DE2506993A1

DE2506993A1 - Kapillare und verfahren fuer die chromatographische trennung von material in fluessiger phase

Info

Publication number: DE2506993A1
Application number: DE19752506993
Authority: DE
Inventors: Gideon Dreyfuss
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-02-21
Filing date: 1975-02-19
Publication date: 1975-09-04

Description

ts- ΡΑτ-Μ;,:«■.,■■.·:.' -il: ■ -^>²⁵P⁶⁹ ^{S3 :}

M 1β

1 a FEB. 1975

Gideon DreyfusS ;■ Tel-Aviv / Israel

Kapillare und Verfahren für die chromatographische Trennung von

Material in flüssiger Phase

Dünnschichtchromatographie (DSC) findet verbreitet Anwendung zur chroraatographischen Trennung von gelösten Substanzen im Bereich von pg bis zu mg. Die theoretischen und praktischen Aspekte von DSC sind in der Literatur ausführlich erläutert. Die Hauptmerkmale von DSC sind: Eine grosse Auswahl an Material für die stationäre Phase, hohe Empfindlichkeit, vergleichsweise kurze Entwicklungsdauer, vergleichsweise leichte Gewinnbarkeit der getrennten einzelnen Komponenten, Veränderungsmöglichkeit der Schichtdicke und leichte Beurteilung der getrennten einzelnen Komponenten. -_ - - - . .

Das Verfahren ist jedoch auch mit Nachteilen behaftet. Oft ist die Qualität der Trennung aufgrund ungenauer Unterschiede der Rp-Werte aufeinanderfolgender Komponenten und aufgrund der Neigung der Flecken zur Ausbreitung und Schwanzbildung schlecht.

5098 36/0691

Obwohl die Entwicklungsdauer im allgemeinen kürzer ist als in der Papierchromatographie, liegt sie trotzdem oft im Bereich.von mehreren Stunden. Aufgrund ungenügender Einheitlichkeit der Trennung sind direkte Messungen auf den Platten nicht genau genug. Die Entfernung von auf der Platte getrennten Fraktionen durch Abkratzen ist unzweckmässig und ungenau. Bei aufsteigender DSC ._ gibt es keine Möglichkeit zur Erzielung eines weiteren oder _, schnelleren Aufsteigens der Lösungsmittelfront als dies natürlich _/ auftritt. DSC-Platten werden leicht durch die in Laboratorien oft vorhandenen Dämpfe kontaminiert/ was zu schlechter Ausbeute und Trennung führt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Kapillare zu schaffen, welche die Behebung oder Verminderung von vielen der vorstehend genannten Nachteile ermöglicht und die Vorteile von sowohl DSC wie auch PapierChromatographie vereinigt und ausserdera noch einige weitere Vorteile aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Kapillare, die aus transparentem Material besteht, eine lichte Weite von 0,2 2,0 mm aufweist und mit einem trockenen, teilchenförmigen Material gefüllt ist, dessen durchschnittliche Teilchengrösse 20 % der lichten Weite der Kapillare nicht übersteigt, wobei die Verhältniszahl von Aussendurchmesser zu lichter Weite der Kapillare nicht grosser als 2 ist.

Vorzugsweise beträgt die Länge der erfindungsgemässen Kapillare bis zu 15 cm.

In einer besonderen Ausführungsform ist mindestens eines der beiden Enden der erfindungsgeraässen Kapillare mit einer Substanz verschlossen, die den Austritt des trockenen, teilchenförmigen Materials verhindert, jedoch den Durchtritt des zu trennenden Materials und von Lösungsmittel ermöglicht.

509836/0691

I 4ί:ί" £ ^Ein Veiterer Gegenstand "der ;?rf iridung 'TisVftein; chroma-^;rip tisches "Trennverfahren7^das die hachste&enlp^|^^

a) Füllen einer^geradlinigen Kkplli^e^iXt-e^S^^trod^n^nf teilchenförmigen Material _t'^ ''''"- ■Tr-'^T;..;,.;:^^;:·!^^:^^^^^^^^'^^".·^' -^r b) ^Anwendung" einer ^Lösung ^r desf ^zUT txehnendSii^a^eriaYs^¹^ ,~

^htih ^:b'ii

c) "Anwendung eines ^chromatischen ^:Lbsun'gsmittei

gleiche Ende der Kapillare/^{; :;:} "'"^'"""'" ^r""'^v:""''''' ^r:"' ^:'^;:·^;'^: '""-■' ~~''^:-^:'■'■■'

d) Abwarten der Trennung des zu trennenden Materials in der Kapillare in dessen einzelne Komponenten, - ,:- , . .,

e) .Beurteilung der getrennten einzelnen Komponenten.

Es ist ein besonderes Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens, dass das zu^:trennende Material und das Lösungsmittel in der Kapillare ohne jegliche Anwendung von Druck mittels der natürlichen Kapillaraktivität fortbewegt werden.; :^c V '

Die Kapillare kann Während des Trennvorgangs thermostatisiert werden. Nach erfolgterTrennung können die einzelnen Komponenten nach Zerstörung der Kapillare eluiert werden. Unsichtbare Komponenten des zu trennenden Materials können sichtbar gemacht werden /indem nach erfolgter Trennung entweder ein^; entsprechendes "Mittel durch die Kapillare geleitet oder'das in der Kapillare befindliche, trockene, teilchenförmige Material mit einer Substanz imprägniert wird, die dazu befähigt ist, die genannten unsichtbaren Komponenten sichtbar zu machen.~

J Die getrennten Komponenten können visuell oder mittels sines"elektronischen oder optischen "Gerätes beurteilt werden.

,·: ::..:;- ,^Is trockenes, teiichenförmiges Material i?~das in'der" erflndungsgemässen Kapillare eine stationäre Phase bildet; kön- ^: nen die in der konventionellen Chromatographie verwendeten Substanzen eingesetzt werden.

5 0 9836/0691

-A-

-...'-',.; Nach Anwendung einer Lösung des .zu trennenden Materials und nachfolgender Anwendung eines chromatischen Lösungs- . . mittels^auf ,ein ,Ende .der^erfindungsgemässen^ Kapillare bewegen, .._ sich die Lösung und das Lösungsmittel aufgrund der Kapillar- .-·... aktivität in der stationären Phase unter Trennung der einzelnen Komponenten des zu trennenden.Materials und Bildung eines Chromatogramms. . . . ... .... ... _: . ..

Es ist vorteilhaft, die Kapillare bei der Ausführung des beschriebenen Verfahrens in vertikaler Stellung einzusetzen und das untere Ende der Kapillare mit der Lösung und dem Lösungsmittel in Berührung zu bringen. Es ist jedoch zu beachten, dass die erfindungsgemässe Kapillare auch in jeder anderen Stellung wirksam ist, beispielsweise horizontal oder in jeder beliebigen Schräglage. ·

Das transparente Material der Kapillare ist zweckmässig inert, wie Glas oder transparenter Kunststoff. Lichte Weiten der kleinstmöglichen Dimension und bis zu 2 mm wurden ausprobiert und erwiesen sich als brauchbar. Der bevorzugte Bereich der lichten Weite liegt bei 0,1 - 1,5 mm. Das als stationäre Phase dienende trockene, teilchenfÖrmige Material kann von Hand in die Kapillare eingebracht werden, jedoch ist dies ein zeitraubendes und unzweckmässiges Unterfangen. Es ist wichtig, dieses Material in einer dichten und praktisch homogenen Form in die Kapillare einzubringen. Die Teilchengrösse und Grössenverteilung des teilchenförmigen Materials der stationären Phase können in weitem Rahmen , innerhalb der angegebenen Grenze variiert werden.

Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens , kann eine Weiterbewegung des Lösungsmittels erzielt werden durch Einleitung von Lösungsmittel unter Druck oder durch tieferes Eintauchen der Kapillare in das Lösungsmittel.

509836/069 1

Die erfindungsgemässe Kapillare wird vorteilhaft in einer Einrichtung eingesetzt, die es ermöglicht, die Kapillare in einer vorbestimmten Lage zu fixieren und die ümgefaungsatmosphäre und -temperatur zu kontrollieren. Aufgrund der vergleichsweise geringen Abmessungen der Kapillare sind derartige Hilfseinrichtungen ebenfalls klein und von einfachem Aufbau.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge der erfindungsgemässen Kapillare wenige cm.

Zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann die beschriebene Kapillare beispielsweise ein mit einem Ende in eine Lösung des zu trennenden Materials bis zu einer bestimmten Tiefe eingetaucht werden, was für die meisten qualitativen Trennungen genügt. Zweckmässig wird so lange eingetaucht, bis die genannte Lösung zu einer vorher angebrachten Markierung aufgestiegen ist, so dass die stationäre Phase ein vorbestimmtes Volumen der Lösung enthält. Ein bekanntes Volumen der Lösung des zu trennenden Materials kann jedoch auch mittels einer Mikro-Injektionsspritze in die Kapillare eingespritzt werden. Nach dem Einbringen der genannten Lösung wird ein entsprechendes Lösungsmittel in die Kapillare eingebracht. Wenn das untere Ende der Kapillare in das Lösungsmittel eingetaucht und die Kapillare vertikal gehalten wird, steigt das Lösungsmittel aufgrund der Kapillaraktivität in der Kapillare nach oben und entwickelt dadurch das Chromatogramm. Der Aufstieg der Lösungsmittelfront um 1 - 4 cm benötigt 1-10 min, was im allgemeinen genügt, um eine klare und vollständige Trennung zu erzielen. Es ist offensichtlich, dass iie Steighöhe und Steigdauer in grossem Ausmass von den Dimensionen der jeweiligen Kapillare, der stationären Phase, dem Lösungsmittel und auch der Lösung des zu trennenden Materials ablängig sind. Da das erfindungsgemässe Verfahren einfach durchrührbar ist, können kurzfristig und mit einfachen Mitteln leicht forversuche ausgeführt werden, um die optimalen Parameter für

die vorgesehene Trennung zu ermitteln.

Manchmal sind die einzelnen Komponenten des zu trennenden Materials nach der Trennung von blossem Auge sichtbar, müssen jedoch in gewissen Fällen in UV-Licht beurteilt werden. Im Falle von farblosen und nicht fluoreszierenden Komponenten erfolgt die Beurteilung im allgemeinen auf eine der nachstehenden Arten:

a) Imprägnierung der stationären Phase mit einer Substanz , die dazu befähigt ist, unsichtbare Komponenten unter Einwirkung von Wärme oder nach Hindurchleiten einer weiteren Substanz durch die stationäre Phase sichtbar zu machen;

b) Hindurchleiten einer Substanz durch die stationäre Phase, die dazu befähigt ist,·eine oder mehrere unsichtbare Komponente (n) anzufärben, die jedoch nicht eine unerwünschte Migration der Komponenten verursacht;

c) Verwendung einer Kombination des Lösungsmittels für die Entwicklung und eines Mittels zur Anfärbung der betreffenden Komponente, das nur nach einer bestimmten Behandlung, beispielsweise Erwärmung, sichtbar wird;

d) Reaktion mit einem eine vorbestimrate Komponente sichtbar machenden Mittel vor Ausführung der Trennungsbehandlung.

Die getrennten Bänder der einzelnen Komponenten können leicht voneinander getrennt werden, indem die Kapillare so zerschnitten wird, dass die einzelnen getrennten Komponenten in den erhaltenen Teilstücken der Kapillare enthalten sind.

Die erhaltenen einzelnen Komponenten können dann in einem entsprechenden Lösungsmittel gelöst oder jeder beliebigen anderen Analysebehandlung, beispielsweise Spektrophotometrie oder

509836/0691

Spektrofluorometrie/ unterzogen werden. Aehnliche Methoden sind natürlich auch anwendbar für die Herstellung von vorbestimmten Teilmengen der einzelnen Komponenten.

Die meisten Versuche zur Herstellung der erfindungsgemässen Kapillare wurden mit im Handel erhältlichen Standardkapillaren ausgeführt, beispielsweise von Drummond Scientific Company, USA, und von DADE₇ USA. Verwendet wurden Kapillaren mit stark variierenden Dimensionen im Bereich der lichten Weite von 0,2 - 2,0 mm und im Längenbereich von 2 - 15 cm. Das Volumen derartiger Kapillaren liegt in der Grössenordnung von 5 - 200 μΐ.

Vergleichsversuche zum erfindungsgemässen Verfahren wurden mit DSC-Platten bei gleicher Temperatur und mit der gleichen Lösung des zu trennenden Materials, gleichem Lösungsmittel und gleicher stationärer Phase ausgeführt.

In den nachstehenden Beispielen, die in keiner Weise einschränkende Wirkung haben sollen, wird die Erfindung näher erläutert, wobei zu beachten ist, dass in bezug auf die Dimensionen der Kapillaren, Art der stationären Phase, Lösungsmittel und getrennten Materialien viele Variationen und Modifikationen im Bereich der vorliegenden Erfindung möglich sind.

Beispiel 1

Für "die Trennung der von Desaga, Heidelberg, gelieferten "Standard Test Mixture" wurde für die stationäre Phase der Kapillare Silicagel G, Typ 60, von Merck, und als Lösungsmittel wurde Chloroform verwendet.

Die Chromatographie wurde mittels einer Kapillare von 0,4 mm lichter Weite und 6 cm Länge ausgeführt, in welche das genannte Silicagel als stationäre Phase eingefüllt war. Ein Ende der Kapillare wurde kurz in die zu trennende Prüflösung getaucnt,

509836/0691

bis diese in der Kapillare eine Steighöhe von 2 nun erreicht hatte. Danach wurde das gleiche Ende der Kapillare in Chloroform eingetaucht. Nach 95 s war das Lösungsmittel in der Kapillare um 2,5 cm aufgestiegen, wobei eine vollständige und klare Trennung der gelben, roten und blauen Indikatoren erzielt wurde. Die Breite jedes der erhaltenen Farbbänder mit R_f-Werten von 0,82, 0,55 und 0,35 betrug 1-2 mm.

Ein Muster der gleichen Prüflösung wurde nach DSC behandelt, wobei die Dicke der stationären Phase aus gleichem Material 0,25 mm betrug. Nach ungefähr 40 min resultierte eine unvollständige Trennung.

Beispiel 2

Für die Trennung eines Materials, das je 5 ug DNP-Ala, DNP-GIu, DNP-Try und DNP-Ser, gelöst in 0,1 ml eines Aethers, enthielt, wurde eine Kapillare mit einer lichten Weite von 0,6 mm und einer Länge von 5 cm eingesetzt, die als stationäre Phase mit SilicagelG gefüllt war. Als Lösungsmittel wurde ein Gemisch von 95/5/1 Gewichtsteilen Chloroform/Methanol/Essigsäure verwendet. Die Ausführung des Verfahrens erfolgte wie vorstehend beschrieben , wobei nach 9 min eine Trennung in 4 scharfe Bänder erfolgte.

Beispiel 3

Für die Trennung eines Materials in Form von 0,1 ml einer Lösung, enthaltend je 10 yg DNS-Petrescin, DNS-Cadaverin, DNS-Spermidin und DNS-Spermin wurde eine Kapillare einer lichten Weite von 1,2 mm und einer Länge von 5 cm eingesetzt, die als stationäre Phase mit DSC-Alumina G gefüllt war. Als Lösungsmittel wurde ein Gemisch von 1 : 200 Gewichtsteilen Dioxan/Chloroform verwendet. Die Ausführung erfolgte, wie vorstehend beschrieben, wobei die Trenndauer 7 min betrug.

509836/0691

Ein Vergleichsversuch, mit gleichen Komponenten, je-.och nach der DSC-Methode ergab ebenfalls gute Trennung, wobei .ie Zeitdauer der Trennung jedoch 4 h betrug.

Aus den vorstehenden Beispielen geht hervor, dass es öglich ist, unter Verwendung einer erfindungsgemassen Kapillare ach dem beschriebenen Verfahren innert vergleichsweise kurzer eitdauer gute Trennung zu erzielen. Die erhaltenen Resultate aichnen sich durch ein hohes Ausmass an Einheitlichkeit und Reroduzierbarkeit aus. Das Verfahren ist leicht ausführbar,und 3 erfolgt keinerlei Kontamination des zu trennenden Materials. ie abgetrennten Bänder können leicht voneinander getrennt und luiert werden. Unter Verwendung der erfindungsgemassen Kapillare -önrien nach dem beschriebenen Verfahren kleinere Mengen des zu rennenden Materials behandelt werden, und es ist möglich, gleicheitig eine grosse Anzahl von Trennbehandlungen auszuführen, usserdem ist ein Wechsel des Lösungsmittels während der Behandung sehr einfach,und die Bedingungen hinsichtlich Umgebung und amperatur während der Trennbehandlung können leicht kontrolliert nd eingehalten werden.

509836/0691

Claims

Patentansprüche

1. λ^{ _:_/r. :K^iliare ziir"^/;chromätographischen Trennung in flüssiger Phase, dadurch "gekennzeichnet _f dass die Kapillare aus transparentem Material ^besteht/reine lieh 0,2 '- 2,0 mm aufweist und mit einem trockenen, teilchenförmigen Material gefüllt ist, dessen durchschnittliche Teilchengrosse 20 % der lichten Weite der Kapillare nicht übersteigt, und dass die Verhältniszahl von Aussendurchmesser zu lichter Weite der Kapillare nicht grosser als 2 ist.

2. Kapillare nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass deren Länge bis zu 15 cm beträgt.

3. Kapillare nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der beiden Enden der Kapillare mit einer Substanz verschlossen ist, die den Austritt des trockenen, teilchenförmigen Materials verhindert, jedoch den Durchtritt des zu trennenden Materials und von Lösungsmittel ermöglicht.

4. Chromatographxsches Trennverfahren, gekennzeichnet durch die nachstehenden Verfahrensschritte:

a) Füllen einer geradlinigen Kapillare mit einem trockenen, teilchenförmigen Material,

b) Anwendung einer Lösung des zu trennenden Materials auf ein Ende der Kapillare,

c) Anwendung eines chromatischen Lösungsmittels auf das genannte gleiche Ende der Kapillare,

d) Abwarten der Trennung des zu trennenden Materials in der Kapillare in dessen einzelne Komponenten, . .

e) Beurteilung der getrennten einzelnen Komponenten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zu trennende Material und das Lösungsmittel in der Kapillare mittels der natürlichen Kapillaraktivität fortbewegt werden.

509836/0691

- li -

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare während des Trennvorgangs thermostatisiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die getrennten Komponenten nach Zerstörung der Kapillare eluiert
werden. \ . ... ■-.

3. . Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter Trennung unsichtbare Komponenten sichtbar gemacht
verden, indem ein entsprechendes Mittel durch die Kapillare geleitet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass las trockene, teilchenförmige Material mit einer Substanz imprägniert wird, die dazu befähigt ist, unsichtbare Komponenten des zu -,rennenden Materials nach der Trennung sichtbar zu machen.

.0. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass lie getrennten Komponenten visuell beurteilt werden.

.1. · Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, dass ie getrennten Komponenten mittels eines elektronischen oder optichen Gerätes beurteilt werden. . ί

rf''

509836

/0691 '