AT239767B

AT239767B - Adsorptionsmittel für Chromatographiesäulen

Info

Publication number: AT239767B
Application number: AT312462A
Authority: AT
Original assignee: Fmc Corp
Priority date: 1962-04-16
Filing date: 1962-04-16
Publication date: 1965-04-26

Description

Adsorptionsmittel für Chromatographiesäulen
Die Erfindung bezieht sich auf die Säulenchromatographie, insbesondere auf ein für diese Zwecke verwendetes verbessertes Adsorptionsmaterial.

Bekanntlich findet die Säulenchromatographie Anwendung bei der Trennung von Mischungen, der Reinigung von Substanzen, der Anreicherung von Materialien aus Lösungen u. dgl. Soll z. B. eine Mischung in ihre einzelnen Bestandteile getrennt werden, so kann die Mischung zunächst in einem Lösungsmittel aufgelöst und hienach die dabei entstehende Lösung der Säule aufgegeben werden, wobei die Lösung die Säule durchläuft und ein Anteil der Mischung im oberen Teil der Säule zurückbleibt. Dann wird die Säule mit verschiedenen Anteilen eines Lösungs- oder Eluierungsmittels ausgewaschen, um das Chromatogramm zu entwickeln ; mit andern Worten : Die Bedeutung der Lösungsmittelzugabe besteht darin, die Mischung oder vielmehr deren Bestandteile durch die Säule zu führen.

Die Wanderungsgeschwindigkeit durch die Säulen ist für jeden Bestandteil spezifisch. Es ist natürlich wünschenswert, dass die Geschwindigkeiten der einzelnen Bestandteile so verschieden als möglich sind, da dadurch die Voraussetzung für die Trennung der Bestandteile geschaffen wird. Vorzugsweise wird das Lösungsmittel kontinuierlich und nicht absatzweise zugegeben. Der Ablauf der Säule wird in verschiedenen Behältern oder Fraktionen aufgefangen, wobei jede Fraktion während einer ganz bestimmten Zeitdauer hergestellt und nach Ablauf derselben durch den folgenden Behälter ersetzt wird.

Die Bestandteile, aus denen sich'die Mischung zusammensetzt, sind in den einzelnen Fraktionen verteilt und liegen dort neben dem Lösungsmittel vor. Somit kann ein Bestandteil in einer einzigen, aber auch in mehreren aufeinanderfolgenden Fraktionen vorliegen. Ein anderer Bestandteil kann in der nächsten Fraktionsgruppe vorliegen, zu der eine oder mehrere aufeinanderfolgende Fraktionen gehören usw.

Die Bestandteile können durch einfaches Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen werden.

Es ist klar, dass die Trennung der Mischung in ihre einzelnen Bestandteile von verschiedenen Bedingungen abhängt, wobei dem Absorptionsmaterial in der Säule die grösste Bedeutung zukommt.

Hauptgegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Adsorptionsmaterials für die Säulenchromatographie in Form von Zellulosekristallitaggregaten, das ein Produkt darstellt, das durch saure Hydrolyse von Zellulose erhalten werden kann, wobei ein säurelöslicher und ein säureunlöslicher Anteil gebildet wird. Der letztere wird durch einen kristallinen Rückstand gebildet. Dieser wird gewaschen und aufbereitet und als Zellulosekristallitaggregat oder als Level-off D. P.-Zellulose bezeichnet. Die Zellulosekristallitaggregate weisen unter anderem den Vorteil auf, dass sie ein ausgezeichnetes Absorptions- und Adsorptionsvermögen bzw. -kapazität für chemische Substanzen besitzen. Von besonderem Interesse ist der Umstand, dass die Kristallitaggregate hydrophobe oder oleophile Substanzen selektiv adsorbieren.

In diesem Zusammenhang ist also die Anwesenheit einer Vielzahl kleiner Fehlstellen und Risse auf der Oberfläche der Kristallitaggregate von Bedeutung. Die Aggregate sind insbesondere durch ihre hohe Reinheit gekennzeichnet, wodurch eine Verunreinigung der Substanzen, mit denen die Aggregate in Berührung kommen, ausgeschlossen wird, was insbesondere bei Pharmazeutika und empfindlichen biochemischen Substanzen, wie Enzyme, von Bedeutung ist. Ein anderer Vorteil der Aggregate ist in ihrer kontrollierbaren Partikelgrösse und Grössenverteilung zu sehen, d, h. Partikelgrösse und Grössenverteilung sind von einem Einsatz zum andern reproduzierbar und können je nach Belieben in einem weiten Bereich variiert werden. Die Herstellung der Kristallitaggregate durch saure Hydrolyse und die Eigenschaften der Aggregate sind im einzelnen in der österr.

Patentschrift Nr. 228805 beschrieben worden.

Es muss beachtet werden, dass der Ausdruck "Kristallite", wie er hier gebraucht wird, einen Bündel von in Längsrichtung angeordneter, nahe beieinander liegender Zelluloseketten oder Moleküle darstellt

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von Teströhrchen gefüllt waren. Jede der Aminosäuren ergab eine bestimmte Farbe auf dem WhatmanFilterpapier. wobei die Farben voneinander entlang des Papierstreifens gut voneinander getrennt waren.

Die Farben wurden durch die Reaktion zwischen Ninhydrin und den Aminosäuren entwickelt. Die Aminosäuren enthaltenden Röhrchen wurden beiseite gestellt und ihr Inhalt zur Feststellung des Stickstoffgehaltes analysiert. Hiebei wurden folgende Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> Versuch <SEP> entsprechend <SEP> Aminosäure <SEP> % <SEP> Stickstoff
<tb> des <SEP> Tüpfeltests
<tb> 6 <SEP> Asparaginsäure'0, <SEP> 06 <SEP>
<tb> 25 <SEP> Histidin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> . <SEP> 35 <SEP> Cystein <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> keine <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP>
<tb>

Das Ninhydrinreagenz wurde durch Auflösung von 2 g desselben in 50 ml Wasser und Zugabe von einer Mischung aus 80 mg Stannochlorid in 50 ml Wasser erhalten.

Die Mischung wurde 24 h im Dunkeln stehen gelassen, wonach der Niederschlag abfiltriert und die Grundlösung des Ninhydrins erhalten wurde.

Beispiel 2 : Luftgetrocknete Holzpulpe in einer Menge von 0, 3 g wurde vermittels Schwefelsäure zu Zucker hydrolysiert entsprechend dem bekannten in"Manual on Chromatrographic Methods-Analyses of Purified Pulps by Quantitative Paper Chromatograph (März 25, 1957)", vonJ. F. Saeman, ForestPro- ducts Laboratory, U. S. Dept. of Agriculture, Madison 5, Wisconsin, beschriebenen Verfahren. Nach Neutralisation und Konzentration wurden 15 ml einer wässerigen Zuckerlösung erhalten, deren Zuckeranteil sich wie folgt zusammensetzte :
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<tb>
<tb> 95, <SEP> 66 <SEP> Gew. <SEP> -0/0. <SEP> Glukose <SEP>
<tb> 2,86 <SEP> Gew.-% <SEP> Mannose
<tb> 1, <SEP> 48 <SEP> Gew.- <SEP> Xylose.
<tb>

Eine mit Zellulosekristallitaggregaten gefüllte Säule wurde unter Anwendung der in Beispiel l beschriebenen Derivate und des dort ebenfalls geschilderten Verfahrens erhalten mit der Ausnahme, dass die Aggregate eine Partikelgrösse zwischen 40 und 250 oder 300 Mikron aufwiesen. Die Zuckerlösung wurde dem Kopf der Säule zugeführt, wonach diese dann die Säule passierte. Während noch etwas der Zuckerlösung oberhalb des Niveaus des Adsorptionsmittels stand, wurden verschiedene Anteile einer Eluierungsmischung aus Äthylacetat, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis 9 : l :. 1 zugegeben. Man liess hienach diese Mischung dauernd in die Säule eintropfen. Insgesamt wurden 45 Fraktionen von je 10 ml gesammelt. Zucker wurde in der 13.. 14. und 15. Fraktion festgestellt, u. zw. unter Anwendung des bekannten Vogel Tüpfeltests. Die 14.

Fraktion wurde bis etwa 1 ml eingedampft. Xylol wurde durch einen Standard-Papierchromatographie-Test, nachgewiesen, um eine quantitative Feststellung der Zucker zu treffen, wie es in dem vorgenannten Buch von Saeman beschrieben ist. Keine der 45 Fraktionen enthält irgendeinen Zucker, wodurch nachgewiesen werden konnte, dass die Glukose und die Mannose in der Säule zurückgehalten worden waren. Es wurde ferner klar, dass die Säule den in der geringsten Konzentration vorliegenden Zucker von den beiden andern getrennt hatte.

Beispiel 3 : Es wurden Chromatographiesäulen mit folgendem Adsorptionsmaterial hergestellt :
1. Zellulosekristallitaggregate der in Beispiel l beschriebenen Art ;
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grösse von weniger als 44 Mikron aufwiesen ;
3. ein handelsübliches Adsorptionsmaterial aus bekannter faseriger Zellulose, die auf eine durchschnittliche Partikelgrösse entsprechend mehr als 74 Mikron (200 Maschen) zerkleinert worden war und die einen Feuchtigkeitsgehalt zwischen 6 und 7 Gew. -0/0 aufwies ;
4. ein handelsübliches Adsorptionsmittel aus bekannten Zelluloseacetatfasern, deren Durchmesser einer Acetatfaser mit 8 Denier pro Faden (etwa 30 Mikron Durchmesser) entsprach.

Dann wurde eine Mischung durch Zugabe von etwa 0, 5 g einer öllöslichen schwarzen Tinte zu 100 g von Baumwollsamenöl bereitet. Diese Mischung wurde dem Kopf jeder der vier Säulen zugeführt, wonach die Mischung sich in den Säulen unter dem Einfluss der Schwerkraft abwärts bewegte. Zu jeder der

Säulen wurde 1 ml der Mischung zugegeben, mit Ausnahme zu der Säule 1, die ein so geringes Durchlassvermögen für die Mischung besass, dass im Anfang nur 0, 1 ml zugegeben werden konnten. Jedoch wurden nach etwa 1 3/4 h insgesamt 0, 8 ml der Säule 1 zugeführt. Beim Fortschreiten des Tests konnte beobachtet werden, dass die Ölmischung in der Säule 1 die bei weitem geringste Abwärtsgeschwindigkeit besass.

Dies wurde auf die sehr hohe Adsorption der Mischung an dem Adsorptionsmaterial zurückgeführt. Säule 1 zeigte ebenso die glatteste Feldtrennung der Mischungsbestandteile, wobei im Bereich von einem hellen Grau am Fuss der Kolonne bis schwarz am Kopf der Kolonne eine Anzahl von Banden auftraten. In der Säule 2 besass die Ölmischung eine schnellere Wandungsgeschwindigkeit als im Falle 1 und die Trennung in Banden war ganz einheitlich. In den Fällen 3 und 4 wurde eine Kanalbildung festgestellt. Die Wirksamkeit der Trennung war sehr viel geringer als in den Fällen 1 und 2.

Beispiel 4: Es wurden drei Säulen mit folgendem Adsorptionsmaterial hergestellt. Nr. 1 und 2, die den Nummern 1 und 2 des vorhergehenden Beispieles entsprechen und Nr. 5 mit bekannter faseriger Zellulose, die derjenigen in Nr. 3 des letzten Beispieles mit der Ausnahme entsprach, dass sie soweit zerkleinert war, dass sie ein 325 Maschensieb passieren konnte. Eine handelsübliche Blautinte wurde jeder Säule am Kopf in gleichen Mengen zugeführt. Die Perkolation wurde während etwa 72 h durchgeführt.

Bei der Untersuchung wurde festgestellt, dass die Säulen 1 und 2 eine Trennung der Bestandteile der Tinte herbeigeführt hatten. Dabei ergaben sich eine Zahl von Banden im Bereich von einem hellen Blau am Fusse der Säule bis zu einem dunklen Blau am Kolonnenkopf. Die Tests 1 und 2 zeigten ferner sehr scharfe und gerade Begrenzungen zwischen den einzelnen Banden, wodurch nachgewiesen werden konnte, dass eine Kanalbildung unterblieben war. Säule 3 besass ausgeprägte Kanäle ; während dort zwar ebenfalls eine gewisse Trennung der Tinte in Banden beobachtet werden konnte, so waren diese jedoch nicht scharf und die Begrenzungen zwischen den Banden verzerrt, wobei jede Bande sich bis in die darüber und darunter liegenden Banden erstreckte.

Beispiel 5: Es wurden die folgenden vier mit Adsorptionsmaterial gefüllten Säulen hergestellt :
Nr. 6 mit demselben Material wie in Nr. 1 des letzten Beispieles mit der Ausnahme, dass es mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet worden ist ;
Nr. 7 mit demselben Material wie in Nr. 1 mit der Ausnahme, dass die Partikel nicht mehr ein 200 Maschensieb (74 Mikron) passieren oder mit andern Worten, die Partikel wiesen eine Grösse von 74 Mikron und mehr auf, bis hinauf zu 250 Mikron ;
Nr. 8 mit demselben Material wie in Nr. l mit der Ausnahme, dass die Partikel durch ein 2QO Maschensieb hindurchfielen, was einer Partikelgrösse unter 74 Mikron entspricht ;
Nr. 9 mit der bekannten faserigen Zellulose nach Nr. 3 mit Partikeln oberhalb einer einem 200 Maschensieb entsprechenden Grösse.

Hienach wurden 4 ml Burnett's rotes Reagenz (red food coloring dye) mit 20 ml Wasser verdünnt.

Entsprechend wurden jeweils 4 ml Burnett's gelbes Reagenz und blaues Reagenz mit 20 ml verdünnt. Dann wurden die drei verdünnten Farblösungen miteinander vermischt und auf ein Gesamtvolumen von 100 ml gebracht. 20 ml der Mischung wurden dem Kopf jeder Säule zugeführt. Nach 96 h war die Farbmischung in den Säulen 6,7 und 8 in eine untere blaue Bande, eine oberhalb dieser angeordneten grünen Bande und eine bräunliche Bande oberhalb der grünen Bande getrennt.

Säule 6 zeigt auch eine rötliche Bande oberhalb der braunen Bande und oberhalb ersterer eine noch dunklere Bande. Dies liess darauf schliessen, dass die ursprünglichen gelben und blauen Farben miteinander eine grüne Farbe ergeben hatten. In der Säule Nr. 9 trat eine Kanalbildung ein und wenn auch eine Trennung der Farben stattfand, so war die Wirksamkeit der Trennung jedoch geringer im Vergleich zu den andern Säulen, auch waren die Begrenzungen zwischen den Wänden weniger ausgeprägt.

Beispiel 6 : Es wurde eine 0, 5 gew.- ige Lösung aus einer öllöslichen gelben Farbe, Parakeet gelb Nr. 6, in Baumwisamenöl hergestellt. Die erhaltene gelbe Lösung wurde am Kopf einer Säule eingegossen, die, Kristallitaggregate von der Art in Säule Nr. 1 des Beispieles 1 enthält. Nachdem die Lösung die Säule in Abwärtsrichtung passiert hatte, traten zwei Banden auf, nämlich eine sehr breite untere Bande mit im wesentlichen der Farbe des Baumwollsamenöls und eine schmalere gelbe Bande, in der sich der gelbe Farbstoff angereichert hatte.

Die Trennung zwischen den beiden Banden war ganz scharf und vollständig. Schon bei einer visuellen Beobachtung konnte festgestellt werden, dass die Aggregate das Öl von dem Farbstoff durch Adsorption getrennt hatten, obgleich letzterer in dem Öl löslich war oder mit andern Worten, die Aggregate hatten eine Entfärbungswirkung auf die Lösung.

Beispiel 7 : Es wurden folgende mit Adsorptionsmaterial gefüllte Säulen hergestellt. Drei Säulen mit den Kristallitaggregaten wie sie in Säule Nr. 1 verwendet wurden, eine Säule mit den Aggregaten

wie in Nr. 2, eine Säule mit der üblichen zerkleinerten faserigen Zellulose wie in Säule Nr, 3 und eine nachfolgend mit der Nr. 10 bezeichnete Säule, die Silikagel mit einer solchen Partikelgrösse enthielt, dass diese auf einem 200 Maschensieb zurückgehalten wurden. Es wurde eine wässerige Mischung von Burnett's wasserlöslichen Gemüsefarben aus Parakeet grün, gelb und rot hergestellt und am Kopf einer jeden Säule eingegossen.

Die Konzentration an jeder dieser drei Farben in der wässerigen Lösung betrug etwa 0, 5 Gew.-la. Nach Perkolation der Farblösung durch jede Kolonne wurden die folgenden Banden in den Kristallitaggregate enthaltenden vier Säulen beobachtet.

Die unterste Bande war gelb und schmal ; darüber lag eine wenig breitere rote Bande ; über dieser lag eine rosa Bande von etwa derselben Breite. Über letztere war eine sehr breite grünlich graue Bande angeordnet. Dann kam eine sehr breite dunkelgrüne Bande und amKopfderSäule lag eine schmale schwarze Bande. Die Trennung zwischen den vorgenannten Banden war sehr scharf. Im Gegensatz hiezu zeigte die Säule mit der üblichen faserigen Zellulose und Silikagel eine sehr geringe Trennung der Farben in bestimmten Banden. Dabei wurde auch eine Kanalbildung beobachtet.

Nach andern bevorzugten Verfahrensweisen werden, anstatt die adsorbierten Substanzen aus der Kolonne durch ein diese durchfliessendes Lösungsmittel oder Eluierungsmittel zu entfernen, jede Bande oder Zone der adsorbierten Substanzen und des Adsorbens getrennt voneinander aus der-Kolonne entfernt und die adsorbierten Substanzen werden hieraus durch, ein geeignetes Lösungsmittel gewonnen, wonach die erhaltenen Lösungen filtriert werden, um das feste Adsorbens zu entfernen. Hienach wird das Lösungsmittel abgedampft, wobei die abgetrennte Substanz zurückbleibt.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass das Adsorptionsmittel mit den darin adsorbierten Substanzen als feuchter Zylinder aus der Kolonne genommen und dann in Sektoren geschnitten wird, wobei jede Sektion einer Bande aus Adsorbens und adsorbierten Substanzen entspricht, wonach letztere durch ein Lösungsmittel, wie beschrieben, gewonnen werden können.

Als Beispiel für andere auf dem erfindungsgemässen Wege durchführbare Trennungen werden angegeben die Isolierung von Hormonen, wie Stilbestrol aus diesen enthaltenden Naturprodukten ; die Abtrennung ungesättigter Fettsäuren, wie sie beispielsweise in Maisöl oder Baumwollsamenöl vorliegen, von gesättigten Fettsäuren, wobei beispielsweise Stearinsäure von Ölsäure abgetrennt werden kann oder die Trennung einzelner ungesättigter Fettsäuren von einer andern. Von besonderer Bedeutung ist die Trennung der Aminosäuren, gleich ob sie in verschiedenen Naturprodukten in Mischung vorliegen oder durch Abbau von Kasein, Kollagen, Gelatine oder andern Proteinen durch Hydrolyse mit verdünnter Säure oder proteolytischen Enzymen erhalten wurden.

Andere Trennungen können beispielsweise mit den in Pflanzen vorliegenden Alkaloiden vorgenommen werden oder an Farbstoffen aus Naturprodukten oder anderer Herkunft sowie mit Sterinen und deren Abkömmlinge aus Naturprodukten. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit besteht bei Isotopen. Ferner kann Blut in wenigstens einige seiner Bestandteile getrennt werden.

Ferner kann die Gewinnung von Vitaminen aus natürlichen Mischungen, in denen die Vitamine vorliegen, durchgeführt werden. Eine solche Mischung kann, beispielsweise nach geeigneter Vorbehandlung, z. B. in petroläther, aufgelöst und dann in die Säule eingebracht werden, wonach Petroläther und Methanol oder andere geeignete Lösungsmittel zur Eluierung des Vitamins verwendet werden können. Nach diesem Prinzip lässt sich Vitamin A, beispielsweise aus tierischer Leber, Vitamin D aus Fischlebertranölen, Tokopherol aus Weizensamenöl, Vitamin B aus Milchprodukten gewinnen. Die Vitamine können nicht nur analysiert, sondern auch gereinigt werden, wie es auch bei pharmazeutischen und chemischen Verbindungen allgemein der Fall ist.

Die Zellulosekristallitaggregate sind ferner für die Desodorierung und/ oder die Entfärbung einer Vielzahl von handelsüblichen Produkten einschliesslich Nahrungsmitteln und Ingredenzien der Nahrungsmittel geeignet.

Es ist verständlich, dass die verschiedenen Wirkungen durch den Adsorptions- und/oder Absorptionsmechanismus bewirkt werden, der der Einfachheit halber als Sorption bezeichnet wird und der natürlich von den angewendeten Lösungs- und Eluierungsmitteln abhängt. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, dass die zu trennende Mischung in einem gesättigten Kohlenwasserstoff wie Hexan, Heptan, petroleumester u. dgl. gelöst wird. Andere Lösungsmittel sind cyclische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan sowie aromatische Kohlenwasserstoffe, Ester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Säuren und Basen.

Die Bestandteile der aufzutrennenden Mischung sollen in dem Eluierungsmittel leicht löslich sein.

Letzteres soll natürlich auch nicht mit den Kristallitaggregaten oder den Mischungsbestandteilen reagieren. Ganz allgemein gesprochen stellen Alkohole, Ester, chlorierte Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe geeignete Eluierungsmittel dar.

Im allgemeinen werden auch Flüssigkeiten mit einer grösseren Polarität als die adsorbierten Substanzen letztere von den Kristallitaggregaten verdrängen. Vorzugsweise stellt das Eluierungsmittel eine

Mischung von wenigstens zwei Lösungsmitteln mit unterschiedlichem Lösungsvermögen für die adsorberten Substanzen dar, wobei wenigstens eines der Lösungsmittel weniger wirksam ist als die andern, d. h. das Lösungsvermögen für die adsorbierten Substanzen soll bei einem Lösungsmittel geringer sein als bei den andern. Wenngleich die vorstehende Beschreibung sich auf die Trennung von Lösungen bezieht, so ist es selbstverständlich, dass hierunter entweder echte Lösungen oder Kolloidale Lösungen oder Dispersionen fallen, die unter dem Mikroskop keine einzelnen Partikel erkennen lassen.

Der Ausdruck"einzelne Partikel" bezieht sich auf die Anwesenheit von voneinander getrennten Partikeln in der Lösung. Im weiteren Sinne ist die Erfindung auch auf kolloidale Dispersionen anwendbar, die getrennte Partikel unter dem Mikroskop erkennen lassen sowie auf die Trennung von stabilen oder instabilen Emulsionen.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verwendung von Zellulosekristallitaggregaten mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad zwischen 15 und 375 Anhydroglukoseeinheiten, einer durchschnittlich einheitlichen Kettenlänge, wobei die Ketten in jedem Aggregat von demjenigen in benachbarten Aggregaten getrennt und frei sind, welche Aggregate ein scharfes Röntgenbeugungsdiagramm sowie eine chemische Reinheit von mindestens 950/0 und einen Aschegehalt von weniger als 100 T. p. M. aufweisen, als Adsorptionsmaterial für die chromatographische Trennung einer Mischung.