DE2416339A1

DE2416339A1 - Argininpyroglutamat und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2416339A1
Application number: DE2416339A
Authority: DE
Inventors: Giovanni Prof Orzalesi; Renato Selleri
Original assignee: Manetti & Roberts Italo Brit
Current assignee: Manetti & Roberts Italo Brit
Priority date: 1973-04-04
Filing date: 1974-04-04
Publication date: 1975-02-13
Also published as: ZA742095B; FR2224154A1; DE2416339B2; FR2224154B1; GB1421089A; JPS5035317A; IT1019020B; ES424931A1; CH592058A5; DE2416339C3; JPS5221572B2; AR203747A1

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. WERNER KINZEBACH

D-βΟΟΟ MÜNCHEN 4O, BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (ΟΘ0) 37 80 83 · TELEX 0218200 I»AR D FOSTANSCHRIFTl D-BOOO MÜNCHEN 43. POSTFACH 7OO

PATENTANMELDUNG

München, den 04. APR.

M/15167

71 801 GO/bo

Societa Italo-Britannica

L. Manetti - H. Roberts & C.,

1 Via Carlo Pisacane, 50134 Pirenze /'ITALIEN

Argininpyroglutamat und Verfahren zu seiner Herstellung

Glutaminsäure, Glutamin und Acetylglutamin werden für therapeutische Zwecke in weitem Umfang verwendet, da einige klinische Untersuchungen, die mit Hilfe geeigneter psychologischer Teste durchgeführt wurden, ihre Wirksamkeit bei der Besserung einiger Formen von Mentalretardation bewiesen haben.

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Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue reine und strukturell wohl definierte chemische Substanz zu schaffen, die zu der Klasse von Verbindungen gehört, die j durch Zusammenfügen von α-Aminosäuren gebildet wird. Es ist j eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu ihrer Synthese zu schaffen. ■ '

Die erfindungsgemäße Verbindung ist chemisch als Arginin-2- ;

pyrrolidon-5-carboxylat (Argininpyroglutamat) definiert und * entspricht der Summenformel C₁₁Hp₁Nj-Oc, der die folgende Struktur entspricht:

T 7~~ COO - N. — C - N - (CH₀)₃ - CH - COOH

I · I» I

H NH H

Ihr Molekulargewicht beträgt 303,31.

Das Ergebnis ihrer Elementaranalyse, ausgedrückt in Prozent, ist wie folgt:

C 43,56 (gefunden 43,71)

H 6,98 (gefunden 7,12)

N 23,09 (gefunden 23,53)

0 26,37 (durch Differenz)

Die Substanz tritt in Form von Kristallen oder farblosen oder weißen kristallinen Massen auf. Sie ist löslich in Wasser, weniger löslich in den niedrigeren aliphatischen Alkoholen, unlöslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln. Sie kristallisiert, wie im folgenden ausgeführt wird, aus wäßrigem

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Äthanol und schmilzt in diesem Fall bei 216 bis 217⁰C (auf der Kofier-Bank).

Die erfindungsgemäße Verbindung wird hergestellt, indem man in einer konzentrierten wäßrigen Lösung in der Hitze L-Arginin und Pyroglutaminsäure, vorzugsweise in äquimolarem Verhältnis reagieren läßt und.die Mischung wird zur Trockene eingeengt, worauf der Rückstand mehrfach mit absolutem Äthanol aufgenommen wird und aus wäßrigem Äthanol umkriotallisiert wird.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel

Man löst 17,4 g (0,1 Mol) L-Arginin in der kleinstmöglichen Menge warmem Wasser und gibt eine wäßrige und konzentrierte wärme Lösung von 12,9 g (0,1 Mol) Pyroglutaminsäure, auch bekannt als 2-Pyrrolidon-5-carbonsäure, zu. Man kocht die Mischung einige Minuten und gibt sie danach in eine Verdampfungsvorrichtung, die unter Vakuum rotiert und engt sie im Wasserbad der Vorrichtung bis zur Trockene ein. Der Rückstand wird dreimal mit absolutem Äthanol aufgenommen und wird auf die bereits genannte Weise jedesmal zur Trockene eingeengt.

Der zum Schluß erhaltene Rückstand wird gesammelt und aus einer Mischung von 95 tigern Äthanol/Wasser im Verhältnis 7:3 kristallisiert, wobei man ungefähr 25 g des Endprodukts erhält, das das oben beschriebene kristalline Aussehen besitzt und einen Schmelzpunkt von 216 bis 217⁰C auf der Kofler-Bunk aufweist.

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71 801 GO/bo ψ

Die therapeutische Wirksamkeit der Verbindung, die im folgenden mit G 278 abgekürzt wird, wurde gemäß dem folgenden Testprogramm untersucht:

a) Kontrolle des Einflusses, der durch G 278 auf die Geschwindigkeit des Labyrinth-Lernens ausgeübt wird;

b) Kontrolle des Einflusses, der durch G 278 auf die spontane Mobilität und auf die durch depressive Mittel bewirkte Verringerung der spontanen Mobilität· ausgeübt wird;

c) antagonistische Wirkung von G 278 bezüglich der durch Arzneimittel bewirkten Depression.

' Experimentelle Ergebnisse

! Einfluß der Behandlung mit G 278 auf das Labyrinth-Lernen.

Zur Durchführung dieser Untersuchung wurde ein 1,20 m langes ; Labyrinth verwendet, in dem 12 Möglichkeiten eines Irrtums ; vorgesehen waren. Die Wirkung von G 278 wurde bestimmt, indem man ihren Einfluß auf die zur Durchquerung des Labyrinths erforderliche Zeit und auf die Anzahl Fehler in Rechnung stellte, die während des Durchgangs zu der Kammer erfolgten, in die das Futter gegeben worden war.

Versuchsbedingungen:

Der Versuch wurde mit einer Gruppe von 18 erwachsenen männlichen Wistar-Ratten durchgeführt, die in zwei Gruppen zu je 8 Tieren aufgeteilt wurden. Vor Beginn des Tests ließ man die Tiere 72 Std. hungern. Eine Stunde, bevor die Tiere in das Labyrinth geschickt wurden, wurde der einen Gruppe A ml/kg einer Lösung von 10 % Gummi arabicum injiziert. Der anderen Gruppe wurden 100 mg/kg G 278 injiziert, wobei dasselbe TrU-

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71 801 GO/bo . <*·

gervolumen verwendet wurde. Anschließend führte man die erste Bestimmung durch. Nachdem die Tiere den Durchgang beendet hatten, erhielten sie 5 g ausgewogene Nahrung, die ihnen 30 Min. zur Verfügung stand. Danach ließ man sie wieder hungern. Unter Konstanthaltung dieser Testbed-ingung wurde der Test Sechsmal wiederholt, und zwar mit 24-stündigen Unterbrechungen.

Die Testergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Es ist zu bemerken, daß die von den Kontrolltieren benötigten Zeiten und begangenen Irrtümer merklich höher als die sind, die bei den mit G 278 behandelten Tieren gemessen wurden, und obgleich die Unterschiede im allgemeinen nicht in der Nähe der statistischen Signifikanz liegen, muß dies der beträchtlichen individuellen Schwankung beim Ansprechen zugeschrieben werden.

J Einfluß der Behandlung mit G 278 auf die spontane oder durch Behandlung mit Nembutal ® reduzierte Mobilität.

ι Zur Ausführung dieser Tests wurde die Ausrüstung Modell "Animex, S-Typ" der Firma "Paroid" verwendet, die mit einem mechanischen Bewegungszähler versehen war, der eine Zählgeschwindigkeit bis zu 10 Impulsen/Sek. besaß. Die Vorrichtung wurde in eine Ruhekammer (silent chamber) gestellt und die Zählung wurde nach einer 10-minütigen Anpassungsperiode konstant durchgeführt. Der Test wurde mit einer Gruppe von 50 erwachsenen männlichen Wistar-Ratten durchgeführt, die in Gruppen zu je 10 Tieren aufgeteilt wurden und die Testbedingungen wurden wie folgt gewählt:

Gruppe I = Kontrolltiere; 4 ml/kg einer 10 Äigen Gummi arabi· cum-Lösung wurde den Tieren endoperitoneal verabreicht. Nach 1 Std. wurde die spontane Mobilität 15 Min. lang gemessen;

- 5 -509807/117 3"

71 801 GO/bo .£.

Gruppe II = wie in Gruppe I, jedoch wurden zusammen mit dem Träger 100 mg/kg G 278 verabreicht;

Gruppe III = wie Gruppe I, jedoch wurden zusammen mit dem

Träger 10 mg/kg Nembutal verabreicht. Gemäß

· - den Ergebnissen früherer Untersuchungen ver-

! ringert die Dosis des verwendeten Barbiturats

j merklich die spontane Mobilität der Tiere;

Gruppen IV und V = wie bei den vorhergehenden Gruppen, jedoch wurde zusammen mit 10 mg/kg Nembutal an Gruppe IV 50 mg und an Gruppe V 100 mg/ kg G 278 verabreicht.

Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle II gezeigt. Die folgenden Ergebnisse sind bemerkenswert:

Bei einer Dosis von 100 mg/kg bewirkt G 278 keine Änderungen der spontanen Mobilität der Tiere; bei einer Dosis von 10 mg/kg verringert Nembutal merklich die spontane Mobilität; G 278 wirkt dem Barbiturat eindeutig entgegen und die antagonistische Wirkung steigt mit der Zunahme der Dosis an Argininpyroglutamat.

Wirkung von G 278 auf die durch Arzneimittel induzierte Depression.

Das Verhalten von G 278 bezüglich der Verminderung der negativen Wirkung, die durch Nembutal auf die spontane Mobilität ausgeübt wird, hat uns veranlaßt,festzustellen, ob dieselbe

j Verbindung die durch Pharmazeutika hervorgerufenen depressiven

j Phänomene erfolgreich verhindern kann.

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71 801 GO/bo ·Υ-

Um die antagonistische Wirkung zu messen, wurden die Zeitintervalle zwischen der Injektion des Depressivums und dem Verschwinden des Stellreflexes (Induktionszeit) bestimmt und die Dauer der Anästhesie wurde festgelegt, indem man das Zeitintervall zwischen dem Verlust und dem Auftreten der atellreflexe maß.

Die Tests wurden mit 2k erwachsenen männlichen Wistar-Ratten durchgeführt, die in vier Gruppen zu je sechs Tieren aufgeteilt wurden. Die Testbedingungen waren wie folgt:

Gruppe I = 25 mg/kg Nembutal wurden endoperitoneal verabreicht;

Gruppe II = 100 mg/kg G 278 und 10 Min. später 25 mg/kg Nembutal wurden endoperitoneal verabreicht;

Gruppe III = 5 mg/kg Medazepam ^ und 30 Min. später 25 mg/kg Nembutal wurden per os verabreicht;

Gruppe IV = 5 mg/kg Medazepam per os und 10 Min. später 100 mg/kg G 278 und 20 Min. später 25 mg/kg Nembutal wurden oral verabreicht.

Die Arzneimittel wurden verabreicht, indem man geeignete Volumina einer 10 iigen Gummi arabicum-Lösung als Träger verwendete. Die Testergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Die folgenden Ergebnisse sind bemerkenswert:

In dem Fall, in dem die Tests unter Verwendung von Nembutal alleine durchgeführt wurden, wurden alle Tiere anästhesiert; Die Anästhesie dauerte im Mittel 17,6 Min., während die mittlere Induktionszeit 8,3 Min. betrug;

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71 801 GO/bo ·Jl·

G 278 wirkte dem anästhetischen Effekt von Nembutal eindeutig entgegen: Bei der Gruppe, die mit Argininpyroglutamat vorbehandelt war, wurden nur zwei von sechs Tieren in eine allgemeine Anästhesie gebracht, die im Mittel erheblich kürzer war, während die Induktionszeit verlängert war; bed zwei weiteren Tieren trat Somnolenz, gefolgt von Schlaf auf, während bei j den zwei anderen Tieren nur eine Sedierung bemerkt wurde.

Die Vorbehandlung mit Medazepam verkürzt die Induktionsperiode und protrahiert die Anästhesie-Periode, die durch Nembutal

! hervorgerufen ist.

Trotz der Zunahme des depressiven Zustande, der durch das Zu- ; sammengeben von Medazepam mit Nembutal erhalten wird, bewirkt G 278 dennoch erfolgreich einen eindeutigen antagonistischen Effekt, der durch eine Verminderung der Zahl der Tiere, die anästhesiert werden, und durch eine beträchtliehe Verkürzung der Dauer der Anästhesie gekennzeichnet ι ist.

Insgesamt gelangt man zu folgenden Schlußfolgerungen:

Die obigen Tests zeigen, daß Argininpyroglutamat pharmakodynamische Eigenschaften besitzt, die es zur Verbesserung des Funktionszustands des Zentralnervensystems geeignet macht.

Bei der Verabreichung an Ratten verbessert diese neue Verbindung ihre Lernkapazität, wenn sie sich in normalem Zustand befinden und wirkt eindeutig den durch zentrale Depressiva ausgeübten Wirkungen entgegen.

Da darüberhinaus Argininpyroglutamat bei den Dosen, die die oben zusammengestellten Wirkungen hervorrufen, keine Zunahme

- 8 509807/1173

"2ΛΤΟ39

71 801 GO/bo _Ä

der spontanen Mobilität bewirkt, ist es berechtigt anzunehmen, daß die vorteilhaften Wirkungen auf die cerebrale Aktivität nicht einem Zustand unspezifischer Excititation zugeschrieben werden können.

Für pharmazeutische Zwecke sind auch die Salze der erfindungsgemäßen Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Säuren und Basen geeignet.

ι - 9 -

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TABELLE I

Körperge	G 278	Mittel	P	Läufe in	II	Sekunden	IV	V	VI	VII	I	Irrtümer bei	II	den	Tests	VI	VII
wicht , g	mg/kg		I	148	III	133	1/3	123	112	20	II I	10	IV	V	IO	9
204	-	100	24 y	60	115	37	78	60	39	11	19	6	16	11	3	2 ■
207			97	171	56	76	55	72	47	20	18	7	4	9	3	1
210			>250	131	122	88	83	65	50	17	15	10	11	4	π	10
213			242	112	109	63	50	25	41	14	15	5	18	15	8	4
219			172·	141	73	58	56	49	56	15	15	9	13	9	3	2
221			137	156	96	96	98	101	114	15	17	8	11	8	4	3
227			204	197	116	102	77	64	57	20	14	10	7	9	6	4
236			>250	139	131	82	83	69	64	Ib	18	8.1	8	4	6.0	4.3
217	Mittel	>200	+ 41 ■	102	+ 30	+ 40	+ 30	+31		16.3	+ 2.0	11 .0	8.6	+ 2.9	+3.4
+ 11			20	+ 25	66	36	60	53	y	+ 1 .8	14	+ 4.7	+ 3.7	9	6
201	246	17	131	19	14	23	24	7	7	η	9	5	4	3
211	130	32	109	10	8	4	11	3	4	6	4	4	6	4
216	12	22	13	22	21'	15	8	12	7	S	6	5	5	5
219	23	106	15	29	31	20	9	U	10	13	11	8	2	2
224	66	73	78	42	27	16	O	4	10	6	5	5	4	2
229	119	27	101	18	22	11	13	11	4	4	4	5	3	3
232	96	49	41	19	25	14	9	9	9	7	5	4	5	2
235	58	43	72	28	23	20	16	ö	8	8.7	8	4	4.7	3.3
220	93	+ 31	70	+ 18	+ 9	+ 17	+ 16	+3	.2 7.3	+3.6	6.5	4.8	+ 2.1	+ 1.5
+ 12	+ 74	>Ö.l η	+ 41	>Ö.l	>0Tl	nTs.	nTs.		.2 +2.4	ή. s.	+ 2.7	+ 1 .3	η. s.	η .s .
		Ts.					<Ö. 01	η .s .	η. s .

Einfluß der Behandlung mit G 278 auf die Geschwindigkeit des Labyrinth-Lernens.

P = berechnet auf der Grundlage der Kontrollwerte und nur für Werte angegeben,

die statistische Signifikanz oder annähernd statistische Signifikanz besitzen

CD· CJ CO

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TABELLE II

Körperge,- .	.Arznei	-	G 278	mg/kg	Anzahl Bewecuncen'
v/i ent, c	mittel				in 30 Minuten
25 1	-			-	761
256					542
264					427
275					631
2 77				566
281				647
284			521
286 -			586
291			702
2 94			436 ' ■
276		Mittel	532
+ 15	Nembutal		+ 109'
24 8		100	5 96
261			658
263			802
263			536
275			482
279			621
236			574
237			698
2i/J			502
2 96			581
α 7 b		Mittel	605 ( + 3.9)
+ 15			+ 94
	Nembuta'l	P	η. s.
257	G 278	10	231
263		♦	198
264			89
270			241
275			156
279			•173
282 ' .. .			202
28 9			209
291			125
304 ;			184
277		Mittel	Ϊ8Ί ( -69.0)
+ 15			+47
	P	oToi
263	10	•521
269	50 ■	371
2 70		421
276		365
277		281
281		527
284		324
285		261
289		456
2 94		321
279	Mittel	381 ( -34.6)
+ 10		+ 92
	P	η. s .

-JLl-

509807/1 f7 3'

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T4TB339

TABELLE II (Portsetzung):

Körperge	Arznei	mg/kg	Anzahl Bewegungen
wicht, g	mittel		in 30 Minuten
243	Nembutal	10	431
256	G 278	100	624
264			327
269			516
271			408
276			604
277			325
281			409
288			531
295			376
272		Mittel	455 ( -11.9)
+ 15			+ 109
		P	"n. s.

Einfluß von G 278 und Nembutal, alleine oder assoziiert, auf die spontane Mobilität von Ratten.

P = berechnet auf der Grundlage der Kontrollwerte und nur für Werte angegeben, die statistische Signifikanz oder annähernd statistische Signifikanz besitzen.

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TABELLE III

Körper gewicht g	Arzneimittel *	mg/kg	Induktions zeit in Minuten	Anästhesie zeit in Minu ten
256 260 " · 263 267 271	Nembutal (i.p.)	25	8 9 7 7 10 9	12 • 32 10 17 14 21
260 .+8		Mitte]	8.3	17.6 +7.9
251 254 263 267 273 '275	G 278 (i.p.) nach · 10 Min. Nembutal (i.p.)	100 25	5 17 5 0 19 ■ o	I 15 I 0 13 0
263 + 10		Mittel	(X) 18.0	(χ) I 4.0
239 . 246 251 258 274 281	Medazepam os nach 30 Min. Nembutal (i. p.)	LO LO * • CVJ	4 · 6 . 7 5 6 3	76 28 74 39 58 31
258 + 16		Mittel	5.1	51 .0 + 20.6
247 251 258 262 279	Medazepam os ■nach 10 Min. G 278 (i.p.) nach 20 Min. Nembutal	5 100 25	8 7 9 S S 8	2 16 28 I I 10
		mittel	(x)8.0	(χ) 1 4. 0

Einfluß der Behandlung mit Q 278 auf die Depression durch Nembutal oder Medazepam-Nembutal.

S = Torpor oder reduzierte Reaktivität auf Stimuli.

I = Schlaf, aus dem das Tier durch starke Stimuli aufgeweckt wurde.

Die Zeiten von I und S wurden aufgrund der Schwierigkeit, ihre Dauer zu messen, nicht bestimmt.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE :

1. Argininpyroglutamat der Summenformel ^^-Ηρ-Ν,-Ο,- und der Struktur

COO - N —-C-N- (CH ) - CH - COOH

T Il I ^ ' I

H "NH H NH

Verfahren zur Herstellung von Argininpyroglutamat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in konzentrierter wäßriger Lösung L-Arginin und Pyroglutaminsäure in
der Hitze umsetzt, anschließend die Lösung zur Trockene konzentriert, den Rückstand wiederholt mit absolutem
Äthanol aufnimmt und aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Arginin und Pyroglutaminsäure in äquimolarem Ver- ! hältnis umsetzt.

Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Arginin und Pyroglutaminsäure bei der Siedetemperatur der Mischung umsetzt.

- Ik -

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5. Arzneimittel enthaltend Argininpyroglutamat und übliche pharmazeutisch verträgliche Träger und Forraulierungsmittel,

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