DK141194B - Fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt complex af polykvaternære ammoniumforbindelser af dobbeltstrenget-ribonucleinsyre-polyanioner eller polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse. - Google Patents

Description

*** VJa (11) FREMLÆ66ELSES8KRIFT IkllSk DANMARK lnt 013 £ f(21) Antegning nr. 5Ο5/75 (22) Indteverat dtn 2@« jan. I 975 (23) lebedag 29· jan. 1975 (44) Antegningen fremlagt og . ,_Q_

fremiæggeieeeekriftet offentilgglert den leD . I yOU

Dl REKTORATET FOR ^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begaretfra den

29. jan. 1974, 4207/74, GB

(71) BEECHAM GROUP LIMITED, Beecham House, Great West Road, Brentford,

Middlesex, GB.

(72) Opfinder: Richard Anthony Vere-Hodge, 1 Hitchurst, Ockley, Dorking,

Surrey, GB.

(74) Fuldmægtig under aagene behandling:

Plougmann & Vlngtoft Patent bureau._________________ (64) Fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt complex af polykvatei·* nsøre ammoniumforhindelser af dobbeltetrenget-ribonucleinsyre-poly* anioner eller polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbelt* strenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt complex af polykvaternære ammoniumforbindelser af a) dobbeltstrenget-ribonuclelnsyre-polyanioner, hvor den dobbeltstrengede ribonucleinsyre er af naturlig oprindelse, eller b) polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse, med hvilke der kan fremstilles farmaceutiske (herunder veterinære) præparater.

Det er nu almindeligt anerkendt, at dobbeltstrengede ribonuclein-syrer er kraftige interferoninduktorer og således skulle være værdifulde ved den bredspektrede profylakse af virale infektioner og, i mindre omfang, ved behandlingen af sådanne infektioner. Dobbeltstrengede ribonucleinsyrer af både naturlig og syntetisk oprindelse har vist sig at have interferoninducerende og antiviral virkning 2 1Λ119 Λ i vævskulturer og i dyr. Blandt de specifikke kilder til interferoninducerende dobbeltstrenget ribonucleinsyre, som har været nævnt, er de viruspartikler, som findes i visse stammer af Penicillium chrysogenum, Penicillium funiculosum, Penicillium stoloniferum, Aspergillus niger og Aspergillus foetidus; cytoplasmisk polyhedro-sisvirus; reovirus-3-virion og den replikative form af MS 2'coliphag og af MU9 mutant coliphag.

Imidlertid begrænses værdien af den dobbeltstrengede ribonucleinsyre af dens yderst korte halveringstid i mennesker og i mange husdyr og fjerkræ. F.eks. varer den antivirale beskyttelse, som fås efter en enkelt dosis dobbeltstrenget ribonucleinsyre administreret ved subcutan injektion i grise, kun 1 eller 2 dage. Hvis dobbeltstrenget ribonucleinsyre skal være et økonomisk anvendeligt beskyttelsesmiddel til husdyr under en virus.-infektionsepidemi, må den beskyttelse, som gives af en enkelt dosis, vare mere end 1 eller 2 dage. Behovet for et antiviralt middel med længere aktivi-tetsvarighed end dobbeltstrenget ribonucleinsyre alene er således klart.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles et antiviralt complex af polykvaternære ammoniumforbindelser af a) dobheltstrenget-ribonucleinsyre-polyanioner, hvor den dobbeltstrengede ribonucleinsyre er af naturlig oprindelse, eller

b) polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse, hvilket derivat er et N-oxid eller et alkalimetalhydroxidmodificeret derivat, hvor organiske polymerpolykationer i vandig opløsning indeholdende en elektrolyt bringes i kontakt med polyanionerne, og den vandige reaktionsblanding fortyndes, om nødvendigt, indtil complexet udfælder, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at de organiske polymerpolykationer indeholder en gentagelsesenhed med den almene formel I

hvor m og n har samme eller forskellig betydning og hver betegner et helt tal 3 - 5.

141194 3

Udtrykket "dobbeltstrenget" anvendt i forbindelse med ribonticlein- 1 syre angiver, at to ribonucleinsyremolekyler er knyttet samen ved hydrogenbinding imellem komplementære baser 1 hvert molekyle. Rlbo-nucleinsyrer kan variere i grad af "dobbeltstrengethed".

Udtrykket "dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse" angiver en hvilken som helst dobbeltstrenget ribonucleinsyre, som kan isoleres fra naturligt forekommende kilder (f.eks. sådanne, som er anført ovenfor i nærværende beskrivelse), og udelukker syntetiske dobbeltstrengede ribonucleinsyrer såsom Poly I: Poly C, ...

Poly A:Poly U og Poly G:Poly C.

Udtrykket "dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse" betegner en hvilken som helst dobbelt’-strenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse, som har været underkastet kemisk eller biokemisk (f.eks. enzymatisk) omsætning, som ændrer den primære og/eller sekundære' og/eller tertiære struktur (f.eks. N-oxiderne beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1941/71 eller de alkalimodificerede dobbeltstrengede ribonucleinsyrer beskrevet i dansk patentansøgning nr. 200/72), forudsat, at det resulterende derivat bibeholder en væsentlig grad af baseparring imellem komplementære strenge. .

Dobbeltstrengetheden af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre eller et derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre kan måles med to parametre, som er kendt som hyperchromiciteten og Tm-værdien. Disse parametre fås ved at måle den ultraviolette absorption i materialet ved 258 nm, medens temperaturen i materialet gradvis forøges. UV--Absorptionsværdien for et dobbeltstrenget materiale ved denne frekvens stiger med stigende temperatur, indtil der er nået en konstant værdi svarende til absorptionen af den termisk·denaturerede (dvs, enkeltstrengede) ribonucleinsyre. Forskellen mellem de to absorptionsyderværdier, udtrykt som en procent af absorptionen i det dobbeltstrengede materiale, kaldes "hyperchromiciteten" for dette materiale. (Den første måling foretages ved stuetemperatur).

Når UV-absorptionen ved 258 nm i et dobbelfcstrenget materiale af-bildes som en funktion af temperaturen, viser det sig, at absorptionen er større end ved lave temperaturer. Den temperatur, ved hvilken absorptionen er midtvejs mellem absorptionen for det dobbeltstrengede materiale og absorptionen for det termisk denaturerede (dvs. enkeltstrengede) materiale, kaldes "fm-værdien" for materialet.

141194 4

Den kationiske del i de omhandlede complexer er en sådan, som har en gentagelsesenhed med formlen I. Den samlede struktur af en klasse af egnede kationiske grupper kan illustreres med den almene formel II

»°fCH2l,-Si2-|ci2ln-SH2-- ^CH2^m-0H 11 I 1χ hvor m og n har den i forbindelse med formlen I anførte betydning, og X betegner et helt eller brudt tal større end eller lig med 4, afhængigt af polymerkædens længde. X ligger fortrinsvis i området mellem 4 og 3000 og især i området mellem 5 og 500.

Polyanionerne i det omhandlede complex er a) dobbeltstrenget-ribonucleinsyre-.polyanioner, hvor den dobbeltstrengede ribonucleinsyre er af naturlig oprindelse, eller b) polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse. Foretrukne kilder til dobbeltstrenget ribonucleinsyre er bl.a. de viruslignende partikler, som findes hos visse Penicillia, f.eks. Penicillium chrysogenum (britisk patentskrift nr. 1.170.929), Penicillium stoloniferum (Banks et al. Nature 218, 542 (1968)), Penicillium cyaneofulvum (Banks et al. Nature 223, 155 (1968)), og hos visse Aspergilli, f.eks. Aspergillus niger og Aspergillus foetidus (britisk patentskrift nr. 1.300.259). Komponent a) eller b) skal fortrinsvis også være i stand til at fremkalde interferonproduktion hos levende pattedyr. (Dette kan bekræftes ved den af Lampson et al. G.P.

Lampson, A. A. Tytell, A. K. Field, N. M. Nemes og Mr. Hillerman i Proc.Nat.Acad.Sci., 58 (1967), 782, angivne metode).

Det omhandlede antivirale stof er beskrevet som et i hovedsagen ionisk complex. Dette complex karakteriseres ved en stærk elektrostatisk gensidig påvirkning mellem den polymere kationiske del og den anioniske ribonucleinsyredel. Der kan imidlertid også optræde andre typer gensidig påvirkning. Det antages f.eks., at der eksisterer en slags "hydrofob" binding imellem de to komponenter, omend en sådan bindings præcise natur endnu ikke er afklaret.

5 uim

De foretrukne coirtplexer er sådanne, i hvilke alle, eller næsten alle, de anioniske positioner i de dobbeltstrengede ribonucleinsyreanioner er neutraliseret af ammoniumpositionerne i polykaticnen. Sådanne cosm-plexer kan kaldes "1:1-complexer^ eller "stærkt neutraliserede complexer". Det er klart, at afstanden mellem ammoniumpositioner (dvs. værdien af m og n i formlerne I og II) vil påvirke en bestemt polykations effektivitet ved complexdannelsen med RNA-anionen. En ladnings neutralisationsgrad er hensigtsmæssigt over 60%, fortrinsvis over 75%.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fortyndes den vandige reaktionsblanding, om nødvendigt, indtil complexet udfældes. Hvis mo-lariteten af opløsningen ikke er for høj, udfælder det ønskede produkt, efter at de to komponenter er bragt i kontakt med hinanden. Hvis elektrolytkoncentrationen derimod er meget høj, kan complexet forblive "i opløsning" (omend complexet strengt taget i sådanne store elektrolytkoncentrationer sandsynligvis er dissocieret) , men det kan isoleres som udfældet stof ved fortynding. Kontakten mellem de to komponenter udføres fortrinsvis ved store elektrolytkoncentrationer, og de omhandlede complexer udfældes ved fortynding.

I forhold til de i dansk fremlæggelsesskrift nr. 135.537 beskrevne forbindelser udmærker de ved fremgangsmåden Ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede forbindelser sig ved at have lavere toxi-citet og længerevarende virkning, hvilket fremgår af sammenligningsforsøg, (jfr. side 13 og 15).

De omhandlede complexer har antiviral virkning med et bredt aktivitetsspektrum mod forskellige DNA- og RNA-vira, f.eks. encephalomyo-carditis (EMC)-virus, Semliki Forest-virus, mund- og klovsygevirus og Herpes Simplex-virus. Det antages, at deres virkningsmåde hovedsagelig består i interferoninduktion i værtscellerne, hvilket medfører beskyttelse mod virusangreb. Af denne grund antages det, at deres primære anvendelighed snarere ligger i profylaksen mod virusinfektioner end i behandlingen af etablerede infektioner. Complexeme er i almindelighed mere modstandsdygtige overfor ribonucleasenedbrydning 6 141 m end den dobbeltstrengede ribonucleinsyre selv. Det har også vist sig, at de omhandlede complexer har anti-tumorvirkning mod mindst nogle tumortyper.

Der kan derfor med de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede stoffer fremstilles farmaceutiske præparater indeholdende et antiviralt complex som ovenfor beskrevet og ét eller flere farmaceutisk tolerable bærestoffer.

Valget af farmaceutisk bærestof bestemmes af den foretrukne administrationsvej og almindelig farmaceutisk praksis. Administrationsvejen kan være injektion, f.eks. subcutan, intravenøs eller intramus-kulær injektion, i hvilke tilfælde bærestoffet vil være en injicer-bar væske, i hvilken complexet suspenderes i form af en fin dispersion. I nogle tilfælde kan topisk applikation af complexet være egnet, f.eks. i øjet eller på slimhinder. Præparaterne kan administreres alene eller i kombination med andre midler, som anvendes til behandling af virusinfektioner (f.eks. vacciner) eller til lindring af symptomerne ved virusinfektioner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i nedenstående eksempler, hvor også egenskaberne hos nogle complexer fremstillet ifølge opfindelsen illustreres. I eksemplerne angiver forkortelsen "d.s. rna" dobbeltstrenget ribonucleinsyre.

Eksempel 1.

a) Fremstilling af polyaminudgangsmaterialet (4/5 polyamin).

20 millimol 1,4-diaminobutan blev sat til en omrørt 50%'s vandig opløsning af 20 millimol glutaraldehyd. Der blev straks under udvikling af varme dannet et fibrøst rødt bundfald. Reaktionsbeholderen blev afkølet i isbad, og bundfaldet blev sønderbrudt med en spatel.

Der blev tilsat 10 ml tetrahydrofuran før tilsætningen af den resterende mængde diaminobutan. Efter omrøring i 1/2 time blev 20 millimol natriumborhydrid sat til reaktionsblandingen. Reduktionen skred langsomt frem, hvilket kunne ses på hydrogenudviklingen, og det røde bundfald blev bleggult. Da bundfaldet var brudt op med en spatel, 141194 7 fandt yderligere reduktion sted. Suspensionen og 100 ml tetrahydro-furan vaskevæsker blev overført til en rundbundet kolbe, som henstod i 3 dage ved stuetemperatur, hvorefter der blev kogt under tilbagesvaling i 4 timer. Den overskydende mængde hydrid blev sønderdelt ved tilsætning af 1 ml vand. Den tetrahydrofuranopløselige fraktion blev fradekanteret, sammenhældt med 1 portion tetrahydrofuranvaskevæske og holdt ved -20"C i 2 dage, men der udkrystalliserede ingen polymer. Remanensen fra omsætningen blev ekstraheret méd vand, pH-værdien blev indstillet på 1,5 ved hjælp af fortyndet saltsyreopløsning, og den vandige ekstrakt blev dialyseret imod destilleret vand {4x5 liter) og derefter frysetørret; produktet var 133 mg lysebrunt pulver, som fik det interne forsøgsnummer PA/5A.

Tetrahydrofuranopløsningen blev inddampet til 1,6 g af en tyk olie.

En del af denne olie (1,38 g) blev suspenderet i vand og nøjagtigt neutraliseret med 5N saltsyreopløsning (2,1 ml), hvorved der blev dannet en uklar opløsning, som blev gjort klar ved 3 ganges ekstraktion med hver gang 30 ml ether. Den resterende mængde af den vandige opløsning blev dialyseret imod vand (lxl liter; 2x5 liter, i 3 dage), hvorefter den blev frysetørret til dannelse af 586 mg lysebrunt fast stof, som fik det interne forsøgsnummer PA/5C.

På basis af NMR-spektrum, elementæranalyse og gelfiltreringschromatografl viste det sig, at prøverne PA/5A og PA/5C lignede hinanden. I HMR-spek-tret var der to brede spidser ved 8,2 og 6,9 (integral 5:4), hvilket svarer til -CH2-CH2-CH2 x 5 og -CH2-&H2- x 4 som ventet for den nedenstående struktur, hvor X er et stort tal.

«v

HO(CH2)5&H2(CH2)4fol2 (CH2)5fe2(CH2)4fe2 (CH^OH

X

Cl" Cl" Cl“ Cl"

Gelfiltreringschromatografi på bio-gel 1,5M viste tilstedeværelse af polymer med høj molekylvægt (X >50), men at det meste af materialet havde lavere molekylvægt (X ca. 10 - 15). Ved elementæranalyse blev fundet et overskud af carbon, hvilket blev tilskrevet en overskydende mængde glutaraldehyd, som dannede nogle tværbindinger.

141194 8 På grund af længden af carbonhydridsektionerne kan denne polymer kaldes en 5/4-polyamin.

b) Fremstilling af d.s. RNA/polyamin-complexer.

4/5-polyamin (PA/5A 28,2 mg; PA/5C 183,5 mg) i 4 ml 4M NaCl blev dråbevis sat til en opløsning af 500 mg d.s. RNA i 30 ml 1,25M NaCl, idet d.s. RNA-materialet var vundet fra viruspartikler i Penicillium chrysogenum ATCC 10002, og reaktionsblandingen blev omrørt konstant. Den resulterende klare 1,5M saltopløsning blev hensat ved stuetemperatur natten over. Derefter blev 210 ml destilleret vand tilsat dråbevis og meget langsomt. I begyndelsen indeholdt den viskose opløsning mange bobler, og det var vanskeligt at se, hvornår udfældningen gik i gang. Da opløsningen imidlertid blev en 1M saltopløsning, blev den meget mindre viskos, og der havde dannet sig et fint bundfald. Den resterende mængde vand blev derefter tilsat hurtigere (1/2 time).

Det udfældede stof blev centrifugeret fra suspensionen og tilsat 20 ml 0,15M saltvandvaskevæske, og den overstående væske blev dekanteret fra. Den overstående væske indeholdt 1,4% af RNA-materialet, men efter filtrering forblev kun 2 mg (0,3%) af RNA-materialet i opløsning, og dette RNA-materiale havde ikke helt dobbeltstrenget karakter. Bundfaldet blev gensuspenderet i 0,15M saltvand ved en koncentration på 20 mg/ml (målt ved UV-spektrum på en alikvot i 1,5M saltvand). Denne suspension fik det interne forsøgsnummer INT 1010.

Eksempel 2.

a) Polyaminudgangsmateriale (5/5 polyamin).

30 millimol 1,5-diaminopentan blev sat dråbevis til en opløsning af 40 millimol glutaraldehyd i 10 ml tørt tetrahydrofuran. Der blev dannet et klæbende bundfald. Efter 1/2 times forløb blev tilsat 40 millimol natriumborhydrid i 10 ml tetrahydrofuran. Produktet blev oparbejdet som beskrevet for PA/5A og PA/5C i eksempel 1, hvorved der blev fremstillet to prøver, som blev betegnet henholdsvis E13/B (0,23 g) og E13/A (0,46 g). På basis af NMR-spektre kunne der tillægges disse prøver følgende struktur: 141194 9 — —

Cl" Cl" Cl" Cl"

HO(CH2)5Sh2 (CH2)5fe2 - (CH2)5fe^-(CH2)5$H2 (CH2)5OH

Jx Værdien for X blev bedømt til at være større end 10. Et overskud af carbon ved elementæranalysen blev tilskrevet en overskydende mængde glu-taraldehyd. Dette complex er en 5/5-polyamin.

b) d.s. RNA/polyamin-complex.

Under anvendelse af 50 mg af prøven E/13A (5/5-polyamin) blev den i eksempel 1 b) beskrevne teknik gentaget, hvorved der blev fremstillet et stof med internt prøvenummer INT 973.

Eksempel 3.

a) Polyaminudgangsmateriale (4/5-polyamin).

25,03 g glutaraldehyd (friskdestilleret, ca. 100% frit aldehyd, bestemt ved NMR-spektrum) og 22,0 g (25,1 ml) diaminobutan blev langsomt og samtidigt sat til 300 ml vand, som blev mekanisk omrørt og holdt nær 0°C ved hjælp af is/salt-bad. Der blev øjeblikkelig dannet et tykt hvidt bundfald. Efter 45 minutters forløb blev 500 ml friskdestilleret tetrahydrofuran tilsat, og det udfældede stof blev langsomt opløst. 10 g natriumborhydrid blev tilsat langsomt, og derefter blev reaktionsblandingen hensat under omrøring natten over ved stuetemperatur. En yderligere portion natriumborhydrid (1 g) blev tilsat for at sikre fuldstændig reduktion. Derpå blev opløsningen indstillet på svagt sur reaktion (pH-værdi 6) med fortyndet saltsyre for at sønderdele den overskydende mængde hydrid og for at danne saltet af polybasen. Tetrahydrofuranet blev afdampet, og den resulterende opløsning blev, efter filtrering, dialyseret udtømmende mod deioniseret vand efterfulgt af frysetørring, hvorved der blev fremstillet 9,35 g af et næsten hvidt fast stof (PA 7). Ved en gentaget fremstilling blev der fremstillet 5,1 g af et hvidt fast stof (PA 8). NMR-Spektrum og analyse viste, at disse materialer lignede den polybase, som blev fremstillet ifølge eksempel 1.

U1194 ίο b) d.s. RNA/polyamin-complex.

To portioner complex blev fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 1 b). I den første portion blev 500 mg d.s. RNA complex-dannet med 167 mg 4/5-polyaminchlorid (PA 7), og i den anden portion blev 6 g d.s. RNA complexdannet med 2 g 4/5-polyaminchlorid (PA 8). Der blev i begge tilfælde fremstillet produkter i form af en meget fin hvid suspension i 0,1M saltvand.

Det første complex (ud fra PA 7) fik det interne forsøgsnummer INT 2004 -T og det andet complex lud fra PA 8) fik forsøgsnummer 2005.

Biologiske data.

1. Data for complexerne fremstillet ifølge eksemplerne 1 og 2.

Isotoniske saltopløsninger af complexerne INT 973 (ifølge eksempel 2) og INT 1010 (ifølge eksempel 1) blev sendt til biologisk afprøvning. De blev sammenlignet med den oprindelige ikke-complexdannede d.s. RNA hos mus. Administrationsvejen var intraperitoneal injektion, og forsøgsviruset var encephalomyocarditis-virus (EMC). Forbindelserne blev administreret i en dosis, der var så stor som mulig, uden dog at være toxisk, og i 1/10 af denne dosis. Resultaterne er anført i nedenstående tabel I.

141194 11 'οϊ υη ο ο χ οί νο ο ο\ ν Η ιο 6> ν ^ α) Q g ft t-3 ft G ______ Η, ο ο ο . Η Η Η

d il 1/1 \ \ V

§ Μ CN σι CN ο +J ω--

^ » « SS S

ι—I Η Ό ν \ Ί.

ιβ ο β » ο ο if) ο +) Ή -Η 01 61 S Η C !Χ Λ Η >: Μ (0 on ---- Η E"C 0 0 Dl q ri r^i m S HH H g1 S 2 O I- ° fi HH .μ Ό 5 ” 2 (Ud) ® g n s z1.

0) CD ® 4-) η n c! λ o -p o o “ η n cg m H ooooo p

(1) i—i r-H i—I rH r—I H

Η Ό S Dir* \ \ \ \ \ -H

φΗ h cd dl H^rmrovo >

n > gtJiH I

rt -H -3 c « o & V < Η Η I w O 4

<U H W

Ό _ O 44 CO 5

rQ Q) H '“I

S4 C cn η φ n oi o · as n o G o ®

+) +14-4 0 1 OOO O U

C CGH CG Η Η H Cl (71 H

< H 01 +> G \ \ \ \ \ \ "

c D144 n 00 σι ^ ^ es 10 G

H cd <u h ®

lj -EdlH > S

4J Ό c! 5 d <J 00 H ~ «j H +* i ra

H CG P

cd <u ^ n cg ‘d HH >

> <U

Η Ό CO '•j •P β *" I R5

C-HCQDl LT) O O r—1 O O

< Λ·Η4ί Η O H 61

U CG \ H G

O O 6> ft Ti g d ---- 44 n 1 o H M-l i cn <: 01 Td S "?

Di G ft I

OH 2

CG Λ · o H

u n cn 00 h 0 O Cl) · C'*' O -—

pH H CG 43 Cl H H

141194 12

Af resultaterne fremgår det, at complexerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mindre giftige end ikke-complex-dannet d.s. RNA, og de kan således gives i højere doser. De anti-virale data viser, at medens d.s. RNA er signifikant mindre aktiv, når den gives 3 dage før infektionen, er både INT 973 og 1NT 1010 næsten lige aktive, når de gives 3 dage og 1 dag før infektionen.

I en separat forsøgsserie under anvendelse af kun INT 1010 kunne disse resultater fastslås, og den samme tendens kunne observeres, når der til musene ad subcutan vej blev givet de i nedenstående tabel II anførte stoffer:

Tabel II

Antivirale data (EMC) INT. Forbin- Antal døde af 10 i hver gruppe nr. delses- dosis Administreret intraperitonealt Administreret intra-(subcutant) 7 dage før infek- peritonealt (subcu-tionen tant) 1 dag før in fektionen

Virusdosis Virusdosis Virusdosis Virusdosis 10-3 10”4 10~3 10"3 1010 200 '7 2 (7) 7 1 (9) 20 9 5 (10) 8 1 (10) d.s. RNA 10 10 7 (10) 1 2 (3) 1 10 9 (9) 9 3 (8)

Mortaliteten hos kontroldyr, som ingen forbindelse fik, var 19 ud _3 af 20 ved en virusbelastning på 10 og 20 ud af 20 (20/20) med en -4 virusbelastning på 10 . (Tallene i parentes i tabellens søjle 4 og 6 angiver antallet af døde dyr efter subcutan administration).

13 1*1194 2. Data for 4/5-polyamin-complexer fremstillet ifølge eksempel 3.

a) Den akutte toxicitet af hver af complexerne INT 2004 og INT 2005 blev bestemt ad intraperitoneal vej og sammenlignet med data for ikke-complexdannet d.s. RNA. Resultaterne er anført i nedenstående tabel IIIf her vises også den bemærkelsesværdigt lave toxicitet af complexet INT 2005 fremstillet ud fra polyaminprøven PA 8.

Tabel III

INT. nr. Fortyn- Døde (gruppestørrelse * 10) LDso (m9A9) dings- 25 50 100 500 .-.- . , (bestemt grafisk) middel mg / kg d.s. RNA PBS 3 10 10 29 olie * 1 6 10 44 2004 0,15M - 07 360

NaCl 2005 0,15M - - 0 0 >500

NaCl PBS = phosphatpufret saltvand.

* Freund's ukomplette adjuvans.

I sammenligning hermed har det ifølge dansk fremlæggelsesskrift nr. 135.537 fremstillede complex en LD^-værdi (mg/kg) på kun 38 ved intraperitoneal injektion.

b) Virkningsvarighed.

Varigheden af den beskyttelse, som fås af INT 2005 imod lave og høje belastningsniveauer af EMC-virus (8 og 80 x LDgQ) blev bestemt på forskellige tidspunkter i løbet af op til 5 uger. Tidsintervallerne, dosisniveauerne og administrationsvejene er anført i tabellerne IV og V (i.p. angiver ad intraperitoneal vej, og s.c. angiver ad subcutan vej) U1T 94 14

Varighed af beskyttelse af d.s. RNA-complexer.

Tabel IV

8 x LD50 Før-behandlingstid (dage)

Middel Dosis Admini- 17 21 35 mg/kg strati- (døde/gruppe- onsvej størrelse)

d.s. SNA 5 i.p. 0/1Q 3/1Q

d.s. RNA 5 s.c. 0/10 7/10

INT. 2005 500 i.p. 0/1Q 0/10 - 0/1Q

INT. 2005 500 s.c. 2/1Q 4/1Q 7/1Q 0/1Q

Kontrol 10/^g

Tabel V

80 x LDcn 50 Før-behandlingstid (dage)

Middel Dosis Admini- 17 21 35 mg/kg strati- (døde/gruppe- onsvej størrelse) d.s. RNA 5 i.p. 0/1Q 10/χο d.s. RNA 5 s.c. 2/10 10/10

Claims (1)

141194 15 Tabel V fortsat INT. 2005 500 i.p. 0/1Q 0/1Q - 1/1Q INT. 2005 500 s.c. 9/1Q ' 8/1(J 7/1Q 9/1Q Dansk patentskrift nr. 135.537 5 i.p. ^10 0/10 8/10 Kontrol ^^10 Af sammenligningsresultaterne i sidste del af tabel V fremgår det klart, at de omhandlede complexer har længerevarende virkning end en repræsentativ forbindelse fremstillet ifølge dansk fremlæggelsesskrift nr. 135.537, idet denne forbindelses virkning er ud-tømt efter en før-bdiandlingstid på 21 dage. 8 af de 10 forsøgsdyr er da døde, hvorimod kun 1 af de med INT. 2005 behandlede dyr er døde, selv efter en før-behandlingstid på 35 dage. Patentkrav. Fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt complex af poly-kvaternære ammoniumforbindelser af a) dobbeltstrenget-ribonucleinsyre-polyanioner, hvor den dobbeltstrengede ribonucleinsyre er af naturlig oprindelse, eller b) polyanioner af et dobbeltstrenget derivat af en dobbeltstrenget ribonucleinsyre af naturlig oprindelse, hvilket derivat er et N-oxid eller et alkalimetalhydroxidmodificeret derivat, hvor organiske polymerpolykationer i vandig opløsning indeholdende en elektrolyt bringes i kontakt med polyanionerne, og den vandige reaktionsblanding fortyndes, om nødvendigt, indtil complexet udfælder, kendetegnet ved, at de organiske polymerpolykationer indeholder en gentagelsesenhed med den almene formel I