)-äthyIester-pyridin] unter Na-Licht:

Es wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch pro Mol Aminoäthylester nur 1 Mol Succinimidester eingesetzt

0,45 nMol (~ 1 mCi) des Succinimidesters (in Benzol) wird unter Stickstoffstrom getrocknet und Z5 nMol des 1,4-Dihydropyridinaminoäthylesters in 5 &mgr;&idiagr; absolutem Ethanol dazugegeben. Nach Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; 100 mMo!/l Natriumboratpuffer (pH 8,4) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis werden die Reaktionsprodukte präparativ mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Natriumlicht getrennt Als Fließmittel wurde Essigsäureethylester, Diethyläther (30 :70 v/v) verwendet und als Träger Silikagel 60 (Merck AG, Darmstadt). Das jodierte 1,4-Dihydropyridin hat einen Rf-Wert von 035 in diesem Fließmittel, während der nicht umgesetzte 1,4-Dihydropyridinaminoäthylester am Start hängenbleibt Das erfindungsgemäße Derivat wird mit absolutem Ethanol extrahiert und entweder in Benzol oder absolutem Ethanol bei —20⁰C aufbewahrt (unter Sauerstoffabschluß und vor Licht geschützt). Somit besitzt das ¹²⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat, welches mit guter Ausbeute (40 ± 10%o; Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 Ansätzen der eingesetzten Radioaktivität) erhalten wird, die spezifische Aktivität entsprechend der des eingesetzten Succinimidesters (ca. 2200 Ci/mMol), 6. ä. 2200 Ci/mMol. Die Oberprüfung auf radiochemische Reinheit erfolgte mit gängigen Verfahren (HPLC, Dünnschichtchromatographie).

20 Verwendung des zuvor hergestellten Derivats zur Arzneimittelausprüfung

Aliquote des erhaltenen und ^I25I-markierten 1,4-Dihydropyridins werden im Stickstoffstrom getrocknet, mit Puffer (50 mM TRIS-HCl, pH 7,4, versetzt mit dem Proteaseninhibitor [0,1 mMol/1] Phenylmethylsulfonylfluorid) und Membranfraktionen aus Meerschweinchenhirn, Herzmuskel und Skelettmuskel (zubereitet, wie beschrisben in Drug Development 9: 63—98 [1983]; Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 321: 80—83 [1983] und FEBS Lett 148: 331 —337 [1982]) bei 25°C in 0,1 ml Volumen bis zum Erreichen des Gleichgewichtes inkubiert und die spezifische Bindung (definiert als Unterschied in der Bindung des ¹²⁵l-markierten 1,4-Dihydropyridins in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 &mgr;&Mgr;&ogr;&Igr;/l Nimodipin) mit Hilfe der Filtrationstechnik (zur Trennung von gebundenem und freiem ^I25I-markierten 1,4-Dihydropyridin) gemessen. Zur Abtrennung des freien vom gebundenen Liganden wurde eiskalter 1OmM TRIS HLCl Puffer, pH 7,4, versetzt mit 10% (w/v) Polyethylenglycol 6000.20 mM MgCb benutzt (3,5 ml), die Probe verdünnt, über ein Glasfaserfilter unter Vakuum abgesaugt und zweimal die Glasfaserfilter mit 3,5 ml desselben Puffers nachgewaschen. Anschließend wurde die partikelgebundene Radioaktivität, die auf den Filtern retiniert wurde, gemessen.

Abb. la zeigt beispielhaft die Saturationsanalyse (Konzentrationsbereich des freien, ^l25I-markierten 1,4-Dihydröpyridinderiväies: 17 — 1276 pMöl/"i)der !,4-Dihydropyridinrezepiüren in Meerschweinchenhirnmembranen (20 &mgr;g Membranprotein pro Versuchsansatz) mit Hilfe des ¹²⁵I-markierten 1,4-Dihydropyridinderivates.

In Abb. la ist die gemessene Abhängigkeit der Konzentration des gebundenen Liganden von der Konzentration des freien Liganden aufgetragen, in Ib die Transformation der Bindungsdaten nach G. Scatchard (Ann. N.Y. Acad Sei. 51, 660—672, 1949), wobei D — Konzentration des gebundenen Liganden, F = freier Ligand, Kp die Dissoziationsgleichgewichtskonstante und B_max die Konzentration der hochaffinen Bindungsstellen im Versuchsansatz ist. Zur Berechnung der Konzentration d es freien Liganden wurde folgende Formel benutzt:

(T- a)— B, wobei &Ggr; die totale Konzentration des Liganden, a ein Faktor, der die Bindungsfähigkeit des Liganden beschreibt, und B die Konzentration des spezifisch gebundenen Liganden im Gleichgewicht ist. Der Faktor a wurde experimentell durch Aufsättigung des radioaktiven Liganden mit Bindungsstellen (Rezeptoren) bestimmt (beschrieben in FEBS Lett. 148, 331—337,1982; Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 321, 7—10, 1982). Der Faktor "a"war für das asymmetrische 1,4-Dihydropyridinderivat 0,5, in Übereinstimmung mit der theoretisch geforderten Fähigkeit des Rezeptors (R) und (S) Enantiomere des ^l25I-markierten 1,4-Dihydropyridins zu unterscheiden (Stereospezifität der Bindung). Das ¹²⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridin ist das racemische Gemisch von (R) und (S) Enantiomeren. Für Muskelmembranen (nicht darstellt) wurde eine Dissoziationskonstante von 350 pmol/l (25°C) gefunden. Die Stabilität des ^'I-markierten 1,4-Dihydropyridins wurde unter folgenden Bedingungen mit gängigen Verfahren (HPLC, Dünnschichtcnromatographie) überprüft: Puffer 50 mM TRIS HCl, pH 7,4,25⁰C, 4 Stunden; Muskelmembranen in Puffer, 25°C,4 Stunden; sowie Aufbewahrung in Benzol oder absolutem Ethanol bei —20°C für bis zu 21 Tagen nach der Herstellung des Liganden. In keinem Fall waren die radiochemischen Verunreinigungen größer als 10%. 55 _t

Schlußfolgerung S

Das '"I-markierte 1,4-Dihydropyridin bindet mit einer Dissoziationskonstante von unter 1 nMol/1 bei 25°C an Meerschweinchenhirnmembranen und Skelettmuskelmembranen. Es ist von ausreichender Stabilität.

Beispiel 3

In analoger Weise wie in Beispiel 2 wurde ein 1,4-Dihydrochinolinderivat hergestellt.

l,4-Dihydro-2-methyl-4-(2-trifluoromethylphenyl)-3-chinolincarboxylat-(2-amino)äthylester wird mit dem gleichen Succinimidester wie in Beispiel 1 umgesetzt.

Die Reaktionsprodukte werden mittels Dünnschichtchromatographie unter Natriumlicht getrennt. Das abgetrennte erfindungsgemäße Derivat wird mit absolutem Ethanol extrahiert und entweder in diesem Lösungsmit-

tel oder Benzol bei —20° C unter Ausschluß von Licht und Sauerstoff für die Verwendung aufbewahrt Die spez. Aktivität des eingesetzten Succinimidesters von etwa 2200 Ci/mMol wurde übertragen. Die radiochemische Reinheit wurde chromatographisch überprüft

Beispiel 4

Tabelle 1 zeigt Ergebnisse von Kompetitionsexperimenten. Die Daten der Tabelle 1 sind Mittelwerte (± asymptotische Standardabweichung) aus 3 unabhängigen Experimenten, in denen verschiedene Calciumantagonisten und Derivate oder Vorstufen von Calciumantagonisten mit dem aus Beispiel 2 erhaltenem ¹²⁵I-markiertem 1,4-Dihydropyridin ("Ligand") als Kompetitoren eingesetzt werden. Als Rezeptormaterial dienten Meerschweinchenskelettmuskelmembranen, Die Konzentration des markierten Liganden war 20—30 pmol/l. die Versuchstemperatur war 25°C. 6—9 verschiedene Konzentrationen der überprüften Stoffe wurden eingesetzt (jeweils als Duplikat) und die gemessenen Bindungsdaten mit Hilfe eines Computerprogramms (De Lean A. Munson PJ, Rodbard D [19781 Simultaneous annalysis of families of sigmoid curves: application to bioassay.

radioligand assay and physiological dose-response cuives. Am J. Physiol.4 E97-E102) optimal angepaßt. Es wurden als wichtiges Kriterium für die Rezeptorbindung des ^12SI-markierten 1,4-Dihydropyridins in der Gruppe 1 die Stereospezifität der Bindung für chirale 1,4-Dihydropyridine untersucht In der Gruppe 2 finden sich zwei 1,4-Dihydropyriden, die Calciumkanäle aktivieren können, in der Gruppe 3 zwei 1,4-Dihydropyridine, die als Calciumkanalblocker nur schwach wirksam sind, in der Gruppe 4 die Enantiomeren des Verapamils und des Methoxyvernpamils, in der Gruppe 5 zwei Diastereoisomere des Diltiazems, in der 6. Gruppe ein inorganischer Calciumanisgonist Der ICso-Wert ist die Konzentration des Stoffes, die 50% Hemmung der spezifischen Bindung des Liganden im Radiorezeptorassay bewirkt Im Falle des d-cis-Diltiazems wurde bei 37° C gemessen und der ECso-Wert bestimmt Der ECso-Wert ist die Konzentration des Stoffes, die halbmaximal die spezifische Bindung des Liganden stimuliert

Schlußfolgerung

Das ¹²⁵I-markierte 1,4-Dihydropyridin ("Ligand") ist für den Radiorezeptorassay verwendbar.
Tabelle 1

Bindungskonstanten für unmarkierte Verbindungen, ermittelt mit dem im Beispiel 2 hergestellten

¹²⁵l-markierten 1,4-Dihydropyridin

Gruppe Stoff IQonmol/l

1. (+)205—033 2 ±0,05

(—)205—034 198 ±40

_w (-) Bay e 6927 3 ± 0,04

(+) Bay e 6927 420 ± 67

(+)Nicardipine 7 ± 0,8

(—) Nicardipine 42 + 3

2. Bay K 8644 37 ±5

CGP 28392 1250 ± 180

3. Bay M 5579 1860 ± 300
Vo 2605 320 ± 35

4. (—) Methoxyverapamil 21 ± 8
(+)Methoxyverapamil 190 ± 50
(—)Verapamil 98 ± 22

( + )Verapamil 54 ± 12

5. d-cis-Diltiazem 960 ± 310
1-cis-Diltiazem 3000 ± 1600

6. La³⁺ 110 000 ±20 000

Die einzelnen Stoffe waren:

(+) 205-033: (+) Enantiomer des PN 200-110 (isopropyl 4-(2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-l,4-dihydro-2,6-dimethyl-S-methoxycarbonyl-pyridine-S-carboxylate)

(-) 205-034: (-) Enantiomer des PN 200-110 (isopropyl 4-(2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)-l,4-dihydro-2,6-dimethyl-S-methoxycarbonyl-pyridine-S-carboxylate)

( + ) Bay e 6927: (+) Enantiomer des Bay e 6927 (isopropylmethyi l,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nhrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylate)

(—) Bay e 6927: (—) Enantiomer des Bay e 6927 (isopropylmethyi l,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophe-

nylJ-S.S-pyridinedicarboxylate)

(+) Eriantiomer des Nicardipins (2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-l,4-düiydropyridine-3,5-dicarboxylic acid 3-2(N-benzyl-N-methylamino)-ethylester5-methylester)

(—) Enantiomer des Nicardipins (2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-l,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid 3-2(N-benzyI-N-methylamino)-ethylester 5-methylester)

Bay K 8644: l,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-trifluoromethylphenyl)-3,5-pyridinecarboxylicacid 2-(amöinoethyl)ethylester

CGP 28392: (4-(2-difluormethcxy)phenyl-l,4,5,7-tetrahydro-2-methyl-5-oxofuro(3,4-b)pyridine-3-carboxylic acid ethylester

Bay M o579: Nitrendipinderivat mit freier Carboxylgruppe (sieheTIPS 3:431—437; 1982)

VO 2605: Bromderivat des PN 200-110 (siehe Drug Development 9:63—98; 1982)

Beispiel 5

Abb. 2 zeigt eine Eichkurve zur Bestimmung des 1,4-Dihydropyridins Nitrendipin im menschlichen Plasma. Hierzu wurde EDTA-Plasma einer nüchternen Versuchsperson mit Nitrendipin versetzt und mit Plasma ausverdünnt. Die verschiedenen Plasmaverdünnungen (10 &mgr;&idiagr;) werden in einem Versuchsansatz von 0,25 ml mit Skelettmuskelmembranen (Meerschweinchen) (20 &mgr;g Protein) und dem ^12SI-markierten 1,4-Dihydropyridinderivat (20 pM, hergestellt wie in der Beschreibung dargestellt) versetzt und die spezifische Bindung nach Einstellung des Gleichgewichtes (2 Stunden) mit Hilfe der üblichen, in Beispiel 2 erläuterten Filtrationsmethode gemessen. Mit der üblichen Methode der logit-logTransformation (D. Rodbard and C. R. Frazier in: MetWsds in Enzymology, Vol.37, PartB, eds. O'Malley and J.G. Hardman, Academic Press, New York, San Francisco, London, ppi—22, 1975) wurden die Daten der spezifischen Bindung (Punkte) gegen die im Originalplasma vorgelegte Nitrendipinkonzentration aufgetragen. Die erhaltene Standardkurve (ausgezogene Linie) ist eine Gerade für die Nitrendipinkonzentrationen, die die spezifische Bindung des ^I25I-markierten Liganden im Vergleich zum Leerplasma (= Plasma ohne Nitrendipin) zu 15 bzw. 85% hemmen.

Schlußfolgerung

Das ¹²⁵l-markierte 1,4-Dihydropyridinderivat erlaubt die Bestimmung von Calciumantagonisten im Blutpiasma mit Hilfe des Radiorezeptorassays. Die Empfindlichkeit ist ausreichend, da die üblichen therapeutischen Konzentrationen, z. B. für das 1,4-Dihydropyridindervat Nifedipin zwischen 70 und 200 nMol/1 Plasma liegen.

Die Beispiele zeigen die Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen 1,4-Dihydropyridinderivate als Prüfreagenz zum Ausprüfen von Arzneimitteln. Eine analoge Wirkung wurde für die erfindungsgemäßen 1 ^-Dihydrochinolinderivate gefunden. Durch die Möglichkeit der unterschiedlichen Zahl von ¹²⁵I-Substituenten am Rest R^x, nämlich ein- oder zweifach, und die bei den symmetrischen Dihydropyiidinderivaten noch vorhandene Möglichkeit 1 oder 2, Moleküle Succinimidester mit einem Molekül Dihydropyridiricarbonsäureesterderivat umzusetzen, eröffnet das erfindungsgemäße Verfahren in jedem Falle eine ausreichende Markierung und ihre Anpassung an die strukturspezifischen Erfordernisse, um stabile Verbindungen zu synthetisieren.

Die Rezeptoren sind in der Lage, nur bestimmte Molekülstrukturen zu binden. Die große Auswahl von Substitutionsmöglichkeiten am 1,4-Dihydropyridin- und am 1,4-Dihydrochinolingrundkörper erlaubt es, für alle üblichen und bekannten Rezeptoren dieser Stoffklasse zur Bindung geeignete ^I25I-markierte Verbindungen herzustellen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche

1. Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyrinderivate und 1,4-Dihydrochmolinderivate gekennzeichnet durch die 1,4-Dihydropyridinderivate der allgemeinen Formel

R⁵

R²OOC-ZN-COOR¹

AA < S R3

0)

R<

und die 1,4-Dihydrochmolinderivate der allgemeinen Formel R⁵ H

(U)

in denen R¹ und R² gleich oder verschieden sind und R¹ eine O

Il

-4A)-NH—C -(Y)— R*-Gruppe_;

in der A und Y eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1—6 Kohlenstoffatomen und

R* ein in p-Stellung. nicht rat Halogen substituierter Phenylrest oder ein in 4-Stellung angefügter Imidazol-

rest ist, und wenn R¹ nicht Ti² ist,

R² NO2, Nitril oder Alkoxy ixüt 1 — 4 Kohlenstoffatomen,

R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind mit H, NH2 oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1 —4

Kohlenstoffatomen,

R⁵ ein Arylrest, der gegebenenfalls 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe A'kyl-, Alkoxy, Phenyl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, vorzugsweise ein

Phenyl-, Naphthyl.Thenyl- oder Furylrest ist,

R⁶ H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten,

und in denen der Rest R* noch mit ¹²⁵Jod ein oder zweifach substituiert ist und die spezifische Aktivität etwa

2200 bis etwa 8800 Ci/mMol beträgt

2. Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß R^x

OH oder

oder

NH

ist.

3. Radioaktiv markierte 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-Dihydrochinolinderivate nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ ein Phenylrest ist, der gegebenenfalls ein oder zweifach substituiert ist durch Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Fluor, Chlor, Brom.

4. Verfahren zur Herstellung von radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivaten und 1,4-Dihydrochinolinderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man 1,4-Dihydropyridincarbonsäureester der Formeln

R⁵ H

R²OOC

COO-(A)-NH₂

R⁵ H

H²N-(A)OOC

COO(A)-NH₂

(IV)

oder M-Dihydrochinolincarbonsäureester der Formel R⁵ H

(V)

in denen

R² NO₂, Nitril oder Alkoxy mit 1 —4 Kohlenstoffatomen.

R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und H, NH₂ oder gradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1 —4 Kohlenstoffatomen, A eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1—6 Kohlenstoffatomen,

R³ ein Arylrest, der gegebenenfalls 1 bis 2 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Alkyl-, Alkoxy-, Phenyl-, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl oder Alkylmercapto enthält, vorzugsweise ein

Phenyl-, Naphthyl-, Thenyl oder Furylrest ist R⁶ H, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten,

mit ¹²⁵I-markierten acylierenden Verbindungen mit einer spezifischen Aktivität von 2200 bis 4400 Ci/mMol

der Formel

N —O —C—(Y)-R*

in der (Y) eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1—6 Kohlenstoffatomen ist und R* ein in p-Stellung, nicht mit Halogen substituierter Phenylrest oder ein in 4-Stellung angefügter Imidazolrest, der

noch mit ¹²⁵I ein oder zweifach substituiert ist,

in einem Lösungsmittel unter Kühlung im Dunkeln umsetzt und die radioaktiv markierten 1,4-Dihydropy-

ridmderivate oder die 1,4-Dihydrochinolinderivate mittels präparativer Dünnschichtchromatographie oder

HPLC abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in den acylierenden Verbindungen R*

OH oder
¹²⁵I

N3 oder

oder

¹²⁵I

NH

ist.

6. Verfahren nach Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß

R⁵ ein Phenylrest ist, der gegebenenfalls ein oder zweifach substituiert ist durch Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Fluor, Chlor, Brom.

7. Verwendung der radioaktiv markierten 1,4-Dihydropyridinderivate und 1,4-DihydrochinoIinderivate nach Ansprüchen 1 —6 zur Ausprüfung von Arzneimitteln mit Hilfe von Rezeptoren durch Radiorezeptorassays.

8. Verwendung nach Anspruch 7 in in-vitro-Prüfungen zur autoradiographischen Darstellung von Arzneimittelrezeptorbindungsstellen.

&iacgr;&ogr;

9. Verwendung nach Anspruch 7 in in-vitro-Prüfungen zur Plasmaspiegelbestimmung von calciumkanal-

wirksamen Arzneimitteln.