DE2503442A1

DE2503442A1 - Antivirale substanzen, verfahren zu ihrer herstellung und diese substanzen enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2503442A1
Application number: DE19752503442
Authority: DE
Inventors: Richard Anthony Vere-Hodge
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1974-01-29
Filing date: 1975-01-28
Publication date: 1975-07-31
Also published as: DK141194C; GB1458586A; CH613118A5; FR2258862A1; JPS50116620A; SE400976B; ZA75540B; AU7770075A; FR2258862B1; DK141194B; NL7500955A; IL46524A0; IL46524A; SE7500854L; US3978043A; BE824947A; DK30375A; CA1042877A

Description

"Antivirale Substanzen, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Substanzen enthaltende Arzneimittel" -

Priorität: 29. Januar 1974 - Großbritannien - Nr. 4207/74

Gegenstand der Erfindung sind antivirale Substanzen,- Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Substanzen enthaltende Arzneimittel, die sowohl für human- als auch veterinärmedizinische Zwecke geeignet sind. .

Es ist an sich bekannt, daß doppelstrangige Ribonucleinsäuren, die nachstehend als RNS abgekürzt werden, hochwirksame Interferon-Induktoren und daher von großer Bedeutung für die Breitsprektrum-Prophylaxis von Virusinfektionen sind und in einem geringeren Ausmaß auch zur Behandlung derartiger Infektionen eingesetzt werden können. Sowohl die synthetischen als auch die RNS natürlichen Ursprungs weisen Interferon-Induktoren-Aktivität sowie antivirale Aktivität in Gewebekuitüren und bei Tieren auf. Doppelstrangige Ribonucleinsäuren mit antiviraler Aktivität können z.B." aus Viruspartikeln extrahiert werden, die u.a. in bestimmten infizierten

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Pilzen vorkommen, wie in einigen Stämmen von Penicillium chrjsogenum, Penicilliun funiculosun, Penicillium stoloniferum, Aspergillus niger und Aspergillus foetidus. Außerdem kommen derartige Ribonucleinsäuren in cyt'oplasmatischen Polyhedrosisviren, im P^ovirus-3-virion sov/ie in der replikativen Phagenform von MS2 aus Escheriehia coli und in der replikativen Phagenform von MU9 eines mutanten Escheriehia coli vor.

Die Brauchbarkeit von doppelstrangiger RNS ist jedoch wegen ihrer außerordentlichen kurzen Halbwertszeit im menschlichen Körper und bei zahlreichen Nutztieren und Geflügel' begrenzt. Zum Beispiel beträgt die Dauer eines antiviralen Schutzes nach einer einzigen · subkutanen Injektion einer doppelstrangigen RNS beim Schwein Ie- ' diglich ein oder zwei Tage. Wenn doppeistrangige RNS ein in wirtschaftlicher Weise entwicklungsfähiges Schutzmittel für Nutztiere während einer epidemischen oder einer Virusinfektion sein soll, muß die Schutzdauer mittels einer einzigen Dosis mehr als ein oder zwei Tage anhalten. Es liegt also ein Bedürfnis an einem antiviralen Mittel mit einer längeren Aktivitätsdauer als doppelstrangige RNS allein vor.

Gegenstand der Erfindung sind demzufolge antivirale Substanzen, die im wesentlichen ionische Komplexe-sind, mit dem Kennzeichen, daß die Kationen organische polymere Kationen mit der sich wiederholenden Einheit der allgemeinen Formel I sind

cH₂)_m - Sh₂ - (CH₂J_n -

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in der m und η gleich oder verschieden sind und Zahlen von 3 his 5 bedeuten und in der die Anionen entweder (a) Polyanionen eizer doppelstrangigen Ribonucleinsäure .natürlichen Ursprungs oder (b) Polyanionen eines doppeistrangigen Derivats einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs bedeuten.

Der in Verbindung mit Ribonucleinsäure verwendete Ausdruck "doppelstrangig" bezieht sich auf die Eigentümlichkeit, daß zwei getrennte Ribonucleinsauremoleküle durch V/asser stoff-Brückenbindung zwischen den komplementären Basen längs des Moleküls assoziiert sind. Die Ribonucleinsäuren können verschieden stark "doppelstrangig" sein.

Der Ausdruck "doppelstrangige Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs" betrifft jede doppelstrangige Ribonucleinsäuren die aus den vorgenannten Pilzen extrahiert werden kann, und schließt synthetische doppelstrangige Ribonucleinsäuren, wie Polyinosin- : Polycytidylsäure (Poly I : Poly C)-, Polyadenyl- : Polyuridylsäure (Poly A : Poly U) und Polyguanidyl- : Polycytidylsäure (Poly G : Poly C) aus. '

Der Ausdruck "doppeistrangiges Derivat einer doppeistrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs" betrifft jede doppelstrangige Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs, die einer chemischen oder biochemischen (z.B. enzymatischen) Reaktion unterworfen worden ist, welche die primäre und/oder sekundäre und/oder tertiäre Struktur verändert (z.B. die N-Oxide gemäß DT-OS 2 119 ^3 oder die alkalirr.odifiaierten doppelstrangigen Ribonucleinsäuren gemäß DT-OS 2 201 513). Voraussetzung ist, daß das entstandene Derivat

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noch einen wesentlichen Teil der Basenpaare der komplementären Stränge besitzt.

Die Doppelstrangigkeit einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure oder deren Derivat kann durch zwei Parameter, die Hyperchromizität und den Tm-Wert, charakterisiert werden. Diese Parameter werden durch Aufzeichnen der UV-Absorption des Materials bei 258 ir.u erhalten, während die Temperatur allmählich gesteigert wird. Die W-Absorption einer doppelstrangigen RNS bei dieser Wellenlänge steigt mit steigender Temperatur, bis ein konstanter Wert erreicht ist, der der Absorption dar thermisch denaturierten (z.B. einstrangigen) Ribonucleinsäure entspricht. Die Differenz zwischen den beiden Grenzwerten der Absorption, ausgedrückt als Prozent- '

* ΐ

satz der Absorption der doppelstrangigen Substanz, wird als die "Hyperchromizität" dieser Substanz bezeichnet.

Wenn die W-Absorption bei 258 mu einer doppelstrangigen Substanz gegen die Temperatur aufgetragen wird, so stellt man fest, daß die Absorption bei hohen Temperaturen größer als bei niedrigen Temperaturen .ist. Die Temperatur, bei der die Absorption in der Mitte zwischen der Absorption der doppelstrangigen Substanz und der der thermisch denaturierten (zl"B.~ einstrangigen) Substanz liegt, wird als Tm-Wert dieser Substanz bezeichnet.

Die Kationen der erfindungsgemäßen Komplexe weisen die sich wiederholende Einheit der allgemeinen Formel I auf. Die Gesamtstruktur einer Klasse geeigneter kationischer Anteile kann durch die nachstehende allgemeine Formel II dargestellt werden

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HO -^(CH₂)_m - NH₂ - (CH₂)_n - m₂j-(CH₂)_m - OH (II)

in der m und η die bei der allgemeinen Formel I angegebenen Bedeutungen besitzen und in der X eine ganz Zahl oder ein Bruch — je nach der Länge der Polymerisatkette ist. Vorzugsweise liegt X im Bereich von 4 bis 3000 und besonders vorteilhaft im Bereich von 5 bis 500.

Die in dem erfindungsgemäßen Komplex vorliegenden Polyanionen sind' entweder . .

(a) Polyanionen doppeistrangiger Ribonucleinsäuren natürlichen Ursprungs oder · -

(b) Polyanionen eines doppelstrangigen Derivats einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs.

Vorzugsweise stammen die doppeistrangigen Ribonucleinsäuren aus Virusteilchen, die in bestimmten infizierten Pilzen vorhanden sind, z.B. in bestimmten Pilzen der Gattung Penicillia, z.B. Penicillium chrysogenüm (GB-PS 1 170 929), Penicillium stoloniferum (Banks und Mitarbeiter in '"Nature" 2l8 (1968), Seite 5^2), Penicillium cyaneofulvum (Banks und Mitarbeiter in "Nature" 223 (1968), Seite 155), und Aspergilli, z.B. Aspergillus niger und Aspergillus foetidus (DT-OS 2 113 123)· Vorzugsweise sollten die Polyanionen (a) oder (b) die Interferon-Produktion in lebenden Säugetieren induzieren*, (das kann durch die Methode von G.P. Lampson, A.A. Tytell, A.K. Field, K.M. Nemes und Mr. Hillerman in Proc.Kat.Acad.Sci. 5§ (1967), Seite 782, bestätigt werden.

Die antiviralen Substanzen vorliegender Erfindung sind im wesent-

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lichen als ionische Komplexe beschrieben worden, die durch eine starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem polymeren kationischen Anteil und dem anionischen Anteil der Ribonucleinsäure charakterisiert sind. Es sind jedoch auch andere Arten von Wechselwirkungen möglich.· Zum Beispiel besteht vermutlich eine Art "hydrophober" ■Bindung zwischen den beiden Komponenten. Genaueres über die Art dieser Bindung weiß man jedoch noch nicht.

Bevorzugte erfindungsgemäße Komplexe sind solche, in denen alle oder fast alle anionischen Stellen der doppeistrangigen Ribonucleinsäure-Anionen mittels quartärer Stellen b^i asn Polykationen neutralisiert sind. Solche Komplexe werden als "1 : 1' -Komplexe" oder als "hochneutralisierte Komplexe" bezeichnet. Selbstverständlieh besitzen die Abstände .zwischen den quartären Stellen, d.h. den Werten von m und η bei den allgemeinen Formeln I und II, eine Wirkung auf die Wirksamkeit der einzelnen Polykationen bei der Komplexbildung mit dem RNS-Anion. Zweekmäßigerweise beträgt der Neutralisatiohsgrad über 60, vorzugsweise über 75 Prozent.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der antiviralen Substanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein organisches polymeres Kation mit der sich wiederholenden Einheit der allgemeinen Formel I in wässriger, einen Elektrolyten, enthaltenden Lösung mit entweder

(a) einem Polyanion einer doppeistrangigen Ribonucleinsäure " natürlichen Ursprungs oder

(b) einem Polyanion eines doppelstrangigen Derivats einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs

in Berührung bringt und gegebenenfalls das wässrige Reaktionsge-

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misch verdünnt, bis der Komplex ausfällt.

Wenn die Molarität der Lösung nach dem Zusammenbringen der beiden Komponenten nicht zu hoch "ist, fällt das gewünschte Produkt aus. Wenn jedoch die Elektrolytkonzentration sehr hoch ist, verbleibt der Komplex in Lösung, obwohl genau genommen bei solch hohen Elektrolytkonzentrationen der Komplex wahrscheinlich dissoziiert vorliegt, doch kann er beim Verdünnen als Niederschlag gewonnen werden. Vorzugsweise erfolgt das In-Berührung-Bringen bei hohen ElektrolytkonzentratL onen, und die Komplexe nach vorliegender Er-. findung werden dann durch Verdünnen ausgefällt. ■ ^

Die Komplexe nach vorliegender Erfindung besitzen antivirale Aktivität mit einem breiten Spektrum gegen eine Anzahl von "Desoxyribonucleinsäure- und Ribonucleinsäure-Viren, z.B. gegen den Encephalomyöcarditis-Virus, den Semliki-Forest-Virus, gegen den Maul- und Klauenseuche hervorrufenden Virus und gegen Herpes-Simplex-Virus. Vermutlich induzieren die erfindungsgemäßen Komplexe die Interferon-Produktion in den Wirtszellen und schützen somit gegen den Angriff der Viren. Deshalb sind die.erfindungsgemäßen Komplexe wahrscheinlich eher zur Prophylaxis von Virusinfektionen als zur Behandlung von bereits vorhandenen Infektionen geeignet. Die Komplexe sind im allgemeinen gegenüber dem Abbau durch Ribonuclease widerstandsfähiger als die doppelstrangige Ribonucleinsäure selbst. Es ist jedoch gefunden worden, daß die Komplexe nach vorliegender Erfindung eine Antitumorwlrkung gegen mindestens einige Tumorarten besitzen. · ·

Die Erfindung betrifft daher ferner Arzneimittel, die durch einen

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Gehalt an einer antiviralen Substanz nach vorliegender Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmakologisch unbedenklichen Trägermaterial und/oder Verdünnungsmittel gekennzeichnet sind. .---"·

Die Wahl der Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel richtet sich nach der bevorzugten Art der Verabreichung, Man kann die Arzneimittel z.B. subkutan, intravenös oder intramuskulär injizieren. Der erfindungsgemäße Komplex ist dann im Verdünnungsmittel entweder gelöst oder als feine Dispersion suspendiert. In einigen Fällen ist eine lokale Anwendung zweckmäßig, z.B. beim Auge oder auf Schleimhäuten. Die Arzneimittel vorliegender Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen bei der Behandlung von Virus-Infektionen, z.B. Vaccinen, oder zur Erleichterung bzwV Linderung von Symptomen von Virusinfektionen verwendeten Mitteln verabreicht werden.

Die Beispiele' erläutern die Erfindung. Die Abkürzung "d.s.-RNS" steht für "doppelstrangige Ribonucleinsäure".

Beispiell

(^a) Herstellung eines Polyamin-Ausgangsmaterlals (4/5-polyamin)

20 mMol 1,4-Diaminobutan werden zu einer gerührten 50prozentigen wässrigen Lösung von 20 mMol Glutaraldehyd gegeben. Unter" Wärmeentwicklung bildet sich sofort -ein faseriger roter Niederschlag. Das Reakfcionsgefäß wird auf dem Eisbad gekühlt und der Kieder- ' schlag mit einem Spatel zerkleinert. Bevor man den Rest Diaminobutan zugibt, werden 10 ml Tetrahydrofuran zugesetzt. Nach 30minü-

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tigern Rühren werden zum Reaktionsgemisch 20 iriMol Natriumbo-rhycrid gegeben. Wie sich an der V/asserntoffentwicklung zeigt, verläuft die Reduktion langsam. Der rote Niederschlag wird allmählich blaßgelb. V/enn der Niederschlag mit dem Spatel zerkleinert wird, findet ein weiteres Reduzieren statt. Die Suspension und die Tetrahydrofuran-Wasehwässer (lOO ml) werden in einen Rundkolben überführt und 3 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann K Stunden unter Rückfluß erhitzt. Überschüssiges Hydrid wird durch Zugabe von 1 ml Wasser zerstört. Die Tetrahydrofuran-lösliche Fraktion wird dekantiert, mit einem Tetrahydrofuran-Waschwasser vereinigt und 2 Tage bei -20⁰C stehen gelassen. Es kristallisiert kein Polymerisat aus. Der Reaktionsrückstand wird mit Wasser extrahiert, der Extrakt mit verdünnter Salzsäure auf pH 1,5 eingestellt und dann gegen destilliertes V/asser (4· χ 5 Liter) diarysiert undschließlich gefriergetrocknet. Man erhält 133 mg eines hellbraunen Pulvers, das mit "A" bezeichnet wird. ■

Die Tetrahydrofuranlösung wird eingeengt. Man erhält 1,6 g eines dicken Öls. 1,38 g dieses Öls werden in Wasser suspendiert und mit 5n-Salzsäure (2,1 ml) genau neutralisiert. Man erhält eine ' trübe Lösung, die durch 3nialiges Extrahieren mit je 30 ml Äther geklärt wird. Der Rest der wässrigen Lösung wird 3 Tage lang gegen 1 Liter V/asser am ersten Tag und gegen 5 Liter Wasser an den be-iden folgenden Tagen dialysiert. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 586 mg eines hellbraunen Peststoffes, der als Produkt ¹¹B" bezeichnet wird.

Anhand der NMR-Spektren, der Elementaranaiyse und der Gelfiltrationschromatographie sind die Produkte "A" und "B" gleich. Beim

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NMR-Spektrum findet man 2 breite Maxima bei 8,2 und 6,9, was 5 x auf das Strukturmerkmal -CHp-CHp-CHp und k χ auf -das Struktur-

+
•merkmal -CHp -NHp- zutrifft, wie es für eine Struktur erwartet

wird, wenn X groß ist.

H0(CH₂)₅MH₂(CH₂)₄NH₂ T(CH₂J₅NH₂(CH₂ " " "

Cl Cl Cl Cl

Die Gelfiltrationschromatographie an-"Biogel" (1,5 KoI) zeigt das Vorliegen eines ziemlich hochmolekularen Polymerisats Of^ 50), doch ist der größte Teil der Substanz von einem niedrigeren Molekulargewicht ( X' etwa 10 bis 15). Bei der Elementaranralyse deutet ein höherer Kohlenstoffwert auf überschüssigen Glutaraldehyd hin, der Vernetzungen bildet.

Wegen der Länge des Kohlenwasserstoffes-Anteils kann dieses Polymerisat als sogenanntes "4/5-Polyamin" bezeichnet werden.

(b) Herstellung eines d.s.-RNS/Polyamin-Komplexes

Ein 4/5-Polyamin (28,2 mg "A" und 183,5 rcg "B") in 4 ml einer 4m-Natriumchloridlösung werden zu einer Lösung von j50 ml einer l,25m-Natriumchloridlösung mit 500 mg d.s.-RKS getropft, die von Virus teilchen von Penicilllum chrysogenum ATCC 10002 stammen.· Das Reaktionsgemisch wird ständig gerührt. Die erhaltene klare l,5n> Salzlösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann werden 210 ml destilliertes Wasser sehr langsam zugetropft. Die anfänglich viskose Lösung enthält zahlreiche Bläschen, so daß

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der Beginn des Ausfallens schwierig zu sehen ist."-Wenn jedoch die Salzlösung 1-molar ist, vjird sie bedeutend weniger viskos, und es bildet sich ein feiner Niederschlag.· Dann wird das restliche-Wasser. sehr schnell, nämlich innerhalb 30 Minuten, zugetropft. Der Niederschlag wird von der Suspension, die mit 20 Liter einer 0,15m-Salzwaschlösung vereinigt ist, zentrifugiert. Das." Übers.te-· hende wird dekantiert.■ Das Überstehende enthält 1,4 Prozent RKS, doch verbleiben nach der Filtration lediglich 2 mg (0,3 Prozent) RNS in Lösung. Diese RNS ist keine vollständig doppelstrangige RNS. Der Niederschlag wird wiederum in 0,l5m-Salzlösung bei einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst, gemessen durch UV-Spektr-um eines aliquoten Teils, der in l,5m-Salzlösung gelöst ist. Diese Suspension wird als "C" bezeichnet.

Beispiel 2

(a) Polyamin-Ausgangsmaterial (5/5-Polyamin)

30 mMol 1,5-Diaminopentan werden zu einer Lösung von 4OmMpI Glutaraldehyd in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran getropft. Es bildet sich ein klebriger Niederschlag. Nach 30 Minuten- werden 40 mMol Natriumborhydrid in 10 ml Tetrahydrofuran gegeben- Das Reaktionsgemisch wird wie in Beispiel 1 für die Produkte "A" und "B" angegeben aufgearbeitet. Man erhält 2 Proben, die einmal mit "D" (0,23 g) und zum anderen mit "E" (0,46 g) bezeichnet -werden. Aufgrund der KMR-Spetren kommen den Proben die nachstehenden· Strukturen zu: · · ■

Cl" Cl" HO ⁺

er* ei"

(CH₂)₅0H

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Der Wert von X berechnet sich zu > 10.Der höhere Kohlenstoffwert bei der Elementaranalyse deutet auf einen Überschuß an Glutaraldehyd hin. Dieser Komplex ist ein "5/5-Polyamin".

(b) d.s.-RNS/Polyamin-Komplex

Unter Verwendung von 50 mg der Probe "E" (5/5-Polyamin) wird das in Beispiel l(b) beschriebene Verfahren wiederholt. Man erhält das Produkt "F".

Beispiel 3

(a) Polyamin-Ausgangsmaterial (4/5-Polyamin)

25,03 g frisch destillierter Glutaraldehyd (= 100 Prozent freier' Aldehyd, wie das NMR-Spektrum anzeigt) und 22,0 g (25,1. ml) Diaminobutan werden gleichzeitig zu 3OO ml -Wasser langsam zugetropft, das mechanisch gerührt und auf einer Temperatur um 0⁰C mittels eines Eis/Salzbades gehalten wird. Es bildet sich sofort ein dicker weißer Niederschlag. Nach 45 Minuten werden 500 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran zugegeben, worauf sich der Niederschlag langsam auflöst. Dann werden langsam 10 g Natriumborhydrid zugesetzt. Das-Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur unter Rühren über Nacht stehen gelassen. Eine weitere Zugabe von 1 g Natriumborhydrid gewährleistet eine vollständige Reduktion. Dann wird die Lösung mittels verdünnter Salzsäure schwachsauer gestellt (pH 6), um überschüssiges- Hydrid zu zerstören und das Salz der Polybase zu bilden. Nach dem Abdampfen des Tetrahydrofurans wird die erhaltene Lösung nach Filtrieren intensiv gegen Entsalztes Wasser dialysiert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 9,35 g eines fast weißen Feststoffes, der als "G" be-

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zeichnet wird. Bei der Wiederholung dieses Beispiels werden 5,1 g eines weißen Peststoffes erhalten, der mit "H" bezeichnet wird. Die IIMR-Spektren und die Analysen zeige.n an, daß diese Substanzen gleich der Polybase des Beispiels 1 sind.

(b) d.s.-RNS/Polyamin-Komplex

Zwei Ansätze dieses Komplexes werden in der gleichen Weise wie in Beispiel l(b) beschrieben hergestellt. Beim ersten Ansatz werden 500 mg d.s.-RNS mit 167 mg des "VS-Polyamin-Chlorids" "G" 'und beim zweiten Ansatz 6 g d.s.-RNS mit 2 g des VS-Polyämin-Chlorids ¹¹H" umgesetzt. Beide Verfahren liefern Produkte als sehr feine 'weiße Suspension in einer 0,lm-Salzlösung. ' .

Der.aus "G" gebildete Komplex wird als "j" und der aus. ¹¹H¹¹ gebildete Komplex als "K" bezeichnet. .

Biologische Daten

Daten der Komplexe der Beispiele 1 und 2 ' .

Isotonische Kochsalzlösungen der Komplexe "F" (Beispiel 2) und "C" (Beispiel l) werden für eine biologische Begutachtung eingesetzt. Sie werden mit der ursprünglichen, nicht komplex gebundenen d.s.-RNS bei Mäusen verglichen . Die Substanzen werden inträperitoneal indiziert. Als Testvirus wird der Encephalomyocarditis-Virus (EMC) verwendet. Die-Substanzen werden in den höchsten- Opsierungen verabreicht, von denen man annimmt, daß sie verhältnismäßig nicht-toxisch sind, und dann mit einem Zehntel dieser Dosis. Die Ergebnisse sind aus der Tabelle I ersichtlich.

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Tabelle I

CD OO CO

Anzahl der verendeten

Mäuse je Gesamtzahl

Antivirale Daten

-

VJl

J5 Tage vor
der Infek
tion verab
reicht

1 Tag vor
der Infek
tion verab
reicht

1/10

der Mäuse, in der Gruppe

■ 50

25

ι

9/10

j
(mg/kg);

Dosierung
der Verbin
dung (mg/kg)

0,5

Virus-Dosis 10"^ ⁺)

4/10

Toxizität

2/10

untersuchte
Verbindung

10

Vio

5/10

Dosierung der
Verbindung (mg/kg)

10/10

d.s.-RNS

1

9/10 .

Vio

100

5/10

0/10

<25 '

100

4/10

6/10

6o

MpIt

10

4/9

10/10

0/10

2/9

7/10

>100

It «ti

5/10

0/10

+ ) 10" fache Verdünnung des Virus, etwa lOfacher· Wert der LD₁₅₀ bei der Virusinfektion

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich , daß die erfindungsgemäßen"
Komplexe weniger toxisch als die nicht komplex gebundene d.s.-RlIS sind und deshalb in höheren Dosierungen verabfolgt werden können. Die'antiviralen Daten zeigen, daß, wo d.s.-RNS deutlich weniger
aktiv ist, wenn sie 3 Tage vor der Infektion verabfolgt--wird,--sowohl die Substanz "F" und die Substanz "C" etwa in gleicher V/eise aktiv 3 Tage bzw. 1' Tag vor der Infektion sind. In einer gesonderten Versuchsreihe lediglich unter Verwendung der Substanz "C"_v werden diese Ergebnisse bestätigt, und es wird auch die gleiche Tendenz beobachtet, wenn den Mäusen die Verbindung subkutan verabreicht wird. · ■-.■-.

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Tabelle II

cn ο co

Substanz	Dosierung der Ver bindung (mg/kg)	Antivirale Daten (EMC)	Virus-Dosis 10~⁴	1 Tag vor der Infektion intra- peritoneal verabreicht	Virus-Dosis ΙΟ"*
*nnn*	. 200 20	Anzahl der .verendeten Mäuse aus einer Gruppe von 10 Tieren	2 (7) 5 (10) ·	Virus-Dosis 10"³	ι '(9) • ι (ίο)
d.s.-RNS	10 1·	:7 Tage vor der Infektion intra- peritoneal verabreicht	7 . (10) •9, (9)	' 7 8	2 O) " 5 (8)
Virus-Dosis io->	■ ' 1. 9
t 7 ' 9
10 - 10

Die Sterblichkeit der nicht behandelten Kontrolltiere beträgt 19/20 bei einer Virusinfektion von ΙΟ"-⁵ und 20/20 (20/20) bei einer Virusinfektion von 10" . . .

2. Daten bei 4/5-Polyamin-Komplexen des Beispiels 3 (a) Die akute Toxizität jedes der Komplexe "J" und "K" wird durch intraperitoneale Verabreichung bestimmt und mit den Ergebnissen für die nicht komplex gebundene d.s.-RNS verglichen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III angegeben. Sie zeigen eine bemerkenswert niedrige Toxizität bei der Substanz "K", die aus dem Polyaminansatz "H" hergestellt worden ist. '■ *. ■

T a b e 1 1 "e III

	Träger mate rial	verendet 25	3 Tiere(Gruppe zu ] 50 100 (mg/kg) · .	10 • 10	r	LO Tieren) ■500	.LD₅₀ (mg/kg.) . (graphisch)
Sub stanz	PBS- öi⁺)	3 1	10 6	" 0		29 : 44
d.s.-RNS	0,15m- NaCl	-	-	0	' 7	360
"J"	0,15m- NaCl	- - -	-	0	>500
"K"

+) unvollständiges Freund's Adjuvans

(b) Dauer der Aktivität - Die Dauer des durch die Substanz "K". gegen niedrige und hohe Infektionswerte.des EMS-Virus (88 xLDj-q) wird in einzelnen Zeitintervallen bis zu 5 Wochen' bewertet. Die Zeitintervalle, Dosierungsmengen und Verabreichungswege sind in" den Tabellen IV und V angegeben (i.p. * intraperitoneal; s.o. ».

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subkutan).

Tabelle IV

Dauer des Schutzes eines d.s.-RNS-Komplexes

8 χ LD

'50

Vorbehandlungszeit (Tage)

Substanz Dosis Verabrei img/kg) G hung	1 J 7 (verendete T der Gruppe)	3/10 7/10	21 iere je	-	35 Tieranzahl
d.s.-RNS - 5 ivp. d.s.-RNS 5 s.c.	9/10 0/10	0/10 4/10	- -	- -
"K" 500 ' i.p. "K" 500 s.o.	0/10 2/10	•	7/10 r·	0/10 0/10
Kontrolle	10/10

Tabelle V

80 x LD₁

	Vorbehandlungszeit	10/10 10/10	21 Lere je ^r.	[Tage)
Substanz Dosis Verabrei- (mg/kg) chung	1 I 7 (verendete Tj der Gruppe)	0/10 8/10	-	35 Pieranzahl
d.s.-RNS - , 5 ivp. d.s.-RNS 5 s.o.	0/10 2/10		7/10	-
"K" 500 i.p. "K" 500 s.c.	0/10 9/10		ι/ίο· ■ 9/1Ö ■
Kontrolle	10/10 . '

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Claims

Patentansprüche ■. ·

Antivirale Substanzen, die'im wesentlichen ionische Komplexe sind, dadurch g e k e η _n zeichnet, daß die Kationen organische polymere Kationen mit der sich wiederholenden Einheit der allgemeinen Formel I sind

V;y.·.:." :^(I) :■■■.

in der m und η gleich oder verschieden sind und Zahlen von 3 bis 5 bedeuten und in der die Anionen entweder

(a) Polyanionen einer doppeistrangigen Ribonukleinsäure natürlichen Ursprungs oder ■ ■

(b) Polyanionen eines doppels,trangigen Derivats einer doppel-

strangigen Ribbnucleinsäure natürlichen Ursprungs 'bedeuten..
2. Antivirale Substanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen polymeren Polykationen die allgemeine Formel II aufweisen

HO -RcH₂)_m-NH-(CH₂)_n-NH₂"l· (CH₂)_m-QH (II) .

in der m und η die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und X eine ganze oder gebrochene Zahl größer oder gleich 4 ist.
3. Antivirale Substanzen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X im Bereich von 4 bis 3000 liegt. -'.'-'-
4. Antivirale Substanzen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß X im Bereich von 5 bis -500 liegt.

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5. Antivirale Substanzen nach mindestens einem der verstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die doppelstrangigen Ribonucleinsäuren von Viruoteilchen ableiten, die in infizierten Stämmen von Penicillium- chrysogenum, penicillium stolonifor um, Penicillium cyaneofulvum, Aspergiilus niger ader Aspergillus foetidus gefunden worden sind.
6. Antivirale Substanzen nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß über 60 Prozent der anionischen Stellen der doppelstrangigen P.ibonucleinsäure-Anionen mittels quartärer Stellen der Polykationen neutralisiert sind.
7. Verfahren zur Herstellung der antiviralen Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet/ daß man.ein organisches polymeres Kation mit der sich wiederholenden Einheit der allgemeinen Formel I in wässriger, einen Elektrolyten enthaltenden Lösung mit entweder

(a) einem Polyanion einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs oder

(b) einem Polyanion eines doppelstrangigen Derivats einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs

in Berührung bringt und gegebenenfalls das wässrige Reaktionsgemisch verdünnt, bis der Komplex ausfällt.
8. Verfahren nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektrolyt Natriumchlorid verwendet; .
9. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer antiviralen Substanz nach den Ansprüchen 1 bis 6, gegebenenfalls

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zusammen ir.it mindestens einem pharmakologisch unbedenklichen Trägermaterial und/oder Verdünnungsmittel.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9* gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an zur Behandlung von Virusinfektionen oder zur Linderung von Symptomen von Virusinfektionen verwendeten Wirkstoffen.

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