DE1795522A1 - Halogenmercuri-N-carboxyanhydride von basischen Aminosaeuren - Google Patents

Halogenmercuri-N-carboxyanhydride von basischen Aminosaeuren

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DE1795522A1 DE19661795522 DE1795522A DE1795522A1 DE 1795522 A1 DE1795522 A1 DE 1795522A1 DE 19661795522 DE19661795522 DE 19661795522 DE 1795522 A DE1795522 A DE 1795522A DE 1795522 A1 DE1795522 A1 DE 1795522A1
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Description

Ilaiogenmereurl-A-carboryimhydrld« von baulBChon Aminosäuren
Die Erfindung betrifft neue HaLogenmercurL-H-carborpanhydride τοπ baoLochen AminonUuren, wie Arginin, HIotLdLn, Lye In und Ornithin, und die Hare teilung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung bei der Her»teilung von Peptiden.
Polypeptide sind eine groBfie Klanoe von chaaiochen Verbindungen, welche Dipeptide, Tripeptide, Tetrapeptide und höhere Peptide umfassen, In welchen Aminooäuren miteinander durch Amldblndungen (Peptidbindungen) verbunden Bind, ELno sehr groüoe Anaahl von ihnen wurde durch teilweise Hydrolyse von ProteLnen isoliert. BLnige Polypeptide «it hohem Molekulargewicht wurden chemisch hergestellt. Auch viele verhaltninmiinaLg nLodrlg molekularo Peptide, die beiopielswelae biü zu 6 oder θ Aminooäuren enthalten, wurden herge«teilt. Proteine sind groeaenteile Polypeptide, die gewöhnlich 100 odor mehr miteinander yerbundene Amlnooüuresegmento enthalten.
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Polypeptide oind nicht nur als Bausteine zur Synthese von Proteinen wertvoll, sondern auch desv/egen, weil gewisse von ihnen therapeutisch aktiv sind. Sie sind auch wertvoll bei der Untersuchung und Analyse von Proteinen. Einer der fruchtbarsten Anaätze zur Untersuchung der Proteinstruktur war die teilweise Hydrolyse des Proteins und anschliessende Isolierung und Analyse der erzeugten Polypeptldfragmente. Solche Arbeitsweisen ergeben eine sehr begrenzte Menge an Information bezüglich der atrukturellen-funktionellen Verhältnisse und Anforderungen in Polypeptiden und Proteinen. Eine senaue Information dieser Art könnte nur durch die Synthese von Polypeptiden auf gesteuerte bzw. kontrollierte stufenweise Art erhalten werden.
Überdies ergeben derartige Untersuchungen, wie.sie durchgeführt wurden, keinen Einblick in die Wirkungsweise von Eneymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen Körperfunktionen. Sie liefern weder Information, welche die Herstellung von brauchbaren Varianten der natürlichen Proteine gestatten würde, noch Irgendeine Information, die die Herstellung von therapeutischen Mitteln zulassen würde, die spezifisch derart nach Hass hergestellt Bind, dass sie mit natürlichen Proteinen In brauchbarer Welse in Wechselwirkung treten.
Obwohl elno Anzahl von «ynthetischen Methoden vorgeschlagen ' wurde, ist bis Jetst keine Idealmethode rur Synthese von Polypeptiden gefunden worden. Ee wurde keine erfolgreiche Methode sur Synthese entwickelt, welche die Bildung von aufeinanderfolgenden Peptidb'indungen in einer wachsenden Peptidkette gestattet und die oft schwierige Stufe der selektiven Entfernung der Schutzgruppe ohne Erfordernis der Isolierung der Zwischenprodukte bei jeder aufeinanderfolgenden Stufe vermeldet. Solche Methoden, wie sie verwendet wurden, sind wtthoara, kostspielig und zeltraubend. Zur Bildung eines einfachen Dipeptidn durch Umsetzung zwischen Jswel verschiedenen AmIäostiuren erfordern die besten bekannten Methoden die Blockierung
der Arainogruppe einer Aminosäure und der Carboxylgruppe der anderen, so daon eine selektive Reaktion £ur Bildung nur dee gewünschten Dipeptide unter den vier möglichen Produkten erfolgt. Aueserdem erfordert im allgemeinen die Carboxylgruppe, die umgesetzt werden soll, eine Aktivierung durch Überführung in ein Säurehalogenid oder eine andere Modifikation, die reaktiver ißt als die Carboxylgruppe. Die ewe! Moleküle werden dann kondensiert, um das Dipeptid zu bilden, und öchliesßlich werden die Schutzgruppen entfernt. Die Beaktiouen erfordern demnach 1) das Anbringen der Schutzgruppen, 2) die Aktivierung der Carboxylgruppe, 3) die Kondensation, und 4) die Entfernung der Schutzgruppen. Das ganze Verfahren hubs wiederholt werden, um nur eine weitere Aminosäure en das Dipeptid anzufügen, und immer wieder wiederholt werden, um aufeinanderfolgende Aminosäureoegmente anzufügen. Überdies ist eo zur Herstellung von Polypeptiden für eine wirklich einnvolle Untersuchung gewöhnlich notwendig, die Racemisierung der Aminosäuren und Peptide während dieser Reaktionen su vermeiden, eo dass optisch reine Produkte hergestellt werden· Venn aan dieses Racemisierungsproblen suearaen nit der Tatsache betrachtet* dass die Gesamtausbeuten in der Peptidsynthese sehr gering sind, sowie die Tatsache, dass es-über 10 aögliche Polypeptide gibt«, die nur 20 verschiedene AminosEureseg*ente enthalten, ist es nicht verwunderlich, Oase trots der anerkennten Yr'iohtigkeit solcher Produkte sehr wenig grosee Polypeptide und einfache Proteine % tatsächlich hergestellt wurden. Solche Produkte, wie sie hergestellt wurden, erforderten eine mehrjährige Arbeitszeit eines Hannes zur Fertigstellung. über Insulin wurde von mehreren Gruppen von Wiesensohaftlern auf der ganzen Vielt gearbeitet, und seine erfolgreiche Synthese war das Ergebnis 10Jähriger Bemühungen seitens einer dieser Gruppen.
Die Synthese von Peptiden, welche basische Aminosäuren, wie Lysin, Histidin und Arginin, enthalten, hat sich wegen des Yorliegens. dieser weiteren funktionellen Gruppe als ein be-
~ 3 *" ÖAD ORIGINAL
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sonders schwieriges Problem erwiesen· Bs worden mehrere Methoden entwickelt, «οι die Schwierigkeit eu ireraeldett. In den meisten davon wird die soe&tslicha funktionalle gruppe daran gehindert, in die Peptidbildungereaktion einzutreten, lade« man sie mit einer leicht entfernbaren Gruppe blockiert. Der Imidoteil von Histidin beispielsweise, kann »it einer Beneylgruppe blockiert werden, die sp&ter durch Hydrieren oder andere reduktive Arbeitsweisen entfernt wird. $iesea Hilfeolttel kann zwar für einfache Peptide brauchbar sein« die nur einige Aminosäuresegmente enthalten* bewirkt jedoch oft Problene bei komplizierten Polypeptiden, wo die bot Entfernung der _ BenEy!gruppe oder anderen Schutzgruppe erforderlichen Bedluw gungen oft so soharf sind, dass andere funktion« He Gruppen nachteilig beeinflusst werden« In jede» fall« sind - ob nun niedermolekulare Peptide oder Polypeptide hergestellt werden -swel Extraschrittθ in der Geeamteyntheee erforderlich, nftmlicb die Bildung der geschtitsten Aminosäure und die Entfernung der schlit send en Gruppe.
Eine Methode, die beträchtliche Aufmerksamkeit sur unkontrollierten Synthese von Homopolymer en, wie Polyalanin und PoIyglutaminsäure ron wechselnden Molekulargewichten und ear unkontrollierten Synthese ron Heteropolymeren mit regellos angeordneten Amittosauresegttenten gefunden hat, ist Aas H-Oarbg* oiyanhydrid-Verfahren, daa Mar als lOA-Hethode teseiohaet wird· Diese Polyaerieationereaktionen wurden In organisohea Löeungeeitteln unter Terweedung katalytischer Mengen an Base \ durohgeftihrt. Die hergestellten Produkte haben «in« oberflächliche Ähnlichkeit mit natürlichen Proteinen la eisigen Ihrer physikalischen Eigenschaften, sind, jedoch praktisch ohne Wert bei der Untersuchung der chemischen und physiologischen Eigenschaften von Proteinen, überdies sind die Arbeiteweisem nicht auf die Herstellung τοη Heteropeptlden bekannter Struktur und bekannten Molekulargewichtes anwendbar, die βpeelflach definierte Aminosäuren in rorbestimmton Stellungen In der Peptidkette enthalten.
BAD ORIO(NAL 109883/1922
Wegen der Leichtigkeit, ait welcher Homopeptide gebildet werden, wurde ron anderen vermutet, dass die BCA-Methode auf die kontrollierte, stufenweise Synthese von Heteropeptiden anwendbar sein könnte. Tatsächlich wurden frühe Versuche unternommen, um die Methode auf die Synthese von niedrig-molekularen Heteropeptiden in organischen Lösungsmitteln anzupassen. Die Methode wurde niemale in wässrigen Medien bei der kontrollierten, stufenweisen Synthese von Heteropeptiden angewandt, bei welcher zwei oder mehr Aminosäuren in aufeinanderfolgenden Stufen an eine wachsende Peptidkette angefügt wurden. Tatsächlich wurde von denjenigen, welche diese aufeinanderfolgenden Reaktionen vorschlugen, der Schluss gezogen, dass die etufenweioe Synthese von Polypeptiden durch die. NCA-Methode unmöglich ware, weil die relativen Geschwindigkeiten der Hauptreaktion und der Hebenreaktionen nicht kontrolliert werden 'könnten.
BIe Anpassung dar SCA-Arbeltsweise an basische Aminosäuren ist oft mühsam, vor alles da die susätsliche ftraktionelle Gruppe die Anhydridbildung stört. Ee ist gewöhnlich noch am besten» die «usätzliohe basisch· Gruppe su schüteen, um einen Aus« beuteverlust bei der Peptidbildung auf Orund der Umseteung * «wischen dieser Gruppe und eines Molekül Anhydrid su verhindern. Wen» «an beispielsweise Ityeyl-plienylslanln durch Umsetzung »wischen I-Carboxylysinanhydrid und Phenylalanin her- * stellen will, kann die Ausbeute enroll Umsetsung «wische« da« einen Molekül de« Anhydrids und dor £-Amiuogrupp· des anderen Molekül« des Anhydride erniedrigt werden, wenn nicht die £-Amlnogrttpp· geschiftet wird. Die üblichen Schutsgruppen jedoch, wie die Ben«yloxyoarbonylgruppe oder deren Analoge oder Hoeologe, Dind nicht cufriedenstellend wegen der Schwierigkeit dea Einbringens und der Entfernung der Schutegruppe und wegen der geringen Ausbeuten, die man oft bei solchen Reaktionen erhält.
- 5 - BADORiGINAi.
Gegenstand der Brfindung sind dride τοη baeisehen Amiuoeäuren und ein VerftAren »er Hers*el~ lung dieser Verbindungen, das dadurch gekeu*««tel*et IBt1 daa» nan ein HalogennercurisslE einer baeiechen AalnosSure Kit Phosgen bei einer Temperatur tob etwa 0° 0 Hn 10° U mnetgt.
Die neuen Halogenmercuri--}i~carboxyanbjdride, wie HalogennGrcuri-H-carboiyarginlnanhydrid, im denen die soe&tslloite funktionelle Gruppe durch eine XHg-Groppe gesohtltst 1st, in der X Halogen bedeutet, kennen »it einer A»i»p*tture unter kontrollierten wäBerlg-alValiechen Bedingungen sn Carbaiüten ungeaetst werden, die durch Zugabe τοη Säure «u.Beptlden 4eoarboiyliert werden. Die Queckailberionen im der I*0cnmg worden durch Auefällen alt Schvefelwaaeeretoff entfernt. Die Erfindung eröffnet also einen bequeaen Weg «α K-0arbin7anhydriden von basischen Aainoaänren, die in der ICA-Syntheae Terwendet werden kdnnen·
ZtUi leichteren Verständnis sei auf das folgende Beaktionssoheaa rerwiesen, das die Erfindung unter BesugnaAsA auf die Herstellung τοη Ioreyl-liieti4in erläutert«
BAD
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ClHgHf(CH2)^ CH2CO(P + 3 Hg 0 + 3 Cl0-HH ^
(2) I + COCl2 » ClHgHH(CH2)4~CH C « 0 + HgCl2
ffl} 0 löelich
ffl} 0 löelich
TT "^ S
(3) HgCl2 + Hg A Hg2Cl2 (filtrieren)
unlöslich
(4) η -M> %,K(CH2)4CH C = 0
H-I 0 +Hg(EDTAJ +
(5) III + H2C CH COOH
H2C I-H ^
H CH CH2
2 · H2I(CH2)4 CH2COI \
2 \
I CHa ""CHa
IH COO" ^ ^
CH CH2 4- CO
(6) Hg(EOTA) + H2S — > HgS + EMA
BAD ORIGINAL
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In der obigen Folge τση Gleichungen wird Xthylendiaftintetraeasiga&urepuffer (SBTA) als Beispiel der Klaeee ron Puffern verwendet, die eur Kontrolle der Wasseretoffionenkonseutr&tion la ReaktionsgeBisch während der Kupplungereaktion angewandt werden kann.
Halogennercurisals wird Eueret durch Utoaetsnng zwischen der Aminosäure und 2 Mo!.äquivalenten eines Mercurihalogenidaalsee in wässrigem Alkali hergestellt. Obwohl andere Hereurlhalogenide verwendet werden ketonen, wird Vortragsweise Merouri-Chlorid verwendet, und «war wegen seiner in Vergleich su anderen Mercurihelogenidea grSeaeren Löslichkeit. Sie Reaktion erfolgt nornalerweise durch Miechen der Roaktionekomponenten in wässrige« Alkali bei einen pH-Wert von etwa 8 bis 9 bei etwa Zimnerteeperatur, d. h. 20° C bis 55° C, bis etwa 75° O und Andauernlaaeen der Reaktion, voreugeweise unter Rühren, bis weaentliche Mengen an Produkt gebildet eind. Die Bauer der Reaktiomaeelt echwankt alt der Hesjperatur, der Mengen an Reaktionakomponenten und anderen Faktoren, doch 1st in den meisten Fällen eine. Reaktionszeit von etwa 1 bis 5 Stunden eufriedenstelland. Der pH-Wert kann «it Alkalibaaen Xm gewünschten Bereich gehalten werden, inebeacmdere Alkalicarbonate«, wie latriu*- oder ZdthluMoarbonat. Bei Waseeratoffionenkonsentrationen betrlohtlioh unter θ 1st die Ausbeute an gewünschtem SaIs, Aas 2 Quecke übe riemen enthält, betrtohtflich niedriger. Bei Waeeeretoffioneiikon*entrationeia über pH etort das Hydroxylion dan Verlauf der Reaktion.
Aus Zwecksitssigkeltagrundan werden die so hergestellten Salsa im folgenden ale Balogamarourlsalse beeelohnet.
Die Halogennercurisalse werden in Halogeneercuri~lf-cerboxyanhydride durch TJümeteung «it Phosgen in einen polaren, organischen LHeungBBittel, zveckmiieeig eine« Keton, der beispielsweise bier eu 8 Kohlenetoffatomθ enthält, umgewandelt. Aceton
^- . Λ Λ A BAD ORIQiNAL
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ar
1795522 wird wegen seiner leichtem Zug&ngllchkeit bevoräugt. Hie Reaktion wird vorxugswei«· bei tiefer Temperatur, d. h. bei etwa 0° C bis etwa 10° C bewirkt, indem Phosgen, vorzugsweise unter Rühren, durch ein Genisch des Anhydrids Im gewählten Lösungsmittel geleitet wird. Temperaturen etwas über oder unter diesem Bereich können gewünsohtenfalls angewandt werden. Die so hergestellten neuen Verbindungen können als polymere Verbindungen existieren, reagieren jedoch als Monomere und können durch Formeln, wie <iio oben angegebene Formel II, dargestellt werden.
Am Ende der Reaktionszeit, die normalerweise etwa 1 bis 4 Stunden beträgt, enthält das Gemisch Mercur!halogenid und das gewünschte neue Halogenmsrouri-S-carboxyauhydrld der basischen Aminosäure in Lösung. Das Mercurichlorid wird sum unlöslichen Mercurlaals reduziert, das zusammen mit Jeglichen überschüssigen, metallischen Quecksilber durch Filtrieren oder andere geeignete Maesnahmen entfernt werden kann. Das gewünschte Produkt kann dann durch Entfernung des Lösungsmittels, vorzugsweise durch Destillation bei vermindertem Druok, isoliert werden·
Das so hergestellte Anhydrid kann in ein Peptid, einachlieeslich von Dipeptides und Polypeptiden, durch Umsetzung mit einer Aminoo&ur« oder ein·« Peptid bei einer tiefen Temperatur, sweckmaesig etwa 0° C bis 10° C, in einem waaerig-alkalischen Medium während einer Reaktionszeit von etwa 30 Sekunden bis etwa 5 Hinuten unter gutes Mischen über fuhrt werden'. Das eich als Zwischenprodukt bildende Carbaaat wird dann decarboxyliert, voreugaweise durch Zugabe von Saure, xur Verringerung des pH-Wert ee des Mediums anf etwa 2 bis 5.
Das Carbamat wird unter alkalischen Bedingungen gebildet« vor·* zugsweise bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 10,5. Die gewünschte Alkalinit&t kann durch Verwendung irgendeines von mehreren
BAD ORfQfNAl.
bekannten festen oder flüssigen baaieoben Reagentlen, wie Magnesiumoxid oder verdünnten Alkalihydroxide* aafreehter~ halten werden. Manchmal 1st* eo swectaäasig, weiteres basisches Reagens wahrend des Verlaufe der Reaktion susugeben, um dl« gewünschte Alkalinität aufrechtzuerhalten. Es können versehiedene Puffer verwendet werden. Bas basische Beagena sollte jedoch ein solchen sein, das nicht alt dem la Reaktionsgemiseh vorliegenden Mercuriion unter Ausfällung eines Merouri-8altes reagiert. Aus diesen Grund sind Borat» und Phosphatpuffer nicht geeignet, aueaer wenn als In kleinen Mengen In Kombination alt anderen Puffern verwendet werden. Bin Puffsrungssystern, das sich als besonders geeignet but Verwendung in der vorliegenden Erfindung erwiesen hat, let^ SDTA, d. h. Xthylendlaalntetraesslgs&ure. Dieser Puffer kenn durch Aufnehmen von BDTA in Wasser, gewöhnlich Ma «u einer Konsen~ tra^ion von 1 aolar und anechlieeaender Zugab« von ausreichend Alkalihydroxid, ua den gewünschten pS-Vert einsusteilen, hergestellt werden. Dieser Paffer kann gewflnsohtenfalle susaanen alt kleinen Mengen an Boratpuffer verwendet werden·
lach der Decarboxylierung enthält das ReattlonsgsmlacA bannt-* efichlich das gewunsdits Produkt, d- h. das die baslsohs Aalnosäure enthaltende Peptid und das HerottrlloB, das alt dea Puffer in Fora eines ICelichen Salmes Tsrbonden sein katm. Das Merouriion wird ans des BeaktionsgealeoA duroh AusfUlsn als Sulfid entfernt. Dies wird aa bequemsten bewirkt, Indea Schwefelwasserstoff durch die lösung geleitet wird· Das ausgefällte Merourisnlfld wird vorTOgsweiss abfiltriert.
Gewunschtenfalls kann das Peptid aua der Wetmg ohroaategraphisch oder durch Gefriertrocknung oder andere geeignete Hasenahmen gewonnen werden. Alternativ kann das öealsch duroh Zugabe eines Puffere oder einer anderen Sase alkalisch gemacht und das erfindungsgeaäss hergestellte Peptid in ein höheres Peptid überführt werden. Beide Alternativen sind In den Beispielen geseigt.
* * v <■ BAD ORIGfNAL
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Das Verfahren let auf alle basischen Aminosäuren anwendbar, gleichgültig, ob es sich üb naturlich Yorkonaende oder andere Aminosäuren handelt. Se let sowohl auf die L- als auch B-Formen der Säuren als auch auf racemieche Gemische anwendbar* beeinflusst die Symmetrie des Moleküls nicht.
Beispiel 1 H-ChIoromercurlhistidin-S-carboxyanhTdrid
Insgesamt 15·52 g L-Histldln werden zu einer wässrigen lösung von 25,0 s eines 2 : 3 Gemisches von Kaliumbicarhonat und Kaliumcarbonat in 1 1 Wasser Hugefügt. Zu diesem Gemisch werden unter raschem Rühren 54,30 g Mercurichlorid- unter gelindem Erwärmen augefügt. Die Temperatur wird auf etwa 65° C ansteigen gelassen und das Rühren fortgesetet, während sich das "Reaktionsgemlsch auf Ziemer tempere tür abkühlt. Das Produkt, ir-Chlormercurihistidin, fällt aue und wird abfiltriert.
Insgesamt 39,44 g des so hergestellten Produktes werden etwa 1 1/2 Stunden in 100 al trockenem Aceton gerührt, um eine feine Suspension «u bilden. Weitere 100 ml Aceton werden zugefügt, und das Reaktionsgeaisoh wird in Sie abgekühlt, während überschüssiges Phosgen während etwa 40 Minuten durchgeleitet wird. Das Sie wird entfernt, und 2 al Quecksilber werden sub Gemisch gegeben. Der sich bildende niederschlag wird abfiltriert und das Flltrat bei niederem Druck destilliert, um das Lösungsmittel su entfernen, wobei das gewünschte Produkt als Rückstand hinterbleibt· Bs wirft durch Aufnehmen des Rückstandes in 100 al Methylethylketon, aus welchem es beim Abkühlen ausfällt, gereinigt. Der Iiedereohlag wird gewonnenr mit einer kleinen Menge weiterem kaltes Hethyläthylketou und dann mit Benaol gewaschen. Weiteres Produkt wird durch sorgfältige Zugabe von Benzol su der Methylethylketon-Mutterlauge erhalten.
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Die nachstehend aufgeführten Verbindungen werden in entsprechender Weise hergestellt. In jeden fall wird die Ausgangsaminosäure in ein Halogeneercurisalz durch Umsetzung von 0,1 Mol der Auegangeaminoeöure mit 0,2 Mol Mercurichlorid oder Merouribromid in einen wässrigen Medium bei pH 8 bia 9 geaäeo der oben beschriebenen Arbeitweise überführt. Das Halogenmercuriealz wird isoliert und in Aceton oder Methyläthjlketoti in das Anhydrid überführt. Die ersten zwei Verbindungen werden bei 0° C und die letzten fünf Verbindungen bei 10° C hergestellt.
H-Chlormercuriarginin-H-carboxyanhydrid H-OhIonaercurilysin^T-carboiyanhydrid H-Chlorffiercuriomithin-li-carboxyanhydriä H-Bromnercuriarginin-N~carboxyanhyd-.iä Jf-BromaercurilyBin-fli-carboxyanhydrid H-Bronmercuriornithin-S-cerboxyanhydrid H~Bro«mercarihietidin--H-carbc»xyanhydrid. Beispiel 2 Hiatidyl-alanin
Insgesaart 90 mg Alanin werden in 25 nl 0,2 at EM1A-Puffer bei pH 10 gelöst und 1,292 g I-Chlormercurihistidin-H-carboacyanhydrid rasch bei 0° C unter rasche« Rühren zugegeben. lach 5 Minuten wird der pH-Vert des Gemisches durch Zugabe ran konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 erniedrigt. Schwefelwasserstoff wird durch das Ueaiech geleitet, um das Queckeüber auszufällen, und der niederschlag wird abfiltriert. Das PiI-trat wird von Schwefelwasserstoff und anderen Gasen Bit Stickstoff freigeopült und auf ein Volumen von 50 ml rerdüimt. D- ' pH-Vcrt wird durch Zugabe too verdünntem Ifatriuetyeroxid auf etwa 8 eingentellt. Did LOsung wird durch Überleiten über eine Kohlekolonne entsalzt. Das gewünschte Produkt wird
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Chromatographiech isoliert, indem es über eine Silicagelkdlonne geleitet und mit 1:9 Ammoniak-Methanol eluiert wird.
Beiapiel 5
Lynyl-al anyl-leucyl-glycyl-lsoleuc in
Insgesamt 368 mg Alanyl-leueyl-glycyl-isoleucin werden in 100 al Wasser aufgenommen, das EDTA-Puffer bei pH 8 enthält, und. 1,68 g H-ChlorBercurilysin-If-carboxyanhydrid werden bei 3° G unter raschom Rühren zugefügt. Nach 30 Sekunden wird der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 2 erniedrigt, Schwefelwasserstoff wird durch daa Gemisch geleitet, um das Quecksilber als Sulfid auszufällen, das abfiltriort wird. Stickstoff wird durch das Piltrat geleitet, um es von restlichem Schwefelwasserstoff und Kohlendioxid freizuspülen. Das Filtrat wird dann auf 150 ml verdünnt und der pK-Wert durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Die Lorning wird entsalzt, indem sie über eine Kohlekolonne geleitet wird, und das gewünschte Produkt wird chromatographiach aus einer Kieseleäule isoliert.
Beispiel. 4 Glycyl-arginyl-^lycyl-phenylalanyl-leucin
Zu einem Gemisch von 4,0 mMol Leucin in 20 nl V/asser bei 0° C werden 3,1 Mol N-Carboxyphenylalaninanhydrld gegeben, während der pH-Wert durch intermittierende Zugabe von Bariumhydroxid bßi 10,5 gehalten wird. Die Rejiktion ist in 1 Minute beendet. Der pH-Wert wird durcli Zugabe von 1Obiger Schwefelsäure auf 3,5 ei*?gesfcell fc. Das auofallende Bariumsulfat wird abfiltriert und dan Fillrat, flae Phenylalanyl-leucin entMlt, mit 3,2 mMol
tisniiydrid bei -3° C behandelt, wobei durch Vervcn Bai'iuraliydroxid ein pH-V/ert von 10,5 aufrechter-
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BAD ORIGINAL
109803/1922

Claims (2)

15 :Ό .767. 9 - Τΐ·.Α. 6 iff 1^- Januar 1970 Merok & Co., Inc. 12 921 / M 70 Ο65
Paten tansprU ehe
.jHalogenmerouri-N-carboxyanhydride von baaisahen Aminosäuren.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Halogenmerourlealz einer basischen Aminosäure mit Phosgen bei einer Temperatur von etwa 0 0C bis 10 0C umsetzt.
2. Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Halogenmereurisalz das Chlormercurlsalz von Arginin, lysin. Ornithin oder Histidin verwendet.
BAD ORIGINAL 109883/1922
halten wird. Die Decarboxylierung wird bewirkt, indes» der pH-Wert mit koftsontrierter Schwefelsaure auf 3,5 eingestellt und das ousfallende Bariumsulfat abfiltriert wird. Der pH-Wert des Piltrats wird auf 9,5 mit EDTA-Puffer eingestellt, und 1,5 β H-Broamercuriarginin-ff-cßrboxyanhydrid werden bei 5° C unter ratschen Rühren zugefügt. Bach 2 Minuten wird der pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsaure auf 2 eitigestell1!;. Schwefelwasserstoff wird durch das Gemisch geleitet, um Quecksilber als Sulfid aussufallen, dae dann abfiltriert wird. Das Piltrat wird nit Stickstoff gespült nnd der pH-Wert mit 40#ige» Kaliumhydroiid auf 10 eingestellt. Das Gemisch wird auf 0° C abgekühlt, und 3,5 bjHoI H-Carboxyglyeinanhydrid werden unter räuchern Rühren zugegeben. Hach 1 Minute wird der pH-Vert durch Zugabo von Schwefelsäure auf erniedrigt» und Stickstoff viril 5 Minuten durch das Gemisch geleitet. Der pH-Wert wird auf 7 eingestellt und das Gemisch gefriergetrocknet. Der feste Rückstand wird dann dreimal mit Methanol extrahiert, und die Mothanolextrakte werden an Silicagel adsorbiert und sur Trockne gebracht, Das Silicagel wird dann zu einer SilicageleSule gegeben, die in Isopropanol präpariert ißt. Die SSuIe wird Bit Methanol : V'asaer : Ammoniak 80 : 18 : 2 entwickelt, um das gewünschte Produkt ssn isolieren.
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