DE2410850A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Description

dr. W.Schalk · dipl.-ing. P.Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg DR. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEI N HOLD · DR. D. GUDEL

6 FRANKFURT AM MAIN CR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

OUG-47/c/by/O Wd/Be

Professor Dr. Juntaro Kamahora Osaka University

36, Jyoan-cho, Kita-ku, 0 saka-shi, Japan

Verfahren zur Herstellung von Peptiden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren in fester Phase zur Herstellung von Peptiden.

Ein Verfahren in fester Phase ist bereits bekannt und umfaßt die folgenden Stufen: Kupplung einer Aminosäure oder eines Oligomeren von dieser mit einer Aminosäure oder Oligomeren von dieser, welches an ein Harz gebunden ist, wobei ein Peptid auf dem Harz gebildet wird, Abspalten des Peptides von dem Harz und anschließende Extraktion des Peptides.

Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß das synthetisch hergestellte Peptin auf dem Harz aus nicht umgesetzten überschüssigen Reaktionspartnern und Nebenprodukten sehr leicht durch Auswaschen getrennt werden kann , es hat jedoch den großen Nachteil, daß

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die Reaktionsgeschwindigkeit niedrig ist und daß es schwierig ist, die Reaktion einheitlich durchzuführen. Insbesondere der letztgenannte Nachteil stellt ein ernstes Problem bei der Synthese von Peptiden aus Aminosäuren und deren Oligomeren dar. Bei den Verfahren in fester Phase ist es leicht möglich, daß die Umsetzung der Aminosäuren oder deren Oligomeren mit den an das Harz gebundenen Aminosäuren oder deren Oligomeren nicht einheitlich ist, so daß es schwierig ist, homogene Produkte zu erhalten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, bei dem die oben erwähnten Nachteile der herkömmlichen Verfahren in fester Phase zur Herstellung von Peptiden von Aminosäuren oder deren Oligomeren eliminiert wurden.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur Herstellung von homogenen Peptiden von Aminosäuren oder deren Oligomeren durch einheitliche Umsetzung und stark beschleunigter Reaktionsge3±windigkeit.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur Herstellung von Peptiden von Aminosäuren oder deren Oligomeren, bei dem die Extraktion der erhaltenen Peptide in sehr kurzer Zeit durchgeführt wird.

Eine, weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Peptiden von Aminosäuren oder deren Oligomeren, in welchem Vorbehandlung und Nachbehandlung der aus der Reaktion gebildeten Peptide innerhalb einer verkürzten Zeitspanne durchgeführt weräen kann.

Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen eindeutig aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Das vorliegende Verfahren'zur Herstellung eines Peptids durch Kupplung einer Aminosäure oder des Oligomeren von dieser mit einer-an ein Harz gebundenen Aminosäure oder.des Oligomeren

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von dieser unter Bildung eines Peptids, .Abspaltung des Peptids von dem Harz und anschließende Extraktion des Peptids ist nun dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-bildende Reaktion unter Bestrahlung mit Ultraschallwellen durchgeführt wird.

Es ist nun gefunden worden, daß die Reaktion einheitlich und mit außerordentlich erhöhter Geschwindigkeit erfolgt, wenn bei den herkömmlichen Verfahren in fester Phase für die synthetische Herstellung von Peptid aus Aminosäure oder dessen Oligomeren die Kondensationsreaktion zur Bildung der Peptid-Bindung bei Bestrahlung mit Ultraschallwellen durchgeführt wird, wobei ein homogenes Peptid bei verkürzter Dauer der Reaktionszeit erhalten werden kann. Außerdem wurde gefunden, daß bei der Lösungsmittelextraktion des erhaltenen Peptids durch Ultraschallbestrahlung die Extraktionszeit ebenfalls verringert werden kam.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die übliche Vorbehandlung und Nachbehandlung der Peptid-bildenen Umsetzung, welche die Stufen Quellen,Waschen,EniüLockiaren und Neutralisieren umfassen, innerhalb einer bemerkenswert kürzeren Zeit abgeschlossen werden können, wenn die Durchführung unter Ultraschallbestrahlung erfolgt. ' _ · :\ " '

Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Aminosäuren umfassen eine große Vielfalt der üblichen Aminosäuren mit Aminogruppen und Carboxylgruppen im Molekül derselben. Beispiele von diesen sind Glyzin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalantin, Tyrosin, Methionin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Cystein, Arginin, Serin, Threonin, Histidin und ähnliche Monoammokarbonsäuren, Hydroxylamino säuren, Schwefel enthaltende Aminosäuren, etc.

Beispiele von Oligomeren der Aminosäure sind Oligopeptide, d.h. die Kondensationsprodukte von 2 bis 10 Mol der gleichen oder verschiedenen Aminosäuren, einschließlich z.B. Dipeptide, Tripeptide, Tetrapeptide etc.

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Diese Aminosäuren oder deren Oligomere werden als ein verwendetes Ausgangsmaterial in einer an ein Harz gebundenen Form verwendet, während als zweites Ausgangsmaterial diese als solche verwendet werden, d.h. in nicht an ein Harz gebundener Form. Die Arten der zu verwendenden Harze und der Verfahren zur Bindung der Aminosäuren oder der Oligomeren derselben an das Harz werden nachfolgend beschrieben.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwendenden Verfahren in fester Phase an sich kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Die typischen Verfahren dieser Art, die Vor- und Nachbehandlungsstufen umfassen, sind zum Beispiel:

Die Endaminogruppen der Aminosäuren oder der Oligomeren derselben werden zuerst mit Schutzgruppen "blockiert" und dann werden die N-blockierten Aminosäuren oder Oligomeren derselben an Harze gebunden, die sich in festem Zustand unter den für die Peptid-bildende Reaktion anzuwendenden Bedingungen befinden. Das Blockieren kann durch Umsetzung von Aminosäuren oder deren Oligomeren mit Alkyloxykarbaziden, wie z.B. tert.-Butyloxykärbazid, 2-(p-Biphenyl)-isopropyloxykarbazid und andere ähnliche, in Anwesenheit eines Alkalis bei Zimmertemperatur erfolgen. Unter diesen wird tert.-Butyloxykarbazid, das eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe (im folgenden als "BOC" bezeichnet) bildet, als Schutzgruppe am meisten bevorzugt.

Das Verfahren zum Verbinden der Aminosäure oder des Oligomeren derselben mit dem Harz ist nicht kritisch^ nach einem bevorzugten Verfahren wird jedoch das Harz zuerst chlormethyliert oder hydroxylmethyliert und dann wird das auf diese Weise modifizierte Harz mit N-blockierter Aminosäure oder deren Oligomerem in einer organischen Lösung umgesetzt. Für diesen Zweck sind verschiedene Harze, die unter den für die Peptidbildung anzuwendenden Reaktionsbedingungen fest sind, geeignet? sehr bevorzugt zu verwenden ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat.

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Das mit einer Aminosäure oder deren . Oligomerenr gebundene Harz wird anschließend einer Quell-'und Waschstufe unterzogen und dann einer Stufe zum Ent "blockieren der F-ständigen Blockgruppe. Die Quellstufe wird deshalb "bevorzugt (obwohl sie nicht immer notwendig ist),um die anschließende Peptidbildene Umsetzung zu erleichtern. In dieser Stufe wird das ^Harz mit einer organischen Flüssigkeit, die zum Quellen des Harzes geeignet ist, in Kontakt gebracht. Eine derartige organische Flüssigkeit ist zum Beispiel Methylenoxyd, Dioxan, Dimethylformamid, etc. Die anschließende Waschstufe wird durchgeführt, um das Quellmittel zu entfernen, wozu ein* geeignetes organisches Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäure, verwendet wird. Die Entblockierungsstufe wird durchgeführt, indem ein bekanntes chemischen Mittel, wie z.B. eine Mischung aus Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure oder eine Mischung aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid, verwendet wird. Das bevorzugte Mischungsverhältnis in diesen Mischungen ist .1 : 1 Gew.^. Die Entblockierungsstufe wird in üblicher Weise durchgeführt, zum Beispiel, indem das Harz mit dem Reaktionsmittel bei Zimmertemperatur in Kontakt gebracht wird. Das von der Schutzgruppe befreite Harz wird gewaschen, um überschüssiges Entblockierungsmittel zu entfernen· Danach wird das Harz mit einer geeigneten Base, wie zum Beispiel .tertiäres Alkylamin, neutralisiert und wieder zur Entfernung · dieser Base gewaschen. Danach wird die an das Harz gebundene erhaltene Aminosäure oder deren Oligomer einer Kondensationsreaktion mit Aminosäure oder deren Oligomer unterzogen, wobei die Aminogruppe in derselben Weisen wie zuvor blockiert wird, um das Peptid auf dem Harz zu bilden. Die Kondensationsumsetzung wird bei Zimmertemperatur unter Verwendung eines Kondensationsmittels, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, etc. durchgeführt. Durch Waschen des erhaltenen Produkts aus der Kondensationsumsetzung wird das an das Harz gebundene Peptid erhalten. Üblicherweise wird der Zyklus dieses Verfahrens mehrere Male wiederholt, um die Bildung des gewünschten Peptids auf dem Harz durchzuführen.

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Nach dem Waschen wird das an'das Harz gebundene Peptid yon dem Harz abgespalten, indem das erhaltene Harz mit einem abspaltenden Mittel, wie z.B. wasserfreier Fluorwasserstoff oder mit Bromwasserstoff gesättigte Trifluoressigsäure, in Kontakt gebracht wird. Die Behandlung wird üblicherweise bei einer Temperatur von etwa 0 bis 25⁰C durchgeführt. Nachdem das abspaltende Mittel unter reduziertem Druck abdestilliert wurde, wird das auf diese Weise von dem Harz abgespaltene Peptid mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäure, extrahiert,und das Harz wird von dem Extrakt abfiltriert.Wenn notwendig, wird der Extrakt durch eine Kolonne eines Ionenaustascherharzes geleitet, das z.B. "Amberlite -IR-45" sein kann, wobei das Peptid durch den Ionenaustauscher absorbiert und eluiert wird. Anschließend wird das Peptid gesammelt und lyophiliert, um reines Peptid zu erhalten. .

Erfindungsgemäß.ist es wesentlich, die Peptid—bildende Kondensationsumsetzung .mit:, herkömmlichen Verfahren in fester Phase unter der Bestrahlung von Ultraschallwellen durchzuführen.

Durch die Bestrahlung mit Ultraschallwellen ist es möglich, die Umsetzungsgeschwindigkeit der Kondensations reaktion die Umsetzungsgeschwindigkeit der Kondensationsreaktion zu erhöhen und die Reaktion einheitlich durchzuführen, erhalten werden kann. Tatsächlich kann erfindungsgemäß die Kondensationsumsetzung innerhalb einer kurzen Zeit von 5 bis 10 Minuten üblicherweise abgeschlossen werden, während bei dear herkömmlichen Kondensationsumsetzung, bei welcher keine Bestrahlung durch Ultraschallwellen erfolgt, etwa 2 bis 4 Stunden erforderlich sind.

Durch einen Zyklus dieses Verfahrens kann ein Mol der Aminosäure oder des Oligoraeren von dieser einheitlich an jede

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der zuerst an das Harz gebundenen Aminosäure oder Oligomeren derselben gekuppelt werden.

Die für diesen Zweck anzuwendenden Ultraschallwellen sind solche mit verschiedenen Frequenzen, im allgemeinen solche von etwa 18 bis kc/Sek, vorzugsweise etwa 20 kc/Sek.

Die zur Erzeugung der Ultraschallwellen verwendbaren Apparate können verschiedener Art sein. Zur Anwendung der Ultraschallwellen wird vorzugsweise ein Ende des UIt raschall vibrators in das Reaktionssystem gebracht und die Ultraschallwellen erzeugt. Das vorzugsweise zu verwendende Reaktionsgefäß ist ein solches, das einen Mantel für fließendes Wasser mit einer konstanten Temperatur aufweist.

Erfindungsgemäß können Ultraschallwellen nicht nur bei der Eondensationsumsetzungsstufe, sondern auch bei der Extraktionsstufe, bei welcher das gebildete Peptid in das Extraktionslösungs schicht, nach Abspaltung des Peptids von dem Harz, üb er geführt wird, angewendet werden,wobei die Extraktionszeit bemerkenwert reaizjert wird, während die Menge des Extraktes in großem Maße erhöht wird. Tatsächlich wird durch die Anwendung von Ultraschallwellen die Extraktionszeit auf etwa 3 bis 5 Minuten reduziert, während ohne die Anwendung derselben die Extraktionszeit etwa 0,5 bis 1 Stunde dauert. Überdies kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens eine der Vorbehandlung^- und Nachbehandlungsstufen für die Peptid-bildende Umsetzung, wie z.B. Quellstufe, Waschstufen, Entblockierungsstufe und Feutralisierungsstufe, unter Bestrahlung mit Ultraschallwellen durchgeführt werden. Die Bestrahlung mit Ultraschallwellen dient zur schnellen Erzielung der gewünschten Ergebnisse. Wenn zum Beispiel bei der Quellstufe Ultraschallwellen angewendet werden, wird ein* wirksamer Quellvorgang innerhalb ' ~^! % einer kurzen Zeit erreicht. Außerdem wird durch Bestrahlung mit Ultraschallwellen die Waschstufe und Entblockierungsstufe innerhalb einer kürzeren Zeit abgeschlossen.

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Deshalb erfolgt vorzugsweise die Durchführung der erwähnten Vorbehandlungs- und Nachbehandlungsstufen unter Einwirkung von Ultraschallwellen in dem Reaktionsgefäß für die Peptid-bildende Umsetzung, in welchem die Ultraschallbehandlung durchgeführt werden kann. In diesen Fällen sind Ultraschallwellen verschiedener Frequenzen ebenso anwendbar, aber solche mit einer Frequenz von 18 bis 22 kc/Sek sind - ebenso wie für die Peptidbildende Umsetzung - vorzuziehen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 -

11Og co -Nitro -L-Ar ginin wurden in 500 ml einer In NaOH-Lösung gelöst, und zu dieser Lösung wurde eine Mischung von 85,9 g tert.-Butyloxykarbazid und 500 ml Dioxan gegeben. Zu der erhaltenen Mischung wurden 85 ml Triethylamin gegeben und das ganze für 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von niedrig-siedenden Substanzen aus der erhaltenen Reaktionsmischung unter reduziertem Druck wurde der Rückstand über Kaliumsulfat getrocknet und 140 g t-BOC-C(j-liitro-I-Arginin erzeugt. Es wurden 10 g des chlormethylierten Mischpolymerisats aus Styrol und Ditinylbenzol (Mischpolyraerisationsverhältnis 98 : 2 Gew.Ji), in welchem 0,84 Milliäquivalente des Chlors pro Gramm des Mischpolymerisats enthalten sind, in einer Mischung aus 100 ml Äthylalkohol und 50 ml Chlorofore suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10,4 g t-BOC-^a-Nitro-l-Arginin und 4,7 ml Triathylamin gegeben und die Mischung unter Rückflußbedingungen 48 Stunden lang erhitzt, um das t-BOC-ö> Nitro-L-Arginin an das Mischpolymerisat zu binden. Das erhaltene Harz wurde dann mit Essigsäure gewaschen und getrocknet, worauf 10,6 g des t-BOC-^-Nitro-L-Arginylharzes erhalten wurden,in welchem 0,21 Millimol Arginin pro Gramm des Harzes enthalten waren·

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1,00 g des auf diese Weise erhaltenen, gut getrockneten t-BOC-o^Nitro-L-Arginylharzes wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben und 10 ml Methylenchlorid zugeführt, um das Harz voll aufzuquellen. Das Methylenchlorid wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert,und spezielle Mengen von Reagenzpartnern wurden in das, das Harz enthaltende Reaktionsgefaß in der Reihenfolge, wie sie in Tabelle 1 angegeben ist, gegeben, wobei nach jeder der angegebenen Stufe eine Ultraschallwellenbestrahlung mit einer Frequenz von 20 kc/Sek für eine bestimmte Zeit erfolgte. Die erhaltene Flüssigkeit wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert. Durch einen Zyklus der Stufen, wie er in Tabelle 1 angegeben ist, wurde das Peptid erhalten, wobei 1 Mol der verwendeten Aminosäure mit 1 Mol der an das Harz gebundenen Aminosäure kondensiert wurde. Es wurden verschiedene t-BOC-Aminosäuren für die Peptid-bildende Reaktion in der folgenden Reihenfolge verwendet: t-BOC-L-Phenylalanin, t-BOC-L-Prolin, t-BOC-0-Benzyl-L-Serin, t-BOC-L-Phenylalanin, t-BOC-Glyzin, t-BOC-L-Prolin und t-BOC-ω -Nitro-L-Arginin. Bei jedem Zyklus wurden in der Peptid-bildenden Reaktion nach der Zugabe der t-BOC-Aminosäure Ultraschallwellen für die Dauer von 0,5 Minuten einwirken gelassen, und dann wurde Dicyclohexylkarbodiimid als das Kondensationsmittel dem System zugeführt, worauf eine 2,5 Minuten dauernde Einwirkung mit Ultraschallwellen erfolgte. Jede der t-BOC-Aminosäuren wurde in der Form einer in Methylenchlorid gelösten Lösung verwendet, und das verwendete Dicyclohexylcarbodiimid wurde ebenfalls in der Form der Methylenchlorid-Lösung zugegeben. Es wurden 1,15 g t-BOC-cu-Nitro-L-Arginyl-L-Prolyl-L-Prolyl-Glycyl-L-Phenylalanyl-0-Benzyl-L-Seryl-L-Prolyl-L-Phenylalanyl-a>-Nitro-L-Arginyl-Harz gewonnen.

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Tabelle 1

Stufe

Reagens

Menge an Reagens

Einwirkung von
UIt ra s challweIlen
in Min.

Anzahl der Behandlungen

Waschen

*" Entblockieren ο

Waschen Waschen

^ Neutralisieren ο

Waschen

Peptid-bildende Reaktion

Waschen Waschen Waschen

Essigsäure

Chlorwasserstoff

Dimethylformamid Methylenchlorid

10 Gew.9ÖLge Lösung von Triäthylamin in Methylenchlorid

Methylenchlorid

Γt-BOC-Aminosäure ■ή Dicyclohexylcarbo-(^ diimid

Methylenchlorid

Methylalkohol

Methylenchlorid

10 ml

10 ml

10 ml 10 ml

10 ml

10	ml
5	ml
0,1	5 g
10	ml
10	ml
10	ml

1
1
1

1 2

2 3

1 1 1

919,4 g des auf diese Weise erhaltenen Peptidharzes wurde •getrocknet und danach in 15 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff bei O⁰C für die Dauer von 60 Minuten in Anwesenheit von 1,5 ml Anisol behandelt, wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wurde. Daraufhin wurde unter reduziertem Druck der Fluorwasserstoff und die flüchtigen Substanzen entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml 1n-Essigsäure suspendiert, und mit Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 20 kc/Sek für die Dauer von 3 Minuten zur Extraktion behandelt. Die das freie Peptid enthaltende Flüssigphase wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert, und das Filtrat wurde durch eine Säule von "Amberlite IR-45" geleitet. Die Säule wurde mit 1n-Essigsäure gewaschen. Das das Peptid enthaltende Eluat wurde aufgefangen und lyophiliert. Das erhaltene Pulver wurde über Phosphorpentoxyd in einem Exsikkator getrocknet und 177 mg des gewünschten Produktes, i.e. Bradykinin, erhalten. Die Ausbeute betrug 83,5%. Das Produkt hatte das gleiche Verhalten wie eine authentische Probe bei der Papierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei 4,8 pH und eine optische Drehung (D-Linie, 19°C) von -77,4° (C 1,28, 1n-Essigsäure). Die optische Drehung von reinem Bradykinin betrug -76,5° (C 1,27, 1n-Essigsäure). (Literaturhinweis: J. Amer. Chem.Soc. . Band 86, Seite 304, 1964.) Die Aminosäureanalyse des Produktes (in 6n Chlorwasserstoff säure bei 105°C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert) ergab die Werte von 1,94 (2) für Arginin, 0,95 (1) für Serin, 1,00 (1). für GIyzin, 3,02 (3) für Prolin, and 2,04 (2) für Phenylalanin. (Die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben.) Die biologische Prüfung des Produkts an einem Hemmmuskel von Meerschweinchen zeigte die gleiche spezifische Aktivität wie bei der authentischen Probe von Bradykinin, wie aus Abb.1 ersichtlich isi^Ln welcher die Linie A die Aktivität des Produkts zeigt, und. die Linie B die Aktivität der authentischen Probe von Bradykinin zeigt.

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Beispiel 2

Tert.-BOC-L-Alanyl-Harz, in welchem 0,287 Millimol des L-Alanins pro 1 Gramm Harz enthalten sind, wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß L-Alanin anstelle von Arginin verwendet wurde. In ein Reaktionsgefäß wurde t-BOC-L-Alanylharz (in welchem 0,287 Millimol von L-Alanin per Gramm Harz enthalten sind) gegeben' und Methylenchlorid dazu gegeben, um das Harz voll aufzuquellen. Fach dem Abfiltrieren des Methylenchlorids wurdendie Reaktionsstufen, wie aus Tabelle ersichtlich in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt, wobei jede Stufe in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurde, indem t-BOC-Aminosäuren in der folgenden Reihenfolge zugegeben wurden: t-BOC-£*-Beiizyloxycarbonyl-L-Lysin, T-BOC-L-Prolin, t-BOC-*-Ben zyl-L-Threonin, t-BOC-O-Benzyl-L-Tyrosin, t-BOC-L-Phenylalanin, t-BOC-L-Phenylalamin, t-BOC-Glyzin und t-BOC-0-Mtro-L-Arginin. Dies ergab ΐ-Β00-*>-Β'ίΐΓθ-Ιι-Α^ίην1-&^ον1-Ιι-Ρ1ιβηνΐ3ΐ3ην1-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L-Tyrosyl-O-Benzyl-L-Threonyl-L-Prolyl-fc-Benzyloxykarbonyl-L-Lysyl-L-Alanylharz. Das auf diese Weise erhaltene Peptidharz wurde mit wasserfreiem Wasserstofffluorid, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wurde. Das von dem Harz befreite Peptid wurde dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt und ergab das gewünschte Produkt in der Form von Pulver i.e. L-Arginyl-Glyzyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-L-Tyrosyl-L-Threonyl-L-Prolyl-L-Alanin. Das Produkt wurde einerPapierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei 4,8 pH und einer Farbreaktion mit Ninhydrin nach dem Verfahren von Pauli und Sakaguchi unterworfen. Es wurde dabei nur ein einzelner Fleck gefunden. Die Aminosäureanalyse des Produkts (in 6n Chlorwasserstoffsäure bei 105⁰C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert) ergab die folgenden Werte: 0,84 (1) für Lysin, 0,83 (1) für Arginin, 0,85 (1) für Threonin, 0,77 (D für Prolin, 1,07 Ü) für Glyzin, 1,00 (1) für Alanin, 0,66 (1) für Tyrosin, und 1,92 (2) für Phenylalanin. (Die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben.)

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Tabelle 2

Stufe

Reagenz

.Menge an Reagens Einwirkung von Ult ra s challwe11en in Min.

Anzahl der Behandlungen

Entblockieren

Gew.^ige Lösung
von Trifluoressigt

10 ml

098-	Waschen	säure in Methylen chlorid	10	ml
O -s,	Neutralisieren	Methylenchlorid	10	ml
1GIi	Waschen	Äthylalkohol - Methylenchlorid	10	ml
co	Peptid-bildende	Methylenchlorid	10	ml
	Reaktion	Γ t-BOC-Aminosäure	0,1'	1 g
	Waschen	4 Dicyclohexylcarbo- (^ diimid	10	ml
	Waschen	Methylenchlorid	10	ml
	Waschen	Methylalkohol	10	ml
	Methylenchlorid·

;j

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids durch Kupplung einer Aminosäure oder eines Oligomeren von dieser mit

. einer Aminosäure oder Oligomeren von dieser, welches an ein Harz gebunden ist, wobei ein Peptid auf-dem Harz gebildet wird, Abspalten des Peptids von dem Harz und anschließende Extraktion des Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-bildende Reaktion unter Einwirkung von Ultraschallwellen durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, . daß Ultraschallwellen mit einer Frequenz von etwa 18 bis 22 kc/Sek.,. vorzugsweise etwa 20 kc/Sek.,. angewendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-bildende Reaktion und Extraktion des Peptids unter Einwirkung von Ultraschallwellen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, ·,_ .. daß Ultraschallwellen dafür mit einer Frequenz Von etwa 18 bis 22 kc.Sek. angewendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-bildende Reaktion und wenigstens eine der Vorbehandlungs- und Na chbehandlungs stufen für die· Peptid- bildenden Reaktion unter Einwirkung von Ultraschallwellen durchgeführt werden. ·

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