-
Beschreibung
-
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Schnellbest-immung von Aflatoxinen, insbesondere in pflanzlichen und tierischen
Extrakten.
-
Aflatoxine sind gefürchtete Lebensmittel- und Futtermittelgifte, die
in pflanzlichen Produkten wie eiweißreichen Ölsamen, z.B. Nüssen, Erdnüssen, Mohn,
ferner in Getreide und Getreideerzeugnissen, Brot- und Backwaren aber auch in Fleisch
und Fleischerzeugnissen, Eiern und Eierprodukten, Milcherzeugnissen u.dgl. auftreten
können. Die Aflatoxinbestimmung wurde für diese Produkte daher vom Gesetzgeber vorgeschrieben.
Die zulässigen Höchstmengen an Aflatoxinen in Lebensmitteln und Futtermitteln sind
in der sogenannten Aflatoxin-Verordnung vom 30.11.1976 sowie in der Futtermittelverordnung
vom 16.6.1976 festgesetzt worden.
-
Zur Bestimmung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 in Lebensmitteln ist
vom Bundesgesundheitsamt ein Analysenverfahren empfohlen worden, siehe Bundesgesundheitsblatt
18, Seite 230 ff (1975), bei dem ein Chloroformauszug aus der zermahlenen Probe
des zu untersuchenden Lebensmittels oder Futtermittels säulenchromatographisch gereinigt
und dann durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie in
die
einzelnen Bestandteile aufgetrennt wird. Die Auswertung erfolgt durch Messung der
Fluoreszenzintensitäten der Aflatoxine im Vergleich zu einem Aflatoxinstandard.
-
Die Identifizierung wird durch Derivatbildung sowie durch Einsatz
verschiedener Fließmittel durchgeführt.
-
Dieses bekannte Verfahren ist zur genauen quantitativen Bestimmung
der einzelnen Aflatoxine ausgearbeitet worden und entsprechend mit einem große apparativen
Aufwand verbunden. Die Bestimmungen sind sehr genau, erfordern jedoch einen ziemlich
großen Kosten- und Zeitaufwand.
-
In der täglichen Praxis ist eine solche aufwendige und genaue Bestimmungsmethode
oft nicht erforderlich, da es in der Regel nicht so sehr darauf ankommt, den genauen
Afaltoxingehalt des zu untersuchenden Erzeugnisses zu kennen, sondern meistens ausreicht
zu wissen, ob für das Erzeugnis die gesetzlich zugelassene Höchstmenge an Aflatoxin
überschritten wird oder nicht. In den meisten Fällen genügt daher eine halbquantitative
Bestimmung, die schneller und weniger aufwendig durchgeführt werden kann.
-
Aus der DE-OS 24 46 078 ist bereits ein Verfahren zur Bestimmung der
Konzentration eines gelösten Stoffes durch Chromatographie bekannt, mit dem eine
verhältnismäßig schnelle halbquantitative Bestimmung von Aflatoxinen erfolgen kann.
Bei diesem bekannten Verfahren wird der
benzolische Extrakt des
zu untersuchenden Substrats in aufsteigender Säulenchromatographie, am besten in
Minisäulen, aufgetrennt. Die halbquantitative Bestimmung des Aflatoxingehalts erfolgt
anhand einer Vergleichssäule, die zweckmäßig eine Minisäule gleicher Abmessungen
ist.
-
In dieser Vergleichssäule sind Vergleichsflecke bzw. Vergleichsbanden
verschiedener Konzentrationen aus einer ungiftigen Vergleic-hssubstanz enthalten,
die die gleiche Farbe bzw. Fluoreszenz zeigt wie der zu messende Stoff.
-
Nach Entwicklung der Chromatographiesäule werden die aufgetrennten
Zonen mit den Zonen der Vergleichssäule hinsichtlich gleicher Farbe bzw. gleichen
Fluoreszenzverhaltens geprüft und bei Vorliegen von Aflatoxinen deren Konzentration
anhand der Konzentrationsskala auf der Vergleichssäule bestimmt bzw. abgeschätzt.
Die Chromatographiesäule besteht aus einem Rohr aus Pyrexglas von 150 mm Länge,
4 mm innerem Durchmesser, das an einem Ende eine trichterförmige Erweiterung aufweist
und am anderen Ende mit einem Wattepfropfen verschlossen ist. Auf dem Wattepfropfen
befindet sich eine 1,5 cm hohe saure Aluminiumoxidschicht, die von einer 9 cm hohen
Kieselgelschicht gefolgt wird, die vorher 2 Stunden lang bei 110° C aktiviert wurde.
Nach dem Füllen wird die Säule ca. 35mal vorsichtigt auf eine feste Unterlage aufgestoßen
und mit einem Wattepfropfen verschlossen.
-
Mit einer solchen Minisäule wird nach dem bekannten Verfahren der
zu untersuchende Extrakt mittels aufsteigender Chromatographie aufgetrennt, wobei
zur Entwicklung des Chromatogramms als Lösungsmittel eine Mischung von 93:5:2 (Volumenteile)
von Chloroform, Acetonitril und Isopropanol verwendet wird. Nach genau 5 Minuten
wird die Entwicklung des Chromatogramms beendet und die Minisäule zusammen mit der
Vergleichssäule sofort unter der UV-Lampe bei 366 nm betrachtet. Wenn Aflatoxin
zugegen ist, erkennt man im UV-Licht in der Regel ca. 1 cm über der Aluminiumoxidzone
eine blau fluoreszierende, ca. 2 mm breite Zone.
-
Obwohl das bekannte Verfahren bereits eine verhältnismäßig rasche
halbquantitative Bestimmung von Aflatoxinen zuläßt, ist es mit einigen Nachteilen
verbunden, die eine breitere Anwendung beispielsweise in Betriebslabors verhindert
haben. So sind die gefüllten Minisäulen nicht lagerfähig, da sich die verschiedenen
Aktivitätsstufen, in denen das Al 203 (nicht aktiviert) und das Kieselgel (aktiviert
2 Stunden bei 1100 C) vorliegen, bei längerer Lagerung ausgleichen, was sich auf
die Trennung und Absorption der Aflatoxine nachteilig auswirkt. Ein weiterer Nachteil
besteht darin, daß selbst beim Einhalten der empfohlenen Entwicklungszeit für das
Chromatogramm die Lage der eventuelle vorhandenen Aflatoxinzone nicht genau vorherbestimmt
werden kann, wodurch Unsicherheiten in der
Zuordnung der Banden
auftreten können, wenn diese in größerer Zahl im entwickelten Chromatogramm auftreten.
-
Die nach dem bekannten Verfahren erhaltenen Aflatoxinzonen sind in
der Regel ziemlich diffus ausgebildet, was für eine auch nur halbquantitative Auswertung
gewisse Schwierigkeiten mit sich bringt. Diese Diffusion ist um so deutlicher ausgeprägt,
je länger die Säule nach der Entwicklung der Zonen aufbewahrt wird, so daß bereits
nach ca. 10 bis 20 Minuten eine Wiederholung der Messung an der gleichen Säule wegen
der inzwischen stattgefundenen starken Diffusion kaum mehr möglich ist.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bekannte
Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Aflatoxinen durch Chromatographie
wesentlich zu verbessern und insbesondere ein solches Verfahren zu schaffen, bei
dem die vorstehend beschriebenen Nachteile ganz oder weitgehend vermieden werden
können.
-
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur
Schnellbestimmung von gelösten Aflatoxinen durch Chromatographie in einer mit Adsorptionsmitteln
gefüllten Mini-Chromatographiesäule und Vergleich der Farb-bzw. Fluoreszenzintensität
der erhaltenen Aflatoxinzonen bzw. -banden mit derjenigen von Chromatogrammzonen
bzw.
-
-banden eines in entsprechend g-efüllter Vergleichssäule,
zweckmäßig
etwa gleicher Abmessungen, in bekannten, abgestuften Konzentrationen vorliegenden
Vergleichsstoffes, wobei die Farb- bzw. Fluoreszenzintensität des Vergleichsstoffes
derjenigen der zu bestimmenden Aflatoxine im wesentlichen entspricht. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Mini-Chromatographiesäule,
die in der angegebenen Reihenfolge von unten nach oben je eine Schicht Glaswolle,
granuliertes Natriumsulfat, Magnesiumsilikatgel (Florisil), Kieselgel, neutrales
Aluminiumoxid, granuliertes Natriumsulfat und eine abschließende Schicht Glaswolle
enthält und die vorher in gefülltem Zustand 2 Stunden bei 110° C aktiviert worden
ist, das auf Aflatoxine zu untersuchende Lösungsgemisch in einer abgemessenen Lösungsmenge
aufgibt, anschließend das Lösungsgemisch mit einer abgemessenen Menge eines zur
Entwicklung des Chromatogramms geeigneten Lösungsmittelsystems in absteigender Chromatographie
auf der Säule entwickelt und danach die entwickelten Zonen durch Vergleich mit der
Farb- bzw. Fluoreszenzintensität der Vergleichssäule auf das Vorliegen von Aflatoxinen
prüft und gegebenenfalls deren ungefähre Konzentration bestimmt.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Feststellung
und Bestimmung von Aflatoxinen in pflanzlichen oder tierischen Extrakten. Vorteilhaft
werden die
in an sich bekannter Weise gewonnenen Extrakte in Chloroform
aufgenommen und als Chloroform-Lösungsgemisch im erfindungsgemäßen Verfahren zur
Schnellbestimmung von gelösten Aflatoxinen eingesetzt.
-
Die Anwendung der absteigenden Chromatographie ermöglicht es, genau
abgemessene Probevolumina des zu untersuchenden Lösungsgemisches und des Elutionsmittelsystems
auf die Minisäule aufzugeben. Dies hat den Vorteil einer besseren Reproduzierbarkeit
der erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zur aufsteigenden Chromatographie, wie sie
beispielsweise in DE-OS 24 46 078 beschrieben wird.
-
Zur Elution können verschiedene Lösungsmittelsysteme verwendet werden,
sofern die Aflatoxine darin löslich sind.
-
Ein Elutionssystem, das sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat,
besteht aus Chloroform/Aceton im Volumenverhältnis 9:1.
-
Besondere Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren bietet der für
das erfindungsgemäße Verfahren charakteristische Aufbau der Mini-Chromatographiesäule
aus einer Reihe verschiedener Adsorptionsmittelschichten. Während beim bisherigen
Verfahren gemäß Ausführungsbeispiel in der DE-OS 24 46 078 die für aufsteigende
Chromatographie bestimmte Minisäule im wesentlichen aus zwei verschiedenen
Absorptionsschichten
besteht, nämlich in der Reihenfolge von unten nach oben aus einer sauren Aluminiumoxidschicht
und einer vorher 2 Stunden bei 1100 C aktivierten Kieselgelschicht, wobei letztere
in einer 6mal größeren Schichtdicke als die Aluminiumoxidschicht vorliegt, unterscheidet
sich hiervon die Säulenfüllung für das erfindungsgemäße Verfahren durch den in Anspruch
1 angegebenen, deutlich differenzierteren Schichtenaufbau. Dabei hat sich die Einschaltung
einer Florisilschicht als -besonders vorteilhaft erwiesen, da diese die Aflatoxine
praktisch nicht durchläßt, so daß durch die Grenze Florisil/Kieselgel die Lage der
zu erwartenden Aflatoxinzone bestimmt wird. Während nach dem bekannten Verfahren
selbst bei Einhaltung der vorgeschriebenen Elutionsmenge und -zeit die Lage der
Aflatoxinbande nicht immer sicher vorherbestimmt werden konnte, ergeben sich nunmehr
keine Schwierigkeiten mehr bei der Vorhersage der Lage einer eventuell auftretenden
Aflatoxinbande. Wenn Aflatoxine in dem untersuchten Lösungsgemisch vorhanden sind,
findet man sie nunmehr zuverlässig als scharf begrenzte Zone an der Übergangsschicht
von Kieselgel und Florisil.
-
Die Diffusion der Aflatoxinbande in Aluminiumoxid erfolgt ziemlich
schnell, d.h. in ca. 5 bis 10 Minuten, wobei die Bande sich stark verbreitert und
verwaschene, unbestimmt verlaufende Abgrenzungen aufweist. Bei einer solchen diffusen
Aflatoxinbande ist eine auch nur halbquantitative
Bestimmung kaum
mehr -möglich. Wegen dieser ziemlich rasch verlaufenden, für die Genauigkeit und
Güte der Messungen sehr nachteiligen Diffusion hat sich das bekannte Verfahren nicht
in der Praxis durchsetzen können.
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine unerwünschte Diffusion
der Aflatoxinzone durch die erfindungsgemäß vorgesehene Florisilschicht praktisch
vollständig verhindert, so daß eine Bestimmung des Aflatoxingehalts durch Fluoreszenzmessung
der Aflatoxinzone auch noch nach längerer Zeit, z.B. nach mehrtägigem Aufbewahren
im Dunkeln, mit der erforderlichen reproduzierbaren Genauigkeit möglich ist, ohne
daß eine merkliche Abschwächung der Fluoreszenzintensität der Aflatoxinbande, z.B.
durch Diffusion, eintritt. Aufgrund dieser Stabilität der Aflatoxinzone kann die
Messung auch innerhalb eines längeren Zeitraums beliebig oft wiederholt werden.
-
Die Bestimmung der Aflatoxinkonzentration kann auf zwei Wegen erfolgen.
Der erste Weg bietet sich für eine ungefähre Abschätzung des Aflatoxingehalts an
und ist für eine Schnellbestimmung besonders geeignet. Er besteht in einer visuellen
Abschätzung der Farb- bzw. Fluoreszenzintensität der Aflatoxinzone im Vergleich
mit Vergleichsbanden von vorher vorbereiteten Vergleichssäulen, die die Vergleichssubstanzen
in bekannten abgestuften Konzentrationen
in den Vergleichsbanden
enthalten. Naturgemäß kann eine solche Abschätzung nur zu Annäherungswerten führen.
-
Als Vergleichssubstanz kann vorteilhaft reines Aflatoxin B1 in bekannten
Konzentrationen verwendet werden. Es können aber auch in einer weiteren zweckmäßigen
Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Vergleichssubstanz 1,4-Bis-S2-(5-phenyl-oxazolyl)4-benzol
(POPOP) oder 1,4-Bis-(4-methyl-5-phenyl-oxazolylbenzol (Dimethyl-POPOP) verwendet
werden. Vorzugsweise wird die Fluoreszenzintensität durch Bestrahlen der Minisäule
und der Vergleichssäule unter der UV-Lampe bei 366 nm visuell abgeschätzt.
-
Der zweite Weg einer Bestimmung der Aflatoxinkonzentration ist apparativ
aufwendiger, ermöglicht dafür jedoch ebenso schnell eine ziemlich genaue, reproduzierbare
quantitative Messung der Aflatoxinkonzentration. Diese erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise
durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität mit Hilfe eines Fluoreszenzdensitometers.
Hierzu ist es erforderlich, nach entsprechender, an sich bekannter Fixierung der
Minisäule z.B. auf einer Dünnschichtplatte die fluoreszierende Aflatoxinbande der
Säule unter bekannten Bedingungen (Anregungswellenlänge: 366 nm, Sekundärfilter:
433 nm) im Densitometer zu vermessen.
-
Die Nachweisgrenze dieser Analysenmethode liegt bei ca.
-
1 ppb Aflatoxin. Damit ist diese Methode empfindlich genug, um die
vom Gesetzgeber für Lebensmittel und Futtermittel festgesetzten Höchstmengen an
Aflatoxinen mit Sicherheit überwachen zu können.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Diese Vorrichtung besteht im wesentlichen aus einer an sich bekannten
Mini-Chromatographiesäule und einer Vergleichssäule, zweckmäßig etwa gleicher Abmessungen,
und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Mini-Chromatographiesäule, im folgenden
kurz Minisäule genannt, in der angegebenen Reihenfolge von unten nach oben je eine
Schicht Glaswolle, granuliertes Natriumsulfat, Magnesiumsilikatgel (Florisil), Kieselgel,
neutrales Aluminiumoxid, granuliertes Natriumsulfat und eine abschließende Schicht
Glaswolle enthält, wobei die 2 Stunden bei 1100 C aktivierte Säulenfüllung an beiden
Enden durch zum jeweiligen Säulenende hin offene, körbchenförmige feine Drahtgeflechte
fixiert ist, und daß die Vergleichssäule aus mehreren aufeinanderfolgenden Schichten
aus Kieselgel und Kieselgel/Vergleichssubstanz, gegebenenfalls in abgestuften Konzentrationen,
besteht, wobei die Säulenfüllung unten und oben jeweils durch eine Schicht Glaswolle
und ein zum jeweiligen Säulenende hin offenes, körbchenförmiges feines Drahtgeflecht
fixiert ist.
-
Diese Vorrichtung besitzt gegenüber der aus DE-OS 24 40 078 bekannten
Vorrichtung deutliche Vorteile. Aufgrund der spezifischen, von der Zusammensetzung
der bekannten Vorrichtung deutlich verschiedenen Kombination von drei verschiedenen
Absorptionsmitteln ist es möglich, die gegebenenfalls auftretende Aflatoxinbande
bzw. -zone scharf begrenzt zu erhalten und eine unerwünschte, weil für die Genauigkeit
der Alfatoxinkonzentrationsbestimmung nachteilige Diffusion dieser Zone praktisch
vollständig zu unterbinden.
-
Weitere, für die praktische Anwendbarkeit der Erfindung wichtige Vorteile
sind: die Säulenfüllung kann in der Minisäule durch Anbringung eines körbchenförmigen
feinen Drahtgeflechtes an beiden Säulenenden in der Lage fixiert und anschließend
durch 2-stündiges Erhitzen auf i10° C in der Säule selbst aktiviert werden. Vorteilhafterweise
kann die Minisäule dann an beiden Enden abgeschmolzen werden, wodurch die Säulenfüllung
ihre Aktivität unverändert bis zum Gebrauch beibehält, auch wenn die Säule über
einen längeren Zeitraum, z.B. über mehrere Monate, gelagert wird. Die abgeschmolzene
Minisäule ist auch über längere Strecken transportfähig ohne daß dies einen nachteiligen
Einfluß auf die Gebrauchsfähigkeit der Säulenfüllung hat. Dadurch wird der praktische
Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung erheblich erleichtert.
-
Um das Öffnen der abgeschmolzenen Enden der Minisäule kurz vor dem
Gebrauch zu erleichtern, können beide Enden vorteilhaft mit Sollbruchstellen versehen
sein, die sich kurz vor dem Gebrauch durch leichten Druck abbrechen lassen. Auch
die Vergleichssäule, die mehrere Zonen der Vergleichssubstanz in bestimmten-, abgestuften
Konzentrationen enthält, wird vorzugsweise nach Fixierung d-er Säulenfüllung durch
entsprechend angebrachte körbchenförmige feine Drahtgeflechte an beiden Ende abgeschmolzen.
-Dadurch ist es möglich, die Vergleichssäule längere Zeit zu lagern und für eine
Vielzahl von Vergleichstests zu verwenden, ohne daß dadurch die Farb- bzw. Flureszenzintensität
der einzelnen Vergleichsbanden merklich beeinträchtigt wird.
-
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung wird jede der
Adsorptionsschichten in der Minisäule in einer Schichtdicke angewandt, die in bestimmter
Beziehung zum Durchmesser der Säule steht, und zwar liegt in der Minisäule jede
Schicht mit Ausnahme der Kieselgelschicht in einer Schichtdicke vor, die etwa dem
1,3- bis 2-fachen des inneren Säulendurchmessers entspricht, während die Kieselgelschicht
in einer Schichtdicke vorliegt, die etwa dem 2,5- bis 3,5-fachen des inneren Säulendurchmessers
entspricht.
-
Da bei der an beiden Enden zugeschmolzenen Minisäule nicht ohne weiteres
zu erkennen ist, welches das obere und welches das untere Ende der Säule ist, wird,
um Verwechslungen zu vermeiden, in einer weiteren zweckmäßigen Ausführungsform vorgesehen,
daß die Minisäule zusätzlich mit einer geeigneten Markierung des oberen oder des
unteren Säulenendes und/oder der Florisil/Kieselgel-Grenzschicht versehen ist. Auch
diese Maßnahme dient damit der möglichst einfachen und sicheren Handhabung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung.
-
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird eine für die praktische
Durchführung der vorliegenden Schnellbestimmungsmethode wichtige Voraussetzung geschaffen,
nämlich das es möglich ist, die Vorrichtung aus Minisäule und Vergleichssäule in
Form einer praktikablen, transportierbaren und sofort einsetzbaren Einheit verwenden
zu können, ohne befürchten zu müssen, daß die Aktivität der einzelnen Adsorptionsschichten
sich während Lagerung und Transport wesentlich verändert oder sonstige Umstände
eintreten, die eine chromatographische Abtrennung der Aflatoxine von Störsubstanzen
sowie die sehr empfindliche Bestimmung des Aflatoxingehaltes nachteilig beeinflussen
könnten.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren und die zu seiner Durchführung dienende
Vorrichtung werden anhand der Figuren 1 und
2 sowie eines Beispiels
schematisch und beispielsweise näher erläutert.
-
Figur 1 zeigt einen Querschnitt durch eine mit den verschiedenen Adsorptionsschichten
gefüllte Mini-Chromatographiesäule, Figur 2 zeigt einen Querschnitt durch eine gefüllte
Vergleichssäule.
-
Als Mini-Chromatographiesäule haben sich Rohre aus Pyrexglas bewährt,
die beispielsweise eine Länge von 150 bis 200 mm, einen inneren Durchmesser von
4 bis 6 mm und einen äußeren Durchmesser von 6 bis 9 mm aufweisen. Das Rohr ist
am unteren Ende verjüngt und läuft in einer Spitze aus, die nach der Füllung mit
den Adsorptionsmitteln und der Aktivierung bei 110°C abgeschmolzen werden kann.
Das obere Ende des Rohres ist nicht verengt, vorzugsweise sogar etwa erweitert,
um einerseits das Einfüllen des Füllmaterials zu erleichtern, andererseits aber
auch ein eventuelles Abschmelzen des oberen Rohrendes nicht zu erschweren. Durch
die obere Rohröffnung wird die Minisäule in senkrechter Stellung zunächst mit einem
körbchenförmigen feinen Drahtgeflecht oder einem ähnlich gestalteten, lösungsmitteldurchlässigen
Einsatz 1 versehen, wobei der Einsatz oder das Drahtgeflecht, zweckmäßig mit seiner
korbförmigen Öffnung nach unten, in der Nähe des
Säulenendes plaziert
ist. Anschließend wird die Säule in der angegebenen Reihenfolge befüllt, wobei in
Klammern die ungefähre Schichtdicke angegeben ist; die eingeklammerten Ziffern vor
dem Füllmittel beziehen sich auf Figur 1: (2) Glaswolle (10 mm); (3) Natriumsulfat
(8 bis 10 mm); (4) Florisil (8 bis 10 mm); (5) Kieselgel (16 bis 20 mm); (6) Aluminiumoxid
(8 bis 10 mm); (7) Natriumsulfat (8 bis 10 mm); (8) Glaswolle (10 mm); abschließend
wird ein Drahtkörbchen 9 ähnlich dem am unteren Ende der Säule befindlichen Drahtgeflecht
1 zur Fixierung der Füllung angebracht. Es empfiehlt sich, nach Einfüllen jeder
Schicht die einzelnen Schichten durch mehrmaliges Aufstoßen der Säule auf eine feste
Unterlage zu verfestigen.
-
Die auf diese Weise befüllte Säule wird 2 Stunden bei 1100 C aktiviert.
Sofern die Säule nicht sofort nach der Aktivierung für eine Aflatoxin-Schnellbestimmung
verwendet werden soll, werden die Säulenenden in einigem Abstand von den Drahtkörbchen
abgeschmolzen. Dadurch kann die Säule über längere Zeit gelagert werden, ohne daß
ein Aktivitätsverlust der Säulenfüllung eintritt. Zweckmäßigerweise wird die Minisäule
an den beiden zugeschmolzenen
Enden mit Sollbruchstellen versehen,
um das erforderliche Öffnen kurz vor dem Gebrauch zu erleichtern.
-
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltungsform wird die Minisäule
zusätzlich mit einer geeigneten Markierung des oberen oder unteren Säulenendes versehen.
In der Figur 1 ist diese Markierung 10 am oberen Ende durch das Wort "oben" gekennzeichnet.
Selbstverständlich kann als Markierung jedes geeignete Zeichen angebracht werden.
-
Durch die vorbeschriebene Art der Füllung und die Verwendung von fixierenden
Einsätzen 1 -und 9 werden die einzelnen Schichten in der Säule in ihrer vorbestimmten
Lage festgehalten, so daß sie auch beim niemals ganz erschütterungsfreien Transport
nicht aus dieser Lage herausgebracht werden können; Zur weiteren Erleichterung der
Durchführung der Aflatoxin-Schnellbestimmung kann an der mit dem bloßen Auge nur
schwierig zu erkennenden Florisil/Kieselgel-Grenzschicht eine Markierung angebracht
werden, die anzeigt, daß beim Vorhandensein von Aflatoxinen in einem Lösungsgemisch
die Aflatoxinzone an dieser Stelle auftritt.
-
Als Füllmittel haben sich in praktischen Versuchen die folgenden Typen
besonders bewährt: granuliertes Natriumsulfat: Typ gran., Merck, Nr. 6639;
Aluminiumoxid:
Typ Woelm, neutral, 80 bis 200 mesh, ICN-Pharma./Eschwege, Nr. 02087; Kieselgel:
Typ 60, 70 bis 230 mesh, Merck Nr. 7734; Florisil: ein Magnesiumsilikatgel, 100
bis 200 mesh, Serva/Heidelberg, Nr. 21530.
-
Der Aufbau einer geeigneten Vergleichssäule ist schematisch im Querschnitt
in Figur 2 gezeigt. Die Säule entspricht in ihren Abmessungen in etwa denjenigen
der Mini-Chromatographiesäule der Figur 1. Zweckmäßigerweise wird ebenfalls ein
Rohr aus Pyrexglas mit entsprechenden Abmessungen eingesetzt, in dem aufeinanderfolgende
Schichten aus Kieselgel und Kieselgel/Vergleichssubstanz in verschiedenen Konzentrationen
A bis E angeordnet sind. Beim Füllen der Säule werden die einzelnen Schichten ebenfalls
durch mehrmaliges Aufstoßen der Säule auf eine feste Unterlage verfestigt. Die Schichtdicke
der einzelnen Kieselgelschichten beträgt etwa 20 mm, die Kieselgel/Vergleichssubstanz-Gemische
A bis E haben eine Schichtdicke von etwa 2 bis 5 mm. Die Säulenfüllung wird am unteren
und oberen Ende der Vergleichssäule mit jeweils einer Schicht Glaswolle (2 und 8)
und jeweils einem Drahtkörbchen (1 und 9) oder einem geeigneten anderen Einsatz
fixiert. Nach der Füllung wird die Vergleichssäule zwecksmäßigerweise an den Säulenenden
abgeschmolzen. Sie ist in diesem Zustand längere Zeit, in der Regel mehrere Monate,
haltbar
und kann zu Vergleichszwecken bei einer Vielzahl von Aflatoxin-Schnellbestimmungen
eingesetzt werden, ohne daß die Farb- bzw. Fluoreszenzintensität der Vergleichszonen
A bis E dadurch merklich beeinträchtigt wird.
-
Die Herstellung der in Figur 2 mit A bis E gekennzeichneten Zonen
aus abgestuften Gemischen von Kieselgel/Vergleichssubstanz erfolgt in an sich bekannter
Weise durch inniges Verreiben abgemessener Mengen der Vergleichssubstanz mit einer
ebenfalls abgemessenen Menge Kieselgel.
-
Beispielsweise wird bei Verwendung von POPOP als Vergleichssubstanz
dieses in einer Konzentration von 10 mg/kg in Kieselgel Typ 60 eingearbeitet- und
das Gemisch in einer Reibschale ca. 1/2 Stunde verrieben. Durch Verdünnen dieser
Mischung mit weiterem Kieselgel Typ 60 können Kieselgel/POPOP-Mischungen folgender
POPOP-Konzentrationen hergestellt werden: 4 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg und 0,5 mg/kg.
Die Homogenisierung kan-n durch mehrstündiges Schütteln auf der Schüttelmaschine
erfolgen.
-
Jeweils 9 bis 10 mg der abgestuften Kieselgel/POPOP-Mischungen werden
abwechselnd mit reinem Kieselgel Typ 60 in eine Minisäule gefüllt. Zwischen dem
Aflatox4ngeha'lt der zu untersuchenden Proben und dem POPOP-Gehalt in den einzelnen
Kieselgelschichten besteht die folgende Beziehung:
POPOP im Kieselgel
Aflatoxingehalt der Probe (mg/kg) (/ug/kg) 10 100 5 50 2 20 1 10 0,5 5 Beispiel
50 9 eines auf Aflatoxingehalt zu untersuchenden Erdnuß-Substrats wurden 30 Sekunden
in einer elektrischen Kaffeemühle vermahlen und mit 300 ml einer frisch hergestellten
Mischung von 80 Teilen Acetonitril und 20 Teilen destilliertem Wasser verrührt,
mit 10 9 eines Filtrierhilfsmittels (Celite 545) versetzt, 3 Minuten extrahiert
und dann das Gemisch durch ein Faltenfilter filtriert. Eine Bleiacetat-Lösung wurde
aus 200 g neutralem Blei(II)-acetat durch Erwärmen in ca. 800 ml Wasser hergestellt,
der 3 ml Eisessig zugefügt wurden, worauf mit Wasser auf 1 1 aufgefüllt wurde. Von
dieser Bleiacetat-Lösung wurden 20 ml zu 100 ml des Filtrats zugegeben, anschließend
130 ml Wasser zugesetzt, kräftig gerührt und anschließend das Gemisch 3 Minuten
bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde das Gemsich mit weiteren 10 9 Filtrierhilfsmitteln
versetzt, 1 Minute gerührt und durch ein Faltenfilter filtriert. 125 ml des Filtrats
wurden anschließend in einem
Schütteltrichter 1 Minute lang (60
Schüttelvorgänge) mit 30 ml Toluol extrahiert.
-
Die Toluolschicht wurde nach der Phasentrennung abgetrennt und mit
50 ml 5 %iger wäßriger NaCl-Lösung 1 Minute lang (60 Schüttelvorgänge) gewaschen.
Nach 3-minütigem Stehen wurde die Toluolschicht abgetrennt und 1 Minute lang durch
Schütteln mit ca. 10 9 wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Eindampfen
der Toluollösung bei 400 C in Vakuum wurde der Rückstand in 30 ml Chloroform gelöst.
-
Von der erhaltenen Chloroformlösung wurden 2-ml auf die bereits vorbereitete,
in vertikaler Position am Stativ befestigte Mini-Chromatigraphiesäule gegeben. Man
ließ die Probe auf der Minisäule einziehen und eluierte mit 3 ml Chloroform/Aceton
im Volumenv-erhältnis 9:1. Das erhaltene Eluat wurde verworfen.
-
Nach Beendigung der Chromatographie wurde die Mini-Säule unter der
UV-Lampe bei 366 nm geprüft. Das Vorhandensein von Aflatoxinen wurde im UV-Licht
in der obersten Florisilzone in Höhe der auf der Säule angebrachten Markierung durch
eine scharfe, blaufluoreszierende, ca. 0,5 bis 1 mm breite Zone angezeigt.
-
Zur Abschätzung des Aflatoxingehalts wurde die Minisäule mit einer
Vergleichssäule, die verschiedene bekannte Mengen Aflatoxin in einzelnen Zonen A
bis E enthielt, unter der UV-Lampe verglichen. Dabei wurde die Fluoreszenzintensität
der vorhandenen Aflatoxinbande einer der fünf Banden in der Vergleichssäule zugeordnet
bzw. zwischen zwei dieser Banden interpoliert.
-
Der Aflatoxingehalt konnte auch durch Vergleich mit einer mit der
Vergleichssubstanz POPOP in verschieden abgestuften Konzentrationen beschickten
Vergleichssäule abgeschätzt werden.
-
In beiden Fällen ergab der Vergleichstest einen Aflatoxingehalt der
Probe von ca. 5/ug/kg.
-
Etwas genauer konnte der Aflatoxingehalt in der Minisäule mit Hilfe
eines Fluoreszenzdensitometers bestimmt werden.
-
Nach entsprechender Fixierung der Minisäule auf einer Dünnschichtplatte
konnte die fluoreszierende Aflatoxinbande unter den üblichen Bedingungen (Anregungswellenlänge:
366 nm, Sekundärfilter: 433 nm) im Densitometer vermessen werden. Die Nachweisgrenze
dieser Analysenmethode liegt bei ca. 1 ppb Aflatoxin.
-
Die Messung ergab einen Aflatoxingehalt der Probe von ca.
-
5,6/ug/kg.
-
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der zur Durchführung
dieses Verfahrens eingesetzten Vorrichtung besteht darin, daß die aflatoxinhaltigen
Minisäulen mehrere Tage im Dunkeln aufbewahrt werden können, ohne daß eine Abschwächung
der Fluoreszenzintensität der Aflatoxinbande z.B. durch Diffusion eintritt. Die
gefundenen Meßergebnisse können daher innerhalb dieses Zeitraums beliebig häufig
wiederholt und dabei überprüft werden.