DE2448343B2 - Desoxyribonuklease sowie ihre verwendung zur herstellung von desoxyribonukleotiden mit endstaendigem desoxyguanosin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Desoxyribonuklease sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Desoxyribonukleotiden.

In neuerer Zeit haben Verfahren zurr Aufspalten von Nukleinsäure mittels Enzymen ebenso wie die Entdekkung und kommerzielle Herstellung wohlschmeckender Nukleotide (5'-lnosinsäure, 5'-Guanylsäure) und eine Anzahl von Forschungsergebnissen, welche sich auf die Struktur und die Funktion von Desoxyribonukleinsäure (DNS) und Ribonukleinsäure (RNS), welche biologisch eine bedeutende Rolle spielen, beziehen, große Fteachtung gefunden. Dementsprechend ist eine sehr große Anzahl von Nukleasen verschiedener Art von vei schiedenen biologischen Materialien isoliert worden. Die Eigenschaften dieser Enzyme sind untersucht worden, wobei sich einige davon als zur Verwendung als Agentien zum Abbau von Nukleinsäure und ebenso als biochemische Reagentien geeignet erwiesen haben.

Andererseits sind Enzyme, die aus Pankreas und Herz gewonnen wurden, sowie Enzyme, die aus Schlangengift hergestellt wurden, weithin als Desoxyribonukleasen verwendet worden. In neuester Zeit jedoch wurden Enzyme aufgefunden, die sehr spezifisch DNS-Ketten abbauen oder zersetzen, sowie Enzyme, die einen unterschiedlichen Reaktionsmechanismus haben. Beispielsweise ist ein Enzym, welches selektiv eine einzelne DNS-Kette zersetzt, ein Enzym, welches eine Kette einer doppelsträngigen DNS vom Ende her zersetzt, ein Enzym, welches in einer doppelsträngigen DNS einen Einzelstrangbruch bewirkt, ein Enzym, welches eine doppelsträngige Spaltung in einer doppelsträngigen DNS simultan indiziert, ein Enzym, welches nur auf die DNS einer speziellen lebenden Gattung anspricht, ein Enzym, welches spezifisch auf DNS einwirkt, die mit radioaktiven Strahlen bestrahlt worden ist, sowie ein Enzym, welches auf die Basissequenz von DNS spezifisch ist, bekanntgeworden. Das Enzym, welches spezifisch auf die Basissequenz anspricht, ist ein Enzym, welches selektiv oder vorzugsweise Phosphordiesterbindungen zwischen speziellen Basen in einem DNS-Molekül spaltet, und wurde zur Strukturaufklärung von DNS als wesentlich angesehen. Enzyme (Desoxyribonuklease = DNase), welche Desoxyribonukleinsäure (DNS) abbauen oder zersetzen, existieren in verschiedenen lebenden Körpern. Eine breite Vielzahl derartiger Enzvme konnte demnach aus den Geweben von Tieren und Pflanzen sowie aus Kulturen von Mikroorganismen isoliert werden. _

In einer japanischen Veröffentlichung, namhch

»Biochemistry«, VoL 41. Nr. 11. Seiten 749 bis 760,1969,

s wurden Enzyme dieser Art beschrieben, die eine

' gewisse Spezifizität bezüglich der Primärstruktur von

DNS aufweisen, d. h. also bezüglich der Nukleoüdfolge

(Basenfolge), wobei diese Enzyme Bindungen zwischen

spezifischen Basen oder Grundbausteinen verhältnis-

mäßig selektiv spaltea Die genannte Fundstelle zeigt jedoch keine DNase mit einer definierten Spezifizität

In den vorveröffentlichten bekanntgemachten japanischen Pt-Anm. 20 388/69 und 6 834/71 ist beschrieben, daß DNase K, und DNase K₂, welche von kultivierten

,s Zellen von Aspergillus oryzae separiert worden sind, ' Enzyme sind, welche Phosphordiesterbindungen zwischen Desoxyguanosin und Desoxyguanosin sowie zwischen Desoxyguanosin und Desoxyadenosin eines DNS-Moleküls relativ selektiv aufspalten. Diese DNa-

^o sen K, und K₂ haben sich als wertvoll für eine Untersuchung der Struktur und der Funktion von DNS erwiesen. Diese Enzyme haben aber den Nachteil, daß ihre Stabilität nicht ausreichend ist und daß sie wegen der Tatsache, daß sie Endoenzyme sind, nur verhältnismäßig schwierig in großen Mengen (Massenproduktion) hergestellt: werden können.

Die kor.imerzielle Herstellung von Enzymen, die als biochemische Reagentien geeignet sind, bereitet also noch groOie Schwierigkeiten, insbesondere fehlt es an

Enzymen, welche auch gegenüber einer Behandlung bei hohen Temperaturen stabil sind und über lange Zeiten gelagert werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Desoxyribonuklease zu schaffen, bei der die oben

beschriebenen Nachteile nicht auftreten, die eine hohe Temperafjrstabilität aufweist und welche die Möglichkeit gibt, DNS spezifisch abzubauen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Desoxyribonuklease §;eiöst, welche dadurch gekenn-

zeichnet ist, daß sie in einem DNS-Molekül selektiv die Phosphatdiesterbindung zwischen Desoxyguanosin und Desoxyguanosin spaltet, wobei das Phosphat über die 5'-Position der Desoxyribose mit dem einen Desoxyguanosin verbunden bleibt, und daß sie durch aerobes Züchten des Bacillus ATCC 31 084 in einem alkalischen Nährmedium, welches eine Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphor und Kalimmquelle sowie wenigstens ein Metall-Carbonat enthalt, sowie durch ihre Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit hergestellt worden ist.

Den Gegenstand der Erfindung bildet weiterhin die Verwendung dieser E»esoxyribonuklease zur Herstellung von Desoxyribonukleotiden mit endständigem Desoxyguanosin.
Die Desoxyribonuklease nach der Erfindung läßt sich in einem alkali- oder erdalkalimetalicarbonathaltigen Nährmedium herstellen, welches einen pH-Wert von 7,0 bis 11,0, vorzugsweise von 9,0 bis 10,5 hat. Besonders empfiehlt sich dabei, als Carbonat wasserfreies Natriumcarbonat, Kaliumcs.rbonat oder Natriumbicarbonat

fio zu verwenden. Besonders bewährt hat sich ein Nährmedium, welches 0,5 bis 5,0 Gew.-% Stärke, 0,02 bis 0,2 Gew.-% K₂HPO₄, 0,1 bis 1,0 Gew.-% Hefeextrakt und 0,1 bis 2,0 Gew.-% Pepton enthält.

Im einzelnen kann zur Herstellung der erfindungsge-

ft5 mäßen, durch hohe Tempraturstabilität und lange Lagerfähigkeit gekennzeichneten Desoxyribonuklease so vorgegangen werden, daß eine Zucht des Bacillus ATCC 31 084 in dem Nährmedium für etwa 15 bis 120

10

15

den _aerob gezüchtet wird. Das dabei erhaltene > odukt wird dann zum Abtrennen der Bacilluszucht nt p_as Filtrat kann neutralisiert werden, woraufhin organisches Lösungsmittel, wie Methanol, oder '!n anorganisches Salz zum Aussalzen zugegeben wird [Jg₅ so erhaltene Präcipitat schließlich wird gefiltert

^?eij_e Desoxyribonuklease nach der Erfindung kann zur Herstellung von Desoxyribonukleotiden mit endständim Desoxyguan°^sm in der Weise verwendet werden, daß Desoxyribonukleinsäure in einer Konzentration 02 bis 0,3 Gew.-% zu einer Pufferlösung mit einem ^V H Wert von 7 bis 10 gegeben wird, welche die Desoxyribonuklease nach der Erfindung in einer Konzentration von 10 bis 100 Einheiten enthält Die so rhaltene Lösung wird dann für 20 bis 50 Minuten auf ine Temperatur von 35 bis 45° C erwämrt und durch eine chromatographische Säule geleitet Schließlich werden die Nukleotide dann aus der Säule herausgelöst Die Desoxyribonuklease nach der Erfindung, im folgenden als DNase bezeichnet, ist so spezifisch wirksam, daß äußerst selektiv die Phosphatdiesterbindungen zwischen Desoxyguanosin und Desoxyguanosin in DNS gespalten wird, während die Phosphatgruppen in ihrer 5'-Position gelassen werden.

Wie sich im folgenden noch aus der detaillierten Beschreibung der physikochemischen Eigenschaften ergibt hat das erfindungsgemäß geschaffene neue Enzym den Vorteil, daß die Phosphordiesterbindungen zwischen Desoxyguanosin und Desoxyguanosin in einem DNS-Molekül (G-G) ausgesprochen selektiv aufgespalten werden. Das Enzym weist eine hohe Stabilität auf und läßt sich mit großer Ausbeute in der flüssigen Kultur produzieren. Da dieses Enzym sowohl auf eine doppelsträngige DNS als auch auf eine einzelsträngige DNS einwirken kann und die G-G-Bindung spaltet, wodurch DNS-Fragmente erzeugt werden, läßt es sich zu einer Untersuchung der Struktur verschiedener Desoxyribonukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht verwenden. Durch die Verwendung dieses Enzyms können außerdem verschiedene Oligonukleotide welche an ihren Enden Desoxyguanosin aufweisen, hergestellt werden. Es lassen sich also Produkte erzeugen, die als Medikamente oder Gewürze etc auch als Garungshilfen für Nahrungsmittel, sehr nützlich sein können. Die Vorteile, die durch die Erfindung erreicht werden, liegen also dann, daß eine hochaktive DNase geschaffen wird, welche DNS in der angegebenen Weise spezifisch hydrolysiert und eine hohe Lagerstabilität aufweist

Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNase verwendete Mikroorganismus ist ein zur Gattung Bacillus gehörender, DNase erzeugender Stamm, der in einem alkalischen Kultur- oder Nährmedium kultiviert werden muß, welches Metall-Carbonatsalze enthalt. Der Bacillus ATCC 31 084, der noch beschrieben wird, läßt sich erfindungsgemäß wirkungsvoll verwenden.

Der genannte Bacillus ATCC 31 084 wurde von den -Erfindern aus dem Erdboden in Korosawa, Wako-City, Präfektur Saitama, Japan, gewonnen. Der Stamm wurde bei der »American Type Culture Collection« (ATCv.) in Rockwiile, Maryland, 20852, USA, 1230/Parklawn Diine, unter ATCC-Zugangsnummer 31 084 ohne Beschränkung hinterlegt, wobei die Erlaubnis gegeben wurde, daß die Öffentlichkeit zu den Kulturen vollen Zugang haben soll, und zwar am 23. September 1974. Alle Restriktionen hinsichtlich der Verfügbarkeit der niedergelegten Kultur für die Öffentlichkeit sind unwiderruflich aufgehoben. Außerdem wird der obengenannte Stamm durch die Anmelderin während der Lebensdauer des Patentes aufrechterhalten.

Wie noch weiter beschrieben wird, hat der Bacillus ATCC mikrobiologische Eigenschaften, die sich von denjenigen bekannter Stäme unterscheiden, und hat sich als neuer Stamm der Gattung Bacillus herausgestellt br läßt sich auf einfache Weise in einem alkalischen Nährmedium züchten, welches einen pH-Wert von 7,0 bis 11,0, vorzugsweise von 9,0 bis 10,5 hat, und zwar in Gegenwart eines Carbonatsalzes, wodurch dann DNase erzeugt wird. Die Untersuchungen und Klassifikationen zur Bestimmung der mikrobakteriologischen Eigenschaften des Bacillus ATCC 31 084 basieren auf den Verfahren, die in »Aerobic Spore-Forming Bacteria«, von R. E. Gordon und F. E. Clark (United States ι Department of Agriculture, November 1952) und in »Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology«, 1957, beschrieben sind.

Bakteriologische Eigenschaften a) Morphologie

Die Größe der vegetativen Zellen beträgt 0,5 bis 0,7 μ χ 2,0 bis 4,0 μ. Der Stamm ist ein Bacillus und bildet nahe den Enden der Zellen Sporen. Die Sporen haben eine Größe von 0,8 bis 0,1 μ >: 1,0 bis 1,5 μ und sind oval. Die Sporenbehälter sind deutlich geschwollen. Der Bacillus hat pertrichöse Geißeln und zeigt Beweglichkeit. Die Gram-Färbung ist positiv. Säurefe-

45 stigkeit liegt nicht vor. Die morphologische Untersuchung wurde durch Beobachtung des Wachstumsstatus des Stammes in einem Nährmedium durchgeführt, welches aus 10 g Natriumcarbonat, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 20 g Stärke. Ig K₂HPO₄, 0,2 g

50 MgSO₄ · 7 H₂0,15 g Agar un ' Liteir Wasser bestand.

b) Wachstumsstadium in verschiedenen Nährmedien Das Wachstumsstadium in verschiedenen Nährmedien ist in Tabelle 1 dargestellt:

Tabelle 1

Art des Nährmediums

Wachstumsstadium pH-Wert des Nährmediums pH 7,0

Flüssige Bouillonkultur wächst leicht

Bouillon-Agar-Plattenkultur schlechtes Wachstum pH 10,0*)

keine Membranbildiing

kreisförmig, eben oder erhöht; vollkommen bis zur

Kante; die Oberfläche ist glatt und halbtransparent:

Fortsetzung

Art des Nährmedium»

Wachst umssiadiiim pH-Wert des Nährmcdiums pll 7.0

pH 10.0*)

Bouillon-Agar-Schrägkultur schlechtes Wachstum

Bouillon-Gelatine-Stechkultur

Lackmusmilch

es wird keine Verflüssigung der Gelatine beobachtet

wird leicht rot, jedoch wird keine Koagulierung der Milch beobachtet

Ausbreitung, wobei das Ende dunkel und der Zentralbereich glänzend ist; opak und halbtransparent, kein Pigment im Nährmedium

verflüssigt in Schichtform

wächst, jedoch wird keine Koagulation der Milch beobachtet; da das Nährmedium alkalisch ist, wird auch keine Verfärbung des Lackmus beobachtet

Der pH-Wert jedes Mediums wurde durch Hinzufügen von 1% NarCOi auf 10,0 eingestellt.

c) Physiologische Eigenschaften

Die Beobachtungen beziehen sich auf Nährmedien, welche durch Hinzufügen von 1% Na₂CO₃ zu den in der Veröffentlichung von N. R. Smith et al., wie oben zitiert, beschriebenen Nährmedien erhalten wurden.

1. Nitratreduktion: ja

2. Denitrierungsreaktion(Denitration):

keine Denitrierungsreaktion wurde beobachtet.

3. MR-Test:

Da das Nährmedium alkalisch war, wurde eine Verfärbung des Methylrots nicht beobachtet.

4. VP-Test: negativ

5. Indolbildung: nein

6. Schwefelwasserstoffbildung: nein

7. Stärkehydrolyse:ja

8. Verwendung von Zitronensäure: geringe Verwendung

9. Verwendung von Nitrat und Ammoniumsalz: geringer Verbrauch

10. Pigmentbildung: keine

11. Urease: positiv

12. Oxidase: positiv

13. Katalase: positiv

14. Optimaler pH-Bereich: etwa 10,0

15. Optimaler Temperaturbereich: 35 bis 50° C

16. Sauerstoffbedarf: aerob

17. O-F-Test:

unter aeroben Bedingungen zur Bildung von Säure wird Wachstum beobachtet

18. Verwendung von Kohlenstoffträgern: verwertet Laktose, Arabinose, Xylose, Glukose, Mannose, Inosit, Fruktose, Galatose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Mannit und Stärke zur Produzierung von Säure; kein Gas wird beobachtet; Sorbit und Glycerin werden njcht verwertet

19. Widerstandsfähigkeit:gegen Natriumchlorid: leichtes Wachstum bei 5% Natriumchlorid.

Die obengenannten bakteriologischen Eigenschaften wurden mit denjenigen bekannter Bacillus-Stämme verglichen. Es zeigte sich, daß der Bacillus ATCC 31 084 dem Bacillus circulans ähnlich ist, weil die Sporenbehäl ter definitiv geschwollen sind, die Sporen oval sind, bei Kohlenstoffträgerverwertung kein Gas produziert und auch kein Indol erzeugt wird. Außerdem ist die Voges-Proskauer-Reaktion (VP-Test) negativ und es erfolgt kein Wachstum bei 65° C. Die Stämme sind jedoch offensichtlich insofern hinsichtlich ihrer cha rakteristischen Eigenschaften voneinander verschieden.

als der Bacillus ATCC 31 084 grampositiv ist, der Bacillus circulans jedoch gramnegativ. Der Wachütums-pH beträgt 7,0 bis 11,0, mit einem Optimum von etwa 10,0 beim Bacillus ATCC 31 084 jedoch etwa 5,5 beim Bacillus circulans. Da der Bacillus ATCC 31 084 deutlich von dem bekannten Stamm unterscheidbar ist, und zwar wegen der vorstehenden genannten charakteristischen Eigenschaften, insbesondere wegen der Tatsache, daß der optimale pH-Wert für das Wachstum bei 10 liegt, also auf der basischen Seite, wird es als zweckmäßig angesehen, diesen als neuen Stamm der Gattung Bacillus anzusehen.

Das Nährmedium, welches bei der Erfindung verwendet wird, kann entweder fest oder flüssig sein, in jedem Fall sollte es jedoch ein alkalisches Nährmedium sein, welches ein Carbonatsaiz enthält und einen pH-Wert von 7,0 bis 11,0, vorzugsweise von 9,0 bis 10,5 hat. Es wird demzufolge ein Nährmedium verwendet, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelie sowie organische Salze etc. enthält, die für das Wachstum von Mikroorganismen notwendig sind, wobei ein Carbonatsaiz hinzvigegeben wird. Beispielsweise kann ein Nährmedium durch Hinzufügen eines Carbonatsalzes zu einer Zusammensetzung erzeugt werden, welche lösliche Stärke, Pepton, Hefextrakt, K₂HPO₄ und MgSO₄ · 7 H₂O enthält. Beispiele geeigneter Carbonsalze sind wasserfreies Natriumcarbonat. Kaliumcarbonat und Natriumbicarbonat Die Konzentration des zugefügten Carbonates kann 0,5 bis 1,5% betragen. Die nachfolgenden experimentellen Ergebnisse zeigen klar, daß ein Metall-Carbonat zu dem obengenannten Nährmedium hinzugefügt werden sollte, um seinen pH-Wert auf die basische Seite zi verschieben.

Die Bacillus ATCC 31084 wurde in jedes dei genannten Nährmediem, zu denen die verschiedener Carbonatsalze in den in Tabelle 2 gezeigten Konzentra tionen hinzugefügt worden waren, inokuliert Außerden erfolgte eine Inokulation in Nährmedien, die durct Entfernen der Carbonatsalze aus den vorstehender Nährmedien erhalten wurden, wobei 1% NaCI oder KC hinzugefügt und der pH-Wert durch Natriumhydroxk auf 10 eingestellt wurden. Die Kultur wurde bei 35° C gemischt oder geschüttelt Dann wurden das Wachstun der Mikroorganismen und das DNase-Produkt unter sucht. Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt Da Wachstum der Mikroorganismen wurde dadurcl gemessen, daß in eine Küvette die nach eine Kultivierung von 18 Stunden erhaltene Kulturlösunj

eingegeben und Licht mit einer Wellenlänge von 560 πιμ verwendet wurde. Die Aktivität der DNase wurde mit der noch zu beschreibenden Methode gemessen, in dem die Kulturlösung nach einer Kultivierung für drei Tage verwendet wurde.

Tabelle 2

Zugefügte Salze	pH vor der	Wachstum	Aktivität der
	Kultivierung		DNase
			(Einheiten/
			ml)
Ohne Zusatz	7,0	0,6	unter 100
	10,0	0,8	100
NaCl	7,0	0,8	100
	10,0	0,8	100
KCl	7,0	0,8	100
	10,0	1,0	100
NaHCO3
0,5%	9,0	1,0	1650
1,0%	9,2	1,1	1900
1,5%	9,3	1,1	2050
2,0%	9,5	1,0	1970
Na2COa
0,5%	9,6	1,1	1600
1,0%	10,0	1,1	2160
1,5%	10,2	1,2	2160
2,0%	10,5	1,0	1980
K2CO3
0,5%	9,8	1,1	1400
1,0%	10,2	1,1	2050
1,5%	10,3	1,0	2050
2,0%	10,5	U	1960

Aus diesen Ergebnissen ist zu entnehmen, daß das Vorliegen eines Metall-Carbonats im Nährmedium für die Erzeugung der gewünschten DNase wesentlich ist.

Der Bacillus ATCC 31 084 kann günstig durch eine aerobe Schüttelkultur oder eine entsprechende Rührkultur gezüchtet werden, jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann die Zucht 24 bis 96 Stunden bei 30 bis 37° C geschüttelt werden, woraufhin die Zellen aus der Kulturlösung entfernt und das Carbonatsalz, welches zum Nährmedium hinzugefügt wurde, mit Essigsäure oder einer ähnlichen Säure neutralisiert wird. Ohne Neutralisierung können eine drei- bis vierfache Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Methanol, direkt zur Kulturlösung hinzugefügt werden, aus der die Zellen entfernt worden sind. Auch kann Ammoniumsulfat in einer Menge von etwa 500 g pro Liter Kulturlösung verwendet werden, um die Kuiturlösung auszusalzen, wodurch die DNase präzipitiert wird Das Präzipitat wird dann gefiltert, entwässert und getrocknet und bildet das DNase-Rohenzympulver.

Ein Beispiel des Verfahrens zum Abtrennen der DNase von dem resultierenden Rohenzympulver und zum Reinigen wird nachstehend angegeben. Das Rohenzympulver wird zunächst in Wasser aufgelöst und dann über Nacht mit fließendem Wasser dialysiert Wenn die dialysierte Lösung durch eine DÄAÄ-Zellulosesäule hindurchgeleitet wird, die mit einem 0,01-M-Tris-HCl-Puffer mit einem pH von 8,0 äquiUbriert worden ist, wird die DNase von der DÄAÄ-Zellulose absorbiert Die in der Säule absorbierte DNase wird dann herausgelöst oder ausgewaschen, indem die Konzentration des Natriumchlorids von 0,01m auf 0,5M geändert wird. Die aktiven Teile werden gesammelt und konzentriert, woraufhin eine Gelfiltration mittels eines verzweigten Dextranpolymeren mit einem Molekulargewicht von 3000 bis 70 000 und 4000 bis 150 000 als Molekularsieb folgen. Das Filtrat wird lyophilisierl, um ein gereinigtes DNase-Pulverzu ergeben.

Die Aktivität der so erfindungsgemäß hergestellten DNase wird wie folgt gemessen: 0,02 ml einer Enzymlösung (eine Enzymlösung, welche in geeigneter Weise mit einem Puffer verdünnt worden ist, so daß die Absorption bei 260 πιμ schließlich im Bereich von 0,4 bis 0,6 liegt), 0,1 ml jedes Puffers und 0,1 ml einer 2-mg/ml-DNS-Lösung reagieren 30 Minuten lang bei

is 40⁰C. Dann wird die Reaktion abgebrochen, indem eine kalte PCS-Lösung (7% Perchlorsäurelösung) in einer Menge von 0,5 ml zugefügt werden. Die Reaktionsmischung läßt man dann 20 Minuten in Eis stehen. Dann werden 2,5 ml kaltes Wasser hinzugegeben. Nach intensivem Rühren wird die Reaktionsmischung 10 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert. Die Absorption des überstehenden Teiles wird bei 260 πιμ gemessen. Eine enzymatische Aktivität von einer Einheit wird als diejenige enzymatische Aktivität definiert, die die Absorption bei 260 πιμ um 0,1 unter den vorstehenden Bedingungen ändern kann.

Die erfindungsgemäße DNase wird zur Hydrolysierung von DNS beispielsweise unter den folgenden Bedingungen verwendet: Eine geeignete Menge erfindungsgemäßer DNase wird mit einem Substrat gemischt, welches durch Auflösen von DNS in einem 1/10-M-Boratpuffer mit einem pH von 8,5 in einer Konzentration von 0,2 bis 0,3% erhalten wurde. Dann läßt man bei 40° C für eine geeignete Zeitdauer reagieren. Die Menge des zugefügten Enzymes und die für die Reaktion erforderliche Zeit sind je nach dem zu erzielenden Zweck unterschiedlich. Soll beispielsweise die DNS vollständig säurelöslich bleiben, so werden 100 Teile DNase mit 1 ml von 1/10-M-Boratpuffer mit einem pH von 8,5 und einem DNS-Gehalt von 0,2% gemischt, woraufhin die Reaktion bei 40⁰C mehr als 30 Minuten erfordert. Dementsprechend wird die DNS im wesentlichen säurelöslich. Um die DNS teilweise zu spalten, wird die DNase-Menge auf etwa 10 Teile geändert, wobei die Reaktionszeit weiterhin auf weniger als 30 Minuten herabgesetzt wird. Weiterhin läßt sich ein Oligonukleotid, mit G am Ende, erhalten, indem erfindungsgemäße DNase verwendet wird. Beispielsweise kann mittels der DNase abgebaute DNS

durch eine DÄAÄ-Harnstoffsäule geleitet werden, wobei Tri-, Tetra- und Pentanukleotide etc. mit G am Ende separiert werden können.

Die Roh-DNase läßt sich mit guter Stabilität bei 5° C 12 oder 24 Monais oder sogar länger lagern. Das gereinigte Enzym ist in seinem lyophilisierten Zustand bei 5°C mehr als 6 Monate beständig. Bei -2O⁰C ist es mehr als 12 Monate beständig. Die physikochemischen Eigenschaften der erfmdungsgemäßen DNase werden nachfolgend beschrieben.

1) Aktivität und Substratspezifizität

Das erfindungsgemäße Enzym wirkt auf einsträngige oder doppelstränige DNS zur Bildung eines Oligonukleotides ein. Die Struktur des abgespalteten Teiles des resultierenden Oligonukleotides, weiches mit der Zeit durch das vorliegende Enzym gebildet wird, wurde untersucht, wobei die Resultate in Tabelle 3 dargestellt sind.

•Jno 04/117

Tabelle 3

Zeit zur
Hydrolyse
von DNS
durch
Bacillus
ATCC 3)
084-DNase
(min)

Ausmaß der Art der Endnukleolide der durch Hydrolyse die DNase produzierten der DNS Oligonukleotide

Behändlung

(1)

Behändlung

(2)

Behandlung

(3)

27,8
42,8
72,2
98,9

(G)

G G G G (A) (T)

G G G G

Dabei ist zu beachten:

Behandlung (1): Fhosphodiesterase aus Schlangengift wurde

zur Reaktion verwendet.

Behandlung (2): Alkaliphosphatase und anschließend Phosphordiesterase aus Schlangengift wurden zur Reaktion verwendet (das 5'-Ende wurde als ein Nukleosid entdeckt).

Behandlung (3): Alkaliphosphatase und anschließend Pankreasphosphordiesterase wurden zur Reaktion verwendet (das 3'-Ende wurde als Nukleosid nachgewiesen). G: Desoxyguanosin.
A: Desoxyadenosin.
T: Thymidin.
—: Zeigt, daß kein Nukleosid nachgewiesen

wurde.

(): 2!eigt, daß das Nukleosid in Spuren nachgewiesen wurde.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das 5'-Ende und das 3'-Ende des Oligonukleotides, welches aus DNS durch das Enzym nach der Erfindung gebildet weräen, Desoxyguanosin sind, und daß das resultierende Oligonukleotid 3'-OH und 5'-P-Gruppen aufweist. Dementsprechend hat das Enzym eine derart hohe Spezifizität, daß beim Aufspalten von DNS bis zu einem Ausmaß von bis zu 72% lediglich Phosphordiesterbindungen zwischen Desoxyguanosinen aufgespalten werden, während die 5'-P-Gruppen belassen werden. Wenn DNS bis zu etwa 99% aufgespalten wird, werden Spuren von Desoxyadenosin und Thymidin am 5'-Ende gefunden, jedoch ist ein größerer Teil (mehr als 90%) Desoxyguanosin. Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Enzym eine außerordentlich hohe Spezifizität hat.

2) Optimaler pH-Wert

Der optimale pH-Wert-Bereich des erfindungsgemäßen Enzyms wurde untersucht unter Verwendung eines Essigsäuresalzes für den pH-Wert-Bereich 4 bis 5, eines Phosphorsäuresalzes für den pH-Wert-Bereich von 5 bis 8, von Tris-HCl für den pH-Wert-Bereich von 8 bis 9 und unter Verwendung von Glycinnatriumhydroxyd iür den pH-Bereich von 9 bis 11. Wie sich aus F i g. 1 ergibt, beträgt der optimale pH-Wert für das erfindungsgemä-3e Enzym 7 bis 10, besonders 9,0. Zu beachten ist noch, daß die in Fig. 1 gezeigte Aktivität des Enzyms beim pH-Wert 9,0 als 100% angesehen wird.

3) Stabiler pH-Bereich

Das vorliegende Enzym (0,01 ml) und 0,025 ml jedes Puffers eines Essigsäuresalzes (für den pH-Bereich 4 bis 5), KH₂PO₄-Na₂B₄O₇ (für den pH-Bereich 6 bis 9,5) und Glycinnatriumhydroxyd (für den pH-Bereich 9 bis 11) werden 10 Minuten bei 5O⁰C erwärmt Dann wird die Restaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms gemessen. Wie sich klar aus F i g. 2 ergibt, wird das Enzym bei einem pH-Wert von 6 bis 9,5 kaum deaktiviert, auch

dann nicht, wenn es bei 5O⁰C 10 Minuten erwärmt wird sondern bleibt sehr stabil.

4) Temperaturstabilität

Zu 0,01 ml des erfindungsgemäßen Enzyms werder einmal 0,025 ml Tris-HCL (pH 9,0) und zum anderer KH₂PO₄-Na₂B₄O₇ (pH 9,0), jeweils als Puffer, hinzugegeben. Beide Mischungen werden nacheinander bei einer bestimmten Temperatur 10 Minuten lang erwärmt. Dann wird die Restaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms in beiden Pufferlösungen gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig.3 wiedergegeben, wobei das Symbol »o« den Fall der Verwendung von Tris-Hydrochlorsäure und das Symbol »·« den Fall der Verwendung von KH₂PO₄-NA₂B₄O₇ als Puffer betrifft. Fig.3 zeigt, daß der KH₂PO₄-NA₂B₄O₇-Puffer das erfmdungsgemäße Enzym stabilisiert. Weiterhin wurde auch die Temperaturstabilität der DNase K, und DNase K₂ in ähnlicher Weise untersucht, und zwar unter Verwendung von KH₂PO₄-NA₂B₄O₇ als Puffer. Für beide Substanzen ergeben sich die auf der in F i g. 3 mit dem Symbol »x« gekennzeichneten Kurve liegenden Werte, woraus sich die überlegene Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms ergibt.

5) Bereich der Arbeitstemperatur
0,2 ml der in Ziffer 4) verwendeten Puffer, also w 1 ns-Hydrochlorsäure einerseits und KH₂PO₄-NA₂B₄O₇ andererseits, sowie 0,2-ml-DNS-Lösung werden 10 Minuten lang bei den aus F i g. 4 ersichtlichen Temperaturen erwärmt. Dann werden 0,005 ml des erfindungsgemalien Enzyms in geeigneter Weise verdünnt zugegexs ben, anschließend läßt man 10 Minuten reagieren. Aus den aus F. g. 4 ersichtlichen Resultaten ergibt sich, daß

«£r ^Zy,^{m nach der Erfindu}ng am besten bei 50 bis 60 C wirkt.

τ- u^i _n r ^{>>O<< zeigt in F}' S- 4 die Verwendung des ι ris-HCL-Puffers an, während sich das Symbol »·« auf den 1-ail der Verwendung von KH₂PO₄-N A₂B₄O₇-Puffer Dezieht. In Fig.4 wird die enzymatische Aktivität des tnzyms nach einer lOminüiigen Reaktion bei 40⁰C unter Verwendung von Tris-HCL-Puffer als 100% ^gesehen w,e aus der Figur ersichtlich ist.

(j) Das Verfahren zur Reinigung und das Verfahren zur Messung der Aktivität sind bereits oben dargelegt

7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

M^*⁸?* ^^{ele Beis}P^iele· in denen DNase mit Ca²+, Mg + oder Mn*+ aktiviert wird (beispielsweise »Biochemica et Biophysica Acta« 114,156,1966, Beitrag von T. ηΛ?^·* o^{S erfindl}'ngsgemäße Enzym zeigt jedoch nicht diese Stabiliserungs- und Aktivierungsaktivitäten.

nTh ^b*^re'V^USgefQhrt' ^wirkt J^{edoch der} KH₂POr Na₂B₄O₇-Puffer beim erfindungsgemäßen Enzym aktivierend und stabilisierend.

.PJ^toj^ngswirkung verschiedener Metallionen SSS* £ ^er?^ndunSsgemäßen Enzymes wurde untersucht D,e emzelnen Ionen, die in Tabelle 4 wurden dem ^ecenwärtitmi Enzym

6s zentration 2 * in 3x7 ü ""^6W6WUt11· ^{UttO U1C} ^ " dann bei 3η· Λ«χ*· ^betrug· ^{Die Mischun}8 ^^ die Reaktiv!«? *" ^stehengelassen. Dann wurde TabeHe 4 geze gt ^gCmessen· ^Die Ergebnisse sind in

Tabelle 4
Metallion

Ca^{2 +}
Mg²⁺
Mn² +
Zn² +
Fe² +
Fe³ +
AP+
Co^{2 +}

Restaktivität

106

100

100

101

8) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms wurde mittels Gelfiltration unter Verwendung eines verzweigten Dextranpolymeren mit einem Molekulargewicht von 3000 bis 70 000 sowie von 4000 bis 150 000 bestimmt. Es ergab sich ein Molekulargewicht von etwa 40 000.

9) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt des Enzyms, bestimmt durch ein elektrofokussierendes Verfahren beträgt nicht mehr als pH 4,0.

10) Elementaranalyse

Die Resultate der Elementaranalyse des erfindungsgemäßen Enzyms sind in Tabelle 5 wiedergegeben.

Tabelle 5	Gewicht (4)
Elemente	48,57 7,10 0,63 15,31 1,84
C H S N Asche

Nachfolgend ist die Herstellung der erfindungsgemäßen DNase anhand von Beispielen gezeigt.

Beispiel 1
Zusammensetzung des Nährmediums:

Lösliche Stärke 20 g
K₂HPO₄ 1 g

Hefeextrakt 5 g

Pepton 5 g

MgSO₄ · 7 H₂O 0,2 g

Die obengenannte Zusammensetzung wurde in 900 ml Wasser aufgelöst Die wäßrige Lösung wurde dann bei 115° C für 15 Minuten sterilisiert Getrennt hiervon wurden 10 g wasserfreies Natriumcarbonats in 100 ml Wasser aufgelöst Die wäßrige Lösung wurde ebenfalls bei 115^eC für 15 Minuten sterilisiert Die beiden wäßrigen Lösungen wurden sterilisiert und gemischt und ergaben eine Nährlösung mit einem pH von 10,5. Die Nährflüssigkeit wurde in eine mit einer Schulter versehene Schüttelflasche (Sakaguchi-Fiasche) eingegossen. Der Bacillus ATCC 31 084, der über Nacht in demselben Nährmedium vorkultiviert worden war, wurde in die Nährlösung in dem Schüttelgefäß inokuliert und durch Schütteln bei 37⁰C 72 Stunden lang gezüchtet, woraufhin die Zellen entfernt wurden. Die erhaltene DNase-Menge betrug 3060 Einheiten pro Milliliter der Kulturlösung.

B e i s ρ i e I 2

520 g lösliche Stärke, 65 g Polypepton, 80 g Hefeextrakt und 3 g K₂HPO₄ wurden in 9 1 Wasser gelöst. Die resultierende wäßrige Lösung wurde dann in ein

ι ο Fermentorgefäß mit 15 1 Inhalt eingegeben. Die wäßrige Lösung wurde bei 115°C 20 Minuten lang sterilisiert. Dann wurde 1 I 10%igen Natriumcarbonates, separat sterilisiert, hinzugefügt, um so eine Haupt-Nährlösung zu schaffen. Eine Platinöse mit dem Bacillus ATCC 31 084 wurde in eine Saat-Nährlösung inokuliert, die dadurch hergestellt worden war, daß 200 ml der Nährlösung, die bei Beispiel 1 verwendet wurde, in cir, dreihalsiges oder dreischultriges geriffeltes Gefäß mit einem Volumen von 21 eingegossen wurden. Dann wurde bei 37¹³C unter Schütteln 20 Stunden gezüchtet. Anschließend wurde die Kulturlösung auf die Haupt-Nährlösung übertragen. Dann wurde 54 Stunden lang bei 35°C mit einer Drehgeschwindigkeit von 800 UpM unter Hindurchleiten von Luft mit einer Rate von 10 l/min gezüchtet. Nach der Züchtung betrug die gemessene Aktivität der DNase 3580 Einheiten/ml. 9 1 dieser Kulturlösung wurden auf 5°C abgekühlt. Dann wurde auf — 20⁰C gehaltenes Methanol zugefügt, so daß die Konzentration des Mathanols 50 Vol.-% betrug. Das erhaltene Präzipitat wurde durch einen kontinuierlichen Zentrifugalseparator entfernt. Darüber hinaus wurde kaltes Methanol dem überstehenden Teil zugefügt, so daß die Konzentration des Methanols auf 80 Vol.-% eingestellt wurde. Dann ließ man die Mischung bei 5°C 3 Stunden lang stehen. Die überstehende Flüssigkeit wurde vorsichtig entfernt, woraufhin die präzipitierten Teile gesammelt und intensiv mit kalten Methanol dehydriert wurden. Anschließend erfolgte eine Vakuumtrocknung, woraus sich 146 g eines Rohenzympulvers mit 166 Einheiten/mg von DNase ergaben.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, abgesehen davon, daß 4s 10 g Glucose anstelle der löslichen Stärke zur Herstellung des Nährmediums verwendet wurden. Der Bacillus ATC-31 084-Stamm wurde in derselben Weise gezüchtet, wobei sich 1120 Einheiten DNase prc Milliliter der Kulturlösung ergaben.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt eine feste Kultur des Bacillus-ATCC-31 084-Stammes. Polypepton (5 g) und 30 m Wasser wurden zu 30 g Weizenkleie hinzugegeben. Die Mischung wurde in einen 500 ml Volumen aufweisender konischen Kolben eingegeben und bei 115° C 2( Minuten lang sterilisiert Der Mischung wurden 03 g Natriumcarbonat, sterilisiert durch Erwärmung, zugege ben. Nach intensiver Durchmischung wurde dei Bacillus-ATCC-Sl 084-Stamm inokuliert Der Nährbo den wurde dann bei 37° C 3 Tage lang stehengelassen Dann wurden 100 ml Wasser zum Extrahieren de! resultierenden Enzymes hinzugegeben. Die DNase Menge betrug 780 Einheiten pro Milliliter des Extraktes

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Desoy.yribonuklease, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem DNS-Moiekül selektiv die Phosphatdiesterbindung zwischen Desoxyguanosin und Desoxyguanosin spaltet, wobei dos Phosphat über die 5'-Position der Desoxyribose mit dem einen Desoxyguanosin verbunden bleibt, und daß sie durch aerobes Züchten des Bacillus ATCC 31 084 in einem alkalischen Nährmedium, welches eine Kohlenstoff-, Sticksotff-, Phosphor- und KaIiumquelle sowie wenigstens ein Metall-Carbonat enthält, sowie durch ihre Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit hergestellt worden ist

2. Verwendung der Desoxyribcnuklease nach Anspruch 1 zur Herstellung von Desoxyribonukleotiden mit endständigem Desoxyguanosin.