DE2410850B2 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents
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Description
Peptids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die
peptidbildeade Reaktion und/oder die Extraktion des Peptids unter Einwirkung von Ultraschallwellen mit
ao einer Frequenz von etwa 18 bis 22 kc/s durchgeführt Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wird.
Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kupp- Es ist nun gefunden worden, daß die Reaktion
lung einer Aminosäure oder eines Oligomeren von einheitlich und mit außerordentlich erhöhter Gedieser
mit einer Aminosäure oder Oligomeren von schwindigkeit erfolgt, wenn bei den herkömmlichen
dieser, welches an ein Harz gebunden ist, wobei ein 35 Verfahren in fester Phase für die synthetische Herstel-Peptid
auf dem Harz gebildet wird, Abspalten des lung von Peptid aus Aminosäure oder dessen Oligo-Peptids
von dem Harz und anschließende Extraktion meren die Kondensationsreaktion zur Bildung der
des Peptids. Peptid-Bindung bei Bestrahlung mit Ultraschallwellen
Ein Verfahren in fester Phase ist bereits bekannt durchgeführt wird, wobei ein homogenes Peptid bei
und umfaßt die folgenden Stufen: Kupplung einer 30 verkürzter Dauer der Reaktionszeit erhalten werden
Aminosäure oder eines Oligomeren von dieser mit kann. Außerdem wurde gefunden, daß bei der Lösungseiner Aminosäure oder Oligomeren von dieser, mittelextraktion des erhaltenen Peptids durch Ultraweiches an ein Harz gebunden ist, wobei ein Peptid schallbestrahlung die Extraktionszeit ebenfalls verauf
dem Harz gebildet wird, Abspalten des Peptids ringen werden kann.
von dem Harz und anschließende Extraktion des 35 Es wurde weiterhin gefunden, daß die übliche Vor-Peptids.
behandlung und Nachbehandlung der peptidbildenden
Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß das Umsetzung, welche die Stufen Quellen, Waschen,
synthetisch hergestellte Peptid auf dem Harz aus nicht- Entblockieren und Neutralisieren umfassen, innerhalb
umgesetzten überschüssigen Reaktionspartnern und einer bemerkenswert kürzeren Zeit abgeschlossen
Nebenprodukten sehr leicht durch Auswaschen ge- 40 werden können, wenn die Durchführung unter Ultratrennt
werden kann, es hat jedoch den großen Nach- schallbestrahlung erfolgt.
teil, daß die Reaktionsgeschwindigkeit niedrig ist und Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten
daß es schwierig ist, die Reaktion einheitlich durch- Aminosäuren umfassen eine große Vielfalt der übzuführen.
Insbesondere der letztgenannte Nachteil liehen Aminosäuren mit Aminogtuppen und Carboxylstellt
ein ernstes Problem bei der Synthese von Pep- *s gruppen im Molekül derselben. Beispiele von diesen
tiden aus Aminosäuren und deren Oligomeren dar. sind Glyzin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenyl-Bei
den Verfahren in fester Phase ist es leicht möglich, alantin, Tyrosin, Methionin, Asparagin, Asparagindaß
die Umsetzung der Aminosäuren oder deren säure, Glutamin, Glutaminsäure, Cystein. Arginin,
Oligomeren mit den an das Harz gebundenen Amino- Serin, Threonin, Histidin und ähnliche Monoaminosäuren
oder tieren Oligomeren nicht einheitlich ist, 50 karbonsäuren, Hydroxylaminosäuren, Schwefel entso
daß es schwierig ist, homogene Produkte zu haltende Aminosäuren usw.
erhalten. Beispiele von Oligomeren der Aminosäure sind
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaf- Oligopeptide, d. h. die Kondensationsprodukte von
fung eines Verfahrens, bei dem die obenerwähnten 2 bis 10 Mol der gleichen oder verschiedenen Amino-Nachteile
der herkömmlichen Verfahren in fester 55 säuren, einschließlich z. B. Dipeptide, Tripeptide,
Phase zur Herstellung von Peptiden von Amino- Tetrapeptide usw.
•fiuren oder deren Oligomeren eliminiert wurden. Diese Aminosäuren oder deren Oligomeren werden
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung als ein verwendetes Ausgangsmaterial in einer an ein
ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur Harz gebundenen Form verwendet, während als zwei-Herstellung
von homogenen Peptiden von Amino- 60 tes Ausgangsmaterial diese als solche verwendet wer-•äuren
oder deren Oligomeren durch einheitliche den, d. h. in nicht an ein Harz gebundener Form.
Umsetzung und stark beschleunigter Reaktions- Die Arten der zu verwendenden Harze und der Ver-
§eschwindi,gkeit. fahren zur Bindung der Aminosäuren oder der Oligo-
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung meren derselben an das Harz werden nachfolgend
ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur 65 beschrieben.
Herstellung von Peptiden von Aminosäuren oder Die gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwen-
deren Oligomeren. bei dem die Extraktion der erhal- denden Verfahren in fester Phase an sich kann in
•enen Perrtide in sehr kurzer Zeit durchgeführt wird. herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Die
3 4
typischen Verfahren dkser Art, die Vor- und Nach- Peptid erhalten. Üblicherweise wird der Zyklus dieses
behandlungsstufcn umfassen, sind z. 3.: Verfahrens mehrere Male wiederholt, um die Bildung
Die Endaminogruppen der Aimnosäuren oder der des gewünschten Peptids auf dem Harz durchzuführen.
Oligomeren derselben werden zuerst mit Schutz- Nach dem Waschen wird das an das Harz gebundene
gruppen »blockiert«^ und dann werden die N-blockier- 5 Peptid von dem Harz abgespalten, indem das erhaltene
len Aminosäuren oder Ohgomeren derselben an Harze Harz mit einem abspaltenden Mittel, wie z. B. wassergebunden,
die sich in festem Zustand unter den für freier Fluorwasserstoff oder mit Bromwasserstoff ge-4<
e peptfibildende Reaktion anzuwendenden Bedin- sättigte Trifluoressigsäure, in Kontakt gebracht wird,
gungen befinden. Das Blockieren kann durch Um- Die Behandlung wird üblicherweise bei einer Tempejetzung
von Aminosäuren oder deren Oligomeren mit io ratur von etwa 0 bis 25 "C durchgeführt. Nachdem
Alkyloxykarbaziden, wie z. B. tert.-Butyloxykarbazid, das abspaltende Mittel unter reduziertem Druck ab-2-(p-Bipheny])-isopropyloxykarbaz1d
und andere ahn- destilliert wurde, wird das auf diese Weise von dem
Kche, in Anwesenheit eines Alkalis bei Zimmer- Harz abgespaltene Peptid mit einem organischen
temperatur erfolgen. Unter diesen wird tert-Butyl- Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure, extrahiert, und
oxykarbazid, das eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe 15 das Harz wird von dem Extrakt abfilrriert. Wenn
(im folgenden als »BOC« bezeichnet) bildet, als Schutz- notwendig, wird der Extrakt durch eine Kolonne eines
gruppe am meisten bevorzugt Ionenaustauscherharze« geleitet, das z. B. »Amberiite
Das Verfahren zum Verbinden der Aminosäure IR-45« sein kann, wobei das Peptid durch den lonen-
oder des Oligomeren derselben mit dem Harz ist nicht austauscher absorbiert und eluiert wird. Anschließend
kritisch, nach einem bevorzugten Verfahren wird ao wird das Peptid gesammelt und lyophiliert, um reines
jedoch das Harz zuerst chlormethyliert oder hydroxyl- Peptid zu erhalten.
methyliert, und dann wird das auf diese Weise modi- Erfindungsgemäß ist es wesentlich, die peptidbildenfizierte
Harz mit N-blockierter Aminosäure oder deren de Kondensationsumsetzung mit herkömmlichen Ver-Oligomerem
in einer organischen Lösung umgesetzt. fahren in fester Phase unter der Bestrahlung von
Für diesen Zweck sind verschiedene Harze, die unter 35 Ultraschallwellen durchzuführen,
den für die Peptidbildung anzuwendenden Reaktions- Durch die Bestrahlung mit Ultraschallwellen ist es bedingungen fest sind, geeignet; sehr bevorzugt zu möglich, die Umsetzungsgeschwindigkeit der Kondenverwenden ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpoly- sationsreaktion zu erhöhen und die Reaktion einheitmerisat. lieh durchzuführen. Tatsächlich kann erfindungsgemäß
den für die Peptidbildung anzuwendenden Reaktions- Durch die Bestrahlung mit Ultraschallwellen ist es bedingungen fest sind, geeignet; sehr bevorzugt zu möglich, die Umsetzungsgeschwindigkeit der Kondenverwenden ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpoly- sationsreaktion zu erhöhen und die Reaktion einheitmerisat. lieh durchzuführen. Tatsächlich kann erfindungsgemäß
Das mit einer Aminosäure oder deren Oligomerem 30 die Kondensationsumsetzung innerhalb einer kurzen
gebundene Harz wird anschließend einer Quell- und Zeit von 5 bis 10 Minuten üblicherweise abgeschlossen
Waschstufe unterzogen und dann einer Stufe zum werden, während bei der herkömmlichen Kondensa-
Entblockieren der N-ständigen Blockgruppe. Die tionsumsetzung, bei welcher keine Bestrahlung durch
Quellstufe wird deshalb bevorzugt (obwohl sie nicht Ultraschallwellen erfolgt, etwa 2 bis 4 Stunden erfor-
immer notwendig ist), um die anschließende peptid- 35 derlich sind.
bildende Umsetzung zu erleichtern. In dieser Stufe Durch einen Zyklus dieses Verfahrens kann ein Mol
wird das Harz mit einer organischen Flüssigkeit, die der Aminosäure oder des Oligomeren von dieser
zum Quellen des Harzes geeignet ist, in Kontakt ge- einheitlich an jede der zuerst an das Harz gebundenen
bracht. Eine derartige organische Flüssigkeit ist z. B. Aminosäure oder Oligomeren derselben gekuppelt
Methylenoxyd, Dioxan, Dimethylformamid usw. Die 40 werden.
anschließende Waschstufe wird durchgeführt, um das Die für diesen Zweck anzuwendenden Ultraschall-Quellmittel
zu entfernen, wozu ein geeignetes organi- wellen sind solche von etwa 18 kc/s bis vorzugsweise
sches Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure, verwendet etwa 20 kc/s.
wird. Die Entblockierungsstufe wird durchgeführt, Die zur Erzeugung der Ultraschallwellen verwendindem
ein bekanntes chemisches Mittel, wie z. B. eine 45 baren Apparate können verschiedener Art sein. Zur
Mischung aus Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure Anwendung der Ultraschallwellen wird vorzugsweise
oder eine Mischung aus Trifluoressigsäure und Me- ein Ende des Ultraschallvibrators in das Reaktionsthylenchlorid,
verwendet wird. Das bevorzugte Mi- system gebracht und die Ultraschallwellen erzeugt,
schungsverhältnis in diesen Mischungen ist 1:1 Ge- Das vorzugsweise zu verwendende Reaktionsgefäß ist
wichtsprozent. Die Entblockierungsstufe wird in 50 ein solches, das einen Mantel für fließendes Wasser
üblicher Weise durchgeführt, z. B. indem das Harz mit einer konstanten Temperatur aufweist,
mit dem Reaktionsmittel bei Zimmertemperatur in Erfindungsgemäß können Ultraschallwellen nicht Kontakt gebracht wird. Das von der Schutzgruppe nur bei der Kondensationsumsetzungsstufe, sondern befreite Harz wird gewaschen, um überschüssiges auch bei der Extraktionsstufe, bei welcher das gebildete Entblockierungsmittel zu entfernen. Danach wird das 55 Peptid in die Extraktionslösungsschicht, nach AbHarz mit einer geeigneten Base, wie z. B. tertiäres spaltung des Peptids von dem Harz, übergeführt wird, Alkylamin, neutralisiert und wieder zur Entfernung angewendet werden, wobei die Extraktionszeit bedieser Base gewaschen. Danach wird die an das Harz merkenswert reduziert wird, während die Menge des gebundene erhaltene Aminosäure oder deren Oligo- Extraktes in großem Maße erhöht wird. Tatsächlich meres einer Kondensationsreaktion mit Aminosäure 60 wird durch die Anwendung von Ultraschallwellen die oder deren Oligomerem unterzogen, wobei die Amino- Extraktionszeit auf etv.a 3 bis 5 Minuten reduziert, gruppe in derselben Weise wie zuvor blockiert wird, während ohne die Anwendung derselben die Extrakum das Peptid auf dem Harz zu bilden. Die Konden- tionszeit etwa 0,5 bis 1 Stunde dauert. Überdies kann sationsumsetzung wird bei Zimmertemperatur unter nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens Verwendung eines Kondensationsmittels, wie z. B. 65 eine der Vorbehandlungs- und Nachbehandlungs-Dicyclohexylcarbodiimid, usw. durchgeführt. Durch stufen für die peptidbildende Umsetzung, wie z. B. Waschen des erhaltenen Produkts aus der Konden- Quellstufe, Waschstufen, Entblockierungsstufe und sationsumsetzung wird das an das Harz gebundene Neutralisierungsstufe. unter Bestrahlung mit Ultra-
mit dem Reaktionsmittel bei Zimmertemperatur in Erfindungsgemäß können Ultraschallwellen nicht Kontakt gebracht wird. Das von der Schutzgruppe nur bei der Kondensationsumsetzungsstufe, sondern befreite Harz wird gewaschen, um überschüssiges auch bei der Extraktionsstufe, bei welcher das gebildete Entblockierungsmittel zu entfernen. Danach wird das 55 Peptid in die Extraktionslösungsschicht, nach AbHarz mit einer geeigneten Base, wie z. B. tertiäres spaltung des Peptids von dem Harz, übergeführt wird, Alkylamin, neutralisiert und wieder zur Entfernung angewendet werden, wobei die Extraktionszeit bedieser Base gewaschen. Danach wird die an das Harz merkenswert reduziert wird, während die Menge des gebundene erhaltene Aminosäure oder deren Oligo- Extraktes in großem Maße erhöht wird. Tatsächlich meres einer Kondensationsreaktion mit Aminosäure 60 wird durch die Anwendung von Ultraschallwellen die oder deren Oligomerem unterzogen, wobei die Amino- Extraktionszeit auf etv.a 3 bis 5 Minuten reduziert, gruppe in derselben Weise wie zuvor blockiert wird, während ohne die Anwendung derselben die Extrakum das Peptid auf dem Harz zu bilden. Die Konden- tionszeit etwa 0,5 bis 1 Stunde dauert. Überdies kann sationsumsetzung wird bei Zimmertemperatur unter nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens Verwendung eines Kondensationsmittels, wie z. B. 65 eine der Vorbehandlungs- und Nachbehandlungs-Dicyclohexylcarbodiimid, usw. durchgeführt. Durch stufen für die peptidbildende Umsetzung, wie z. B. Waschen des erhaltenen Produkts aus der Konden- Quellstufe, Waschstufen, Entblockierungsstufe und sationsumsetzung wird das an das Harz gebundene Neutralisierungsstufe. unter Bestrahlung mit Ultra-
schallwellen durchgeführt werden. Die Bestrahlung mit Ultraschallwellen dient zur schnellen Erzielung
der gewünschten Ergebnisse. Wenn z. B. bei der Quellstufe Ultraschallwellen angewendet werden, wird ein
wirksamer Quellvorgang innerhalb einer kurzen Zeit erreicht. Außerdem wird durch Bestrahlung mit Ultraschallwellen
die Waschstufe und Entblockierungsstufe innerhalb einer kürzeren Zeit abgeschlossen.
Deshalb erfolgt vorzugsweise die Durchführung der erwähnten Vorbehandlungs- und Nachbehandlungsstufen unter Einwirkung von Ultraschallwellen in dem
Reaktionsgefäß für die peptidbildende Umsetzung, in welchem die Ultraschallbehandlung durchgeführt werden
kann. In diesen Fällen sind Ultraschallwellen verschiedener Frequenzen ebenso anwendbar, aber
solche mit einer Frequenz von 18 bis 22 kc/s sind — ebenso wie für die peptidbildende Umsetzung —
vorzuziehen.
110 g ω-Nitro-L-Arginin wurden in 500 ml einer ln-NaOH-Lösung gelöst, und zu dieser Lösung wurde
eine Mischung von 85,9 g tert.-Butyloxykarbazid und 500 ml Dioxan gegeben. Zu der erhaltenen Mischung
wurden 85 ml Triäthylamin gegeben und das ganze für 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Nach dem Abdestillieren von niedrigsiedenden Substanzen aus der erhaltenen Reaktionsmischung unter
reduziertem Druck wurde der Rückstand über Kaliumsulfat getrocknet und 140 g t.-BOC-co-Nitro-L-Arginin
erzeugt. Es wurden 10 g des chlormethylierten Mischpolymerisats aus Styrol und Divinylbenzol
(Mischpolymerisationsverhältnis 98: 2 Gewichtsprozent), in welchem 0,84 Milliäquivalente des
Chlors pro Gramm des Mischpolymerisats enthalten sind, in einer Mischung aus 100 ml Äthylalkohol
und 50 ml Chloroform suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10,4 g t.-BOC-o-Nitro-L-Arginin und
4,7 ml Triäthylamin gegeben und die Mischung unter Rückflußbedingungen 48 Stunden lang erhitzt, um
das t.-BOC-cü-Nitro-L-Arginin an das Mischpolymerisat
zu binden. Das erhaltene Harz wurde dann mit Essigsäure gewaschen und getrocknet, worauf 10,6 g
des t.-BOC-w-Nitro-L-Arginylharzes erhalten wurden,
in welchem 0,21 Millimol Arginin pro Gramm des Harzes enthalten waren.
1,00 g des auf diese Weise erhaltenen, gut getrockneten t.-BOC-co-Nitro-L-Arginylharzes wurde in ein
Reaktionsgefäß gegeben und 10 ml Methylenchlorid zugeführt, um das Harz voll aufzuquellen. Das Methylenchlorid
wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert, und spezielle Mengen von Reagenzpartnern wurden
in das das Harz enthaltende Reaktionsgefäß in der Reihenfolge, wie sie in Tabelle 1 angegeben ist,
gegeben, wobei nach jeder der angegebenen Stufen eine Ultraschallwellenbestrahlung mit einer Frequenz
von 20 kc/s für eine bestimmte Zeit erfolgte. Die erhaltene Flüssigkeit wurde mit einer Saugpumpe
abfiltriert. Durch einen Zyklus der Stufen, wie er in
Tabelle 1 angegeben ist, wurde das Peptid erhalten,
ao wobei 1 Mol der verwendeten Aminosäure mit 1 Mol der an das Harz gebundenen Aminosäure kondensiert
wurde. Es wurden verschiedene t.-BOC-Aminosäuren
für die peptidbildende Reaktion in der folgenden Reihenfolge verwendet: t.-BOC-L-Phenylalanin,
t.-BOC-L-Prolin, t.-BOC-O-Benzyl-L-Serin, t.-BOC-L-Phenylalanin,
t.-BOC-Glyzin, t.-BOC-L-Prolin und t.-BOC-co-Nitro-L-Arginin. Bei jedem Zyklus wurden
in der peptidbildenden Reaktion nach der Zugabe der t.-BOC-Aminosäure Ultraschallwellen für die Dauer
von 0,5 Minuten einwirken gelassen, und dann wurde Dicyclohexylkarbodiimid als das Kondensationsmittel
dem System zugeführt, worauf eine 2,5 Minuten dauernde Einwirkung mit Ultraschallwellen erfolgte. Jede
der t.-BOC-Aminosäuren wurde in der Form einer in Methylenchlorid gelösten Lösung verwendet, und das
verwendete Dicyclohexylcarbodiimid wurde ebenfalls in der Form der Methylenchlorid-Lösung zugegeben.
Es wurden 1,15 g t.-BOC-co-Nitro-L-Arginyl-L-Prolyl-L
- Prolyl - Glycyl - L - Phenylalanyl - O - Benzyl -L-Seryl-L-Prolyl-L-Phenylalanyl-co-Nitro-L-Arginyl-Harz
gewonnen.
Stufe | Reagenz | Menge an | Einwirkung | Anzahl der |
Reagenz | von Ultra | Behand | ||
schallwellen | lungen | |||
in Min. |
Waschen | Essigsäure | 10 ml | 1 | 1 |
Entblockieren | Chlorwasserstoff | 10 ml | 3 | 2 |
Waschen | Dimethylformamid | 10 ml | 1 | 1 |
Waschen | Methylenchlorid | 10 ml | 1 | 2 |
Neutralisieren | lOgewichtsprozentige Lösung | |||
von Triäthylamin in | ||||
Methylenchlorid | 10 ml | 1 | 2 | |
Waschen | Methylenchlorid | 10 ml | 1 | 3 |
Peptidbildende | f L-BOC-Aminosäure | 5 ml \ 0,15 g J |
||
Reaktion | \ Dicyclohexylcarbodiimid | 10 ml | 3 | 2 |
Waschen | Methylenchlorid | 10 ml | 1 | 1 |
Waschen | Methylalkohol | 10 ml | 1 | 1 |
Waschen | Methylenchlorid | 1 | 1 |
919,4 g des auf diese Weise erhaltenen Peptidharzes 65 wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wurde,
wurde getrocknet und danach in 15 ml wasserfreiem Daraufhin wurde unter reduziertem Druck der Fluor-Fluorwasserstoff
bei 00C für die Dauer von 60 Mi- wasserstoff, und die flüchtigen Substanzen entfernt,
nuten in Anwesenheit von 1,5 ml Anisol behandelt, Der Rückstand wurde in 20 ml ln-Essigsäure suspen-
diert und mit Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 20 kc/s für die Dauer von 3 Minuten zur Extraktion
behandelt. Die das freie Peptid enthaltende Flüssigkeitsphase wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert,
und das Filtrat wurde durch eine Säule von »Amberlite 1R-45« geleitet. Die Säule wurde mit
ln-Essigsäure gewaschen. Das das Peptid enthaltende Eluat wurde aufgefangen und lyophiliert. Das erhaltene
Pulver wurde über Phosphorpentoxyd in einem Exsikkator getrocknet und 177 mg des gewünschten
Produktes, i.e. Bradykinin, erhalten. Die Ausbeute betrug 83,5%. Das Produkt hatte das gleiche Verhalten
wie eine authentische Probe bei der Papierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei
4,8 pH und eine optische Drehung (D-Linie, 19 C) von -77,4° (C 1,28, ln-Essigsäure). Die optische
Drehung von reinem Bradykinin betrug -/6,5 (C 1,27, ln-Essigsäure). (Literaturhinweis: J. Amer.
Chem. Soc, Bd. 86, S. 304, 1964.) Die Armnosaureanalyse
des Produktes (in ön-Chlorwasserstoffsaure
bei 1050C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert)
ergab die Werte von 1,94 (2) für Arginin, 0,95 (1) fur Serin, 1,00 (1) für Glyzin, 3,02(3) für Prolinι und
2,04 (2) für Phenylalanin (die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben). Die biologische Pru- *s
fung des Produkts an einem Hemmuskel von Meerschweinchen
zeigte die gleiche spezifische Aktivität wie bei der authentischen Probe von Bradykinin wie
aus A b b. 1 ersichtlich ist, in welcher die Linie A die
Aktivität des Produkts zeigt und die Linie ΰ cue
Aktivität der authentischen Probe von Bradykinin zeigt.
Tert.-BOC-L-Alanylharz, in welchem 0,287 MiUimol
des L-Alanins pro 1 Gramm Harz enthalten sind,
wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel J beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dab L-Aia-
35 nin an Stelle von Arginin verwendet wurde. In ein
Reaktionsgefäß wurde t.-BOC-L-Alanylharz (in welchem
0,287 Millimol von L-Alanin pro Gramm Harz
enthalten sind) gegeben und Methylenchlorid dazu gegeben, um das Harz voll aufzuquellen. Nach dem
Abfiltrieren des Methylenchlorids wurden die Reaktionsstufen, wie aus Tabelle 2 ersichtlich, in der angegebenen
Reihenfolge durchgeführt, wobei jede Stufe in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt wurde, indem t.-BOC-Aminosäuren in der folgenden Reihenfolge zugegeben wurden: t.-BOC-e-Benzyloxycarbonyl-L-Lysin,
t.-BOC-L-Prolin, t.-BOC-w-Benzyl-L-Threonin,
t.-BOC-O-Benzyl-L-Tyrosin, t.-BOC-L-Phenylalanin, t.-BOC-L-Phenylalanin,
t.-3OC-Glyzin und t.-BOC-O-Nitro-L-Arginin. Dies
ergab t.-BOC-w-Nitro-LArginyl-Glycyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L-Tyrosyl-O-Benzyl-L
- Threonyl - L - Prolyl -e - Benzy loxykarbonyl - L - Lysyl-L-Alanylharz.
Das auf diese Weise erhaltene Peptidharz wurde mit wasserfreiem Wasserstofffluorid, wie
im Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wurde. Das von dem
Harz befreite Peptid wurde dann in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt und ergab das
gewünschte Produkt in der Form von Pulver, i. e. L - Arginyl - Glyzyl - L - Phenylalanyl - L - Phenylalanyl-L-Tyrosyl-L-Threonyl-L-Prolyl-L-Alanin.
Das Produkt wurde einer Papierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei 4,8 pH und einer Farbreaktion
mit Ninhydrin nach dem Verfahren von Pauli und Sakaguchi unterworfen. Es wurde
dabei nur ein einzelner Fleck gefunden. Die Aminosäureanalyse des Produkts (in on-Chlorwasserstoffsäure
bei 1050C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert)
ergab die folgenden Werte: 0,84 (1) für Lysin. 0,83 (1) für Arginin, 0,85 (1) für Threonin, 0,77 (1) füi
Prolin, 1,07 (1) für Glyzin, 1,00 (1) für Alanin, 0,66 (l;
für Tyrosin und 1,92 (2) für Phenylalanin (die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben).
Tabelle 2
Stufe
Stufe
Reagenz
Menge an
Reagenz
Reagenz
Einwirkung Anzahl der
von Ultra- Behandschallwellen hingen
in Min.
von Ultra- Behandschallwellen hingen
in Min.
Entblockieren
Waschen
Neutralisieren
Neutralisieren
Waschen
Peptidbildende
Reaktion
Waschen
Waschen
Waschen
50gewichtsprozentige Lösung
von Trifhioressigsäure in
Methylenchlorid
Methylenchlorid
Äthylalkohol —
Methylenchlorid
Methylenchlorid f t-BOC-Aminosäure
\ Dicyclohexylcarbodiimid
Methylenchlorid
Methylalkohol
Methylenchlorid
10 ml | 3 |
10 ml | 1 |
10 ml | 1 |
10 ml | 1 |
10 ml | 1 |
0,17 g | 3 |
10 ml | 1 |
10 ml | 1 |
10 ml | 1 |
nvlalanyl-w-Nitro-L-Arginylharz wurde im wesen
«S liehen wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt wob
jedoch keine Einwirkung durch Ultraschallwelle
T.-BOC^-Nitro-L-Arginyl-L-Prolyl-L-Prolyl-Gly- erfpjf Reihenfoige der Behandlung ist wie folgt:
cyl-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L-Seryl-L-Prolyl-L-Ftie
Vergleichsversuch
Tabelle 3 | 24 10 i | Reagenz | B50 | 10 ml | r | 10 | Anzahl der Behand lungen |
|
9 | Stufe | Essigsäure | 5 ml 0,15 g |
4 | ||||
Waschen | Chlorwasserstoff | 10 ml | 1 | |||||
Entblockieren | Essigsäure | Menge an Reagenz |
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen | Zeit (Min.) |
3 | |||
Waschen | Äthylalkohol | 10 ml | 2 | 4 | ||||
Waschen | Methylenchlorid | 10 ml | 30 | 4 | ||||
Waschen | 10 ml | 2 | 1 | |||||
Neutralisieren | 10 ml | 2 | 7 | |||||
Waschen | 10 ml | 2 | 1 1 |
|||||
Peptidbildende Reaktion |
lOgewichtsprozentige Lösung von Triäthylamin in Methylenchlorid 10 ml |
10 | 3 | |||||
Waschen | Methylenchlorid | 2 | ||||||
t.-BOC-Aminosäure Dicyclohexylcarbodiimid |
30 120 |
|||||||
Methylenchlorid | 2 | |||||||
Claims (1)
1 2
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Patentanspruch: ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von
Peptiden von Aminosäuren oder deren Oligomeren,
Verfahren zur Herstellung eines Peptids durch in welchem Vorbehandlung und Nachbehandlung der
Kupplung einer Aminosäure oder eines Oligomeren 5 aus der Reaktion gebildeten Peptide innerhalb einer
von dieser mit einer Aminosäure oder Oligomeren verkürzten Zeitspanne durchgeführt werden kann,
von dieser, welches an ein Harz gebunden ist, Wsitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden
von dieser, welches an ein Harz gebunden ist, Wsitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden
wobei ein Peptid auf dem Harz gebildet wird, Erfindung gehen eindeutig aus der nachfolgenden
Abspalten des Peptids von dem Harz und an- Beschreibung hervor.
schließende Extraktion des Peptids, dadurch io Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren
gekennzeichnet, daß die peptidbildende zur Herstellung eines Peptids durch Kupplung einer
Reaktion und/oder die Extraktion des Peptids Aminosäure oder eines Oligomeren von dieser mit
unter Einwirkung von Ultraschallwellen mit einer einer Aminosäure oder Oligomeren von dieser,
Frequenz von etwa 18 bis 22 kc/s durchgeführt welches an ein Harz gebunden ist, wobei ein Peptid
wird. 15 auf dem Harz gebildet wird, Abspalten des Peptids
von dem Harz und anschließende Extraktion des
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2743873 | 1973-03-07 | ||
JP48027438A JPS5183B2 (de) | 1973-03-07 | 1973-03-07 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2410850A1 DE2410850A1 (de) | 1974-10-03 |
DE2410850B2 true DE2410850B2 (de) | 1976-06-10 |
DE2410850C3 DE2410850C3 (de) | 1977-01-27 |
Family
ID=
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5183B2 (de) | 1976-01-05 |
GB1423961A (en) | 1976-02-04 |
US3867269A (en) | 1975-02-18 |
BE811961A (fr) | 1974-07-01 |
JPS49110601A (de) | 1974-10-22 |
NL7403056A (de) | 1974-09-10 |
FR2220514B1 (de) | 1976-06-25 |
DE2410850A1 (de) | 1974-10-03 |
FR2220514A1 (de) | 1974-10-04 |
CA1019324A (en) | 1977-10-18 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |