DE3628474A1 - Fluessigkeitschromatographiesaeule und vorrichtung zur verwendung derselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Flüssigkeitschromatographie­ säule sowie eine Vorrichtung für die Flüssigkeitschroma­ tographie, in der die erfindungsgemäße Flüssigkeitschroma­ tographiesäule verwendet wird.

Eine bekannte Flüssigkeitschromatographiesäule verwendet eine herkömmliche Platte für die Dünnschichtchromatogra­ phie (im weiteren als TLC bezeichnet). Die TLC-Platte be­ steht aus einer stationären Phase, wie z.B. Silicagel, Aluminiumoxid, usw., die fest auf die Oberfläche einer Glas­ platte aufgebracht ist, und einer Aluminiumfolie, deren Stärke die Verwendung eines Haftmittels, wie z.B. Polyacryl­ säure oder dergl., erlaubt. Die Säule dieses Systems weist die folgenden Vorteile auf:

• a) Jede Probe kann unter Verwendung eines einzigen Lauf­ mittelbehälters aufgetrennt werden.
• b) Aufgetrennte Komponenten der Probe können ohne Ver­ wendung eines besonderen Detektors untersucht werden.
• c) Die Platte kann gelagert werden, während die aufge­ trennten Komponenten auf der Säule fixiert werden.
• d) Viele Verfahren, wie z.B. simultane Trennung mehrerer Proben in einer einzigen Säule und simultane Untersuchun­ gen von verschiedenen Trennbedingungen unter Verwendung eines einzigen Laufmittelbehälters, usw., die mit den herkömmlichen Flüssigkeitschromatographieverfahren schwierig durchzuführen sind, können vereinfacht werden.

Es kommt jedoch häufig vor, daß stationäre Phasen, wie z.B. Silicagel, das in der Lage ist, chemische Bindungen auszu­ bilden, poröse Polymere, usw., die alle im Zuge des Fort­ schrittes der Flüssigkeitschromatographietechniken in den letzten Jahren entwickelt worden sind, bei Verwendung von bekannten Haftmitteln nur sehr schwer in hervorragender Weise auf der Oberfläche einer Glasplatte zu fixieren sind. Darüber hinaus zeigen einige Haftmittel, abhängig von Art und Menge der stationären Phase, nicht ihre sonst üblichen Eigenschaften. Demgemäß kann eine TLC-Platte, wie sie weiter oben beschrieben ist, bei Einsatz neuer stationärer Phasen, wie z.B. des oben beschriebenen Silicagels oder poröser Poly­ mere nur sehr schwer wirkungsvoll verwendet werden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Flüssigkeitschromatographiesäule zu schaffen, bei der die oben beschriebenen, neu entwickelten stationären Phasen, wie z.B. das oben beschriebene Silicagel, unter Beibehaltung der oben beschriebenen Vorteile der bekann­ ten TLC-Platte zu verwenden sind, sowie eine Vorrichtung für die Flüssigkeitschromatographie, bei der eine solche Säule verwendet werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Flüssigkeits­ chromatographiesäule mit einem zylindrischen Kapillarrohr, das in der Lage ist, sichtbares und ultraviolettes Licht durchzulassen, und das mit einer stationären Phase dicht gefüllt ist; und mit einem porösen Laufmittel-Einleitungs­ stab, der herausnehmbar in ein Ende des Kapillarrohres einge­ paßt ist, wobei es möglich sein muß, daß ein Teilstück des Laufmittel-Einleitungsstabes aus dem Kapillarrohr herausragen kann, gelöst.

Besonders bevorzugt ist dabei die Verwendung einer statio­ nären Phase, die aus Partikeln mit einem Durchmesser von 20 µm oder weniger besteht.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich durch einen Druckbehälter, in den ein Ende des Kapillarrohres einschließ­ lich des darin eingepaßten Laufmittel-Einleitungsstabes luft­ dicht hineingeschoben werden kann, wobei es möglich sein muß, daß der Laufmittel-Einleitungsstab in das im Druckbehälter be­ findliche Laufmittel eintauchen kann, aus.

Die erfindungsgemäße Flüssigkeitschromatographiesäule kann unter Beibehaltung der bekannten Vorteile der TLC-Platte mit neu entwickelten stationären Phasen zur Präzisionstrennung verwendet werden. Dabei ermöglicht das erfindungsgemäße Kapillarrohr den Durchtritt von sichtbarem und ultravio­ lettem Licht. Zum Aufbringen des Laufmittels auf die stationäre Phase wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Laufmittel-Einleitungsrohres Gebrauch von einem Kapillar­ phänomen gemacht. Die Erfindung ermöglicht eine besonders effektive Trennung der Komponenten in einer Probe und deren einfache und schnelle Analyse.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen im einzelnen er­ läutert sind. Dabei zeigt:

Fig. 1 einen Längsquerschnitt durch eine Aus­ führungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitschromatographiesäule;

Fig. 2A bis E Längsquerschnitte, die ein An­ wendungsbeispiel der erfindungsgemäßen Säule veranschaulichen;

Fig. 3F zwei Längsquerschnitte, in denen zwei Bei­ spiele der Trennung von Proben durch dieselbe Säule veranschaulicht werden;

Fig. 3G zwei Diagramme, die das Laufverhalten der Komponenten aus Fig. 3F im Verhältnis zur Zusammensetzung des Laufmittels dar­ stellen; und

Fig. 4H einen Längsquerschnitt durch eine Aus­ führungsform der erfindungsgemäßen Vor­ richtung;

Fig. 4I eine ähnliche Darstellung wie in Fig. 4H, bei der zum Vergleich ein erfindungswesentliches Merkmal weg­ gelassen worden ist.

In Fig. 1 ist mit dem Bezugszeichen 1 ein zylindrisches Kapillarrohr aus Glas od. dergl. bezeichnet, das in der Lage ist, sichtbares und ultraviolettes Licht hindurchzu­ lassen, und mit dem Bezugszeichen 4 eine stationäre Phase mit einem Partikeldurchmesser von 20 µm oder weniger, mit der das zylindrische Kapillarrohr 1 gefüllt ist. Die stationäre Phase 4 wird zwischen porösen Filtern 2 und 3 gehalten, die von beiden Enden in das Kapillarrohr 1 ein­ gepaßt und in seinem Inneren befestigt sind. Diese porösen Filter 2 und 3 sind jeweils durch saugfähige Zellstoffwatte od. dergl. ersetzbar. Das Bezugszeichen 5 bezeichnet einen Laufmittel-Einleitungsstab, der herausnehmbar in das Kapillar­ rohr 1 eingepaßt ist und von dem ein Teilstück aus einem Ende des Kapillarrohres 1 herausragt. Der Laufmittel-Einleitungs­ stab 5 besteht aus einem porösen Material, das dazu dient, das Laufmittel 7 hochzusaugen, wobei von einem Kapillarphäno­ men Gebrauch gemacht wird, was z.B. bei Materialien mit feinen Durchtrittsöffnungen oder bei faserigen Materialien auftritt.

Eine beispielhafte Anwendung der erfindungsgemäßen Flüssig­ keitschromatographiesäule wird im folgenden unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschrieben.

Zunächst wird der Laufmittel-Einleitungsstab 5 aus dem zylindrischen Kapillarrohr 1 herausgezogen, wie in Fig. 2A dargestellt. Mittels einer Mikrospritze 6 wird eine Probe auf den porösen Filter 3 aufgebracht. Danach wird das Laufmittel­ Einleitungsrohr 5, wie in Fig. 2B gezeigt bis zum porösen Filter 3 wieder in das Kapillarrohr 1 einge­ schoben. Danach wird die herausragende Spitze des Lauf­ mittel-Einleitungsrohres 5 in das im Vorratsbehälter 8 befindliche Laufmittel 7 eingetaucht, wie in Fig. 2C dar­ gestellt.

Als Vorratsbehälter 8 kann z.B. eine kleinvolumige Proben­ flasche oder dergl. verwendet werden. Durch Eintauchen mehrerer erfindungsgemäßer Säulen in einen einzigen Vor­ ratsbehälter 8 können mehrere Proben gleichzeitig aufge­ trennt werden.

Das Laufmittel 7 wird nun in den Zwischenraum zwischen dem Stab 5 und der Innenwand der Säule gesaugt und gelangt von dort aufgrund eines Kapillarphänomens auf die stationäre Phase 4. Danach steigt das Laufmittel im Inneren der statio­ nären Phase 4 nach oben , wodurch die Komponenten der Probe aufgetrennt werden, wie in Fig. 3 dargestellt.

Bei Verwendung einer relativ groben stationären Phase 4 mit einem Partikeldurchmesser von 30 µm oder mehr ermöglicht das einfache Eintauchen des Kapillarrohres 1 in das Laufmittel 7 ohne Verwendung des Laufmittel-Einleitungsrohres 5, daß das Laufmittel 7 auf die stationäre Phase 4 gelangt, vorausge­ setzt, daß die Höhe des Laufmittels im Vorratsbehälter 8 so gewählt wird, wie z.B. in Fig. 2D dargestellt. Bei einer derartig groben stationären Phase 4 jedoch ist deren Wirksam­ keit zum Auftrennen der Probenkomponenten vermindert und eine Trennung mit hoher Genauigkeit daher unmöglich. Um eine Trennung mit mindestens derselben Genauigkeit wie bei der bekannten TLC-Platte zu erreichen, ist es notwendig eine feine stationäre Phase mit einem Partikeldurchmesser von 20 µm oder weniger zu verwenden. Wird der Laufmittel-Ein­ leitungsstab 5 auch bei Einsatz einer solchen feinen stationären Phase nicht verwendet, erfordert der Anstieg des Laufmittels 7 sehr viel Zeit, auch wenn das Laufmittel­ niveau bis auf eine Höhe wie in Fig. 2D oder sogar noch höher angehoben wird. Eine schnelle Trennung der Proben­ komponenten ist damit unmöglich.

Fig. 2E zeigt die erfindungsgemäße Flüssigkeitschromato­ graphiesäule mit einem übergestülpten Laufmittel -Absorp­ tionsrohr 9. Das Laufmittel-Absorptionsrohr 9 besteht aus einem Kapillarrohr, das ein Absorbens 10 enthält, das dazu dient, das Laufmittel 7, das bis zum oberen Ende des Kapillar­ rohres 1 gestiegen ist, zu absorbieren. Dadurch wird das im Kapillarrohr 1 befindliche Laufmittel in das Absorptionsrohr 9 aufgenommen und schließlich so lange aus dem Vorratsbehälter 8 herausgesaugt, bis das Absorbens 10 mit dem Laufmittel 7 ge­ sättigt ist. Bei Verwendung des Laufmittel -Absorptionsrohres 9 können nicht nur Probenkomponenten aus dem unteren Teil der stationären Phase 4 weiter nach oben gebracht werden, son­ dern auch mehrstufige Gradientelutionen mit Leichtigkeit durch­ geführt werden, die mit der bekannten TLC-Platte nur schwer zu verwirklichen waren.

Fig. 3 zeigt die Resultate von Trennungen einer Xanthenderi­ vatmischung und einer wässrigen Farbstoffmischung mit der erfindungsgemäßen Flüssigkeitschromatographiesäule unter Verwendung von Silicagel mit einer daran gebundenen Octadecyl­ gruppe als stationäre Phase 4 und unter Verwendung einer wässrigen Methanollösung als Laufmittel 7. Dank der Fähig­ keit des Kapillarrohres 1 ultraviolettes Licht durchzulassen kann auch eine abgetrennte Komponente, wie z.B. ein Xanthen­ derivat, das mit sichtbarem Licht nicht nachgewiesen werden kann, mit Hilfe einer Fluoreszenz -Untersuchungslampe auf dieselbe Weise wie bei einer TLC-Platte nachgewiesen werden.

Weiterhin zeigt Fig. 3F die Trennung von Xanthen 11, Theophyllin 12, Koffein 13, Tartrazin 14, Indigokarmin 15, 3-Hydroxy-4-(2,4,5-trimethylphenyl)azo-2,7­ naphtalindisulfonsäure-Natriumsalz 16, Methylorange 17, p -Aminoazobenzol 18 und Brillantkresolgrün 19, alle von der Säule aufgetrennt. Hier bezeichnet das Bezugszeichen 20 das obere Ende des Laufmittelanstieges in der Säule. Es wurde im Experiment festgestellt, daß diese Positionen der entsprechenden Proben­ komponenten sich 1-2 Std. lang nicht ändern, vorausge­ setzt, daß die Säule nach der Trennung aus dem Vorratsbe­ hälter 8 herausgenommen wird, wodurch ein Trennzustand in der Säule über den vorher beschriebenen Zeitraum gehalten werden kann.

Fig. 30 zeigt ein Diagramm, das Veränderungen der entwickelten Positionen der Probenkomponenten bezüglich Veränderungen der Zusammensetzung des Laufmittels 7 darstellt. In der Zeichnung ist auf der horizontalen Achse die Methanolkonzentration im Laufmittel 7 aufgetragen, während die vertikale Achse die entwickelten Positionen der entsprechenden Komponenten dar­ stellt, wenn man die Position des oberen Endes 20 des Lauf­ mittelanstieges als 10 ansetzt. Diese Ergebnisse stimmen mit denjenigen in einem Fall überein, in dem ein normales Flüssig­ keitschromatographie -Kapillarrohr mit derselben stationären Phase 4 gefüllt ist und bei dem dasselbe Laufmittel zur Trennung verwendet wird. Dies legt nahe, daß die Verwendung der erfindungsgemäßen Säule eine Trennung erlaubt, die auf der inhärenten Natur des als stationäre Phase 4 verwendeten Materials beruht.

Nachfolgend soll der Aufbau und die Wirkungsweise einer Aus­ führungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung für die Flüssig­ keitschromatographie unter Bezugnahme auf Fig. 4 beschrieben werden. Aus vielen Anstrengungen in diesem Forschungsgebiet ist deutlich geworden, daß die Verwendung einer sehr feinen stationären Phase mit einem Partikeldurchmesser von 10 µm oder noch weniger eine präzisere Trennung ermöglicht als in einem Fall, in dem eine stationäre Phase mit einem Partikeldurchmesser von etwa 10-20 µm verwendet wird, nicht nur im Fall einer normalen Flüssig­ keitschromatographiesäule, sondern auch im Fall einer TLC-Platte. Dieselbe Tatsache wurde auch in einem Experi­ ment unter Verwendung der erfindungsgemäßen Säule gefunden.

Bei einem stärker verringerten Partikeldurchmesser der stationären Phase jedoch sind die Abstände zwischen den Partikeln ebenfalls stärker verringert und damit der Widerstand gegenüber einem Ansteigen des Laufmittels er­ höht, wodurch eine schnelle Trennung der Probenkomponenten unmöglich wird. In solch einem Fall wird bei einer normalen Chromatographiesäule zur schnellen Trennung ein Hochdruck- Laufmittel zusammen mit einer Speisepumpe verwendet, aber bei einer TLC-Platte ist eine solche schnelle Trennung schwierig, vorausgesetzt, daß außer einer Pumpe keine andere besondere Ausrüstung verwendet werden soll.

Dahingegen ermöglicht es die Verwendung der erfindungsge­ mäßen Säule, daß jedes Laufmittel durch das Anlegen von Druck an den Druckbehälter 21 in eine stationäre Phase 4 gepreßt werden kann, selbst wenn diese sehr fein ist. Die Probenkomponenten können somit schnell getrennt werden.

Für das Anlegen von Druck an den Druckbehälter 21 kann ein normaler Druckkompressor, eine Flüssigkeitsspeisepumpe, usw. verwendet werden. Wird der Druckbehälter 21 so ausgelegt, daß er mehrere Säulen gleichzeitig aufnehmen kann, können mehrere Proben gleichzeitig getrennt werden.

In Fig. 4 bezeichnet das Bezugszeichen 22 ein durch­ sichtiges Abdichtungsrohr zum Befestigen einer Säule im Druckbehälter 21, wobei auf dem Abdichtungsrohr ein Laufmittel -Absorptionsrohr 9, wie es weiter oben be­ schrieben ist, aufgesetzt werden kann. Mit 23 und 24 sind O-Ringe bezeichnet die verhindern sollen, daß der Druck aus dem Druckbehälter 21 nach außen austritt. 25 ist ein Druckrohr, das zur Zuführung eines Hochdruck- Laufmittels und von Luftdruck in den Druckbehälter 21 dient, wodurch der Druck des Laufmittels 7 konstant gehalten wird. Das Druckrohr 25 ist mit einer Druckpumpe (nicht ge­ zeigt) od. dergl. verbunden.

Wenn, wie in Fig. 4I gezeigt, das untere Ende des Kapillar­ rohres 1 in direkten Kontakt mit der Flüssigkeitsoberfläche ohne Verwendung des Laufmittel -Einleitungsstabes 5 ge­ bracht wird, wird die bereits aufgebrachte Probe durch den Kontakt des Laufmittels 7 mit dem Filter 3 dazu gezwungen, in das Laufmittel hinein zu diffundieren, womit die vorliegende Vorrichtung in diesem Falle keinen praktischen Nutzen hat.

Erfindungsgemäß kann die stationäre Phase 4 ohne Verwendung eines Haftmittels durch Einfüllen in das Kapillarrohr 1 be­ reitgestellt werden, wodurch neu entwickelte stationäre Phasen, die z.B. die oben beschriebenen, die schwierig auf eine Platte zu bringen sind, in derselben Art und Weise wie bei der bekannten TLC-Platte mit Leichtigkeit für eine schnelle Analyse verwendet werden, indem man von deren innerer Natur Gebrauch macht.

Erfindungsgemäß ermöglicht die Verwendung von Druck die schnelle Trennung der Probenkomponenten, auch wenn eine sehr feine stationäre Phase 4 verwendet wird, wodurch eine hochpräzise Analyse auf einfache Weise sichergestellt werden kann.

Die in der vorstehenden Beschreibung, in der Zeichnung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombination­ en für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschie­ denen Ausführungsformen wesentlich sein.

• BEZUGSZEICHENLISTE
  (LIST OF REFERENCE NUMERALS)  1 Kapillarrohr
   2 Filter
   3 Filter
   4 stationäre Phase
   5 Laufmittel - Einleitungsstab
   6 Mikrospritze
   7 Laufmittel
   8 Vorratsbehälter
   9 Laufmittel - Absorptionsrohr
  10 Absorbens
  11 Xanthen
  12 Theophyllin
  13 Koffein
  14 Tartrazin
  15 Indigokarmin
  16 3-Hydroxy-4-(2,4,5-trimethylphenyl)azo-2,7- naphtalindisulfonsäure-Natriumsalz
  17 Methylorange
  18 p - Aminoazobenzol
  19 Brillantkresolgrün
  20 oberes Ende des Laufmittelanstiegs
  21 Druckbehälter
  22 Abdichtungsrohr
  23 O - Ring
  24 O - Ring
  25 Druckrohr

Claims (3)

1. Flüssigkeitschromatographiesäule, gekennzeichnet durch ein zylindrisches Kapillarrohr (1), das in der Lage ist, sichtbares und ultraviolettes Licht durchzulassen, und das mit einer stationären Phase (4) dicht gefüllt ist; und durch einen porösen Laufmittel-Einleitungsstab (5), der heraus­ nehmbar in ein Ende des Kapillarrohres (1) eingepaßt ist, wo­ bei es möglich sein muß, daß ein Teilstück des Laufmittel- Einleitungsstabes (5) aus dem Kapillarrohr (1) herausragen kann.

2. Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Phase (4) aus Partikeln mit einem Durchmesser von 20 µm oder weniger besteht.

3. Vorrichtung für die Flüssigkeitschromatographie, in der die Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 1 oder 2 verwendet wird, gekennzeichnet durch einen Druckbehälter (21), in den ein Ende des Kapillarrohres (1) einschließlich des da­ rin eingepaßten Laufmittel-Einleitungsstabes (5) luftdicht hineingeschoben werden kann, wobei es möglich sein muß, daß der Laufmittel-Einleitungsstab (5) in das im Druckbehälter (21) befindliche Laufmittel (7) eintauchen kann.