DE2047413A1 - Ein neues Verfahren zur Peptidsynthese - Google Patents

Description

Ein neues Verfahren zur Peptidsynthese

Es ist bekannt, Peptide am festen·unlöslichen Träger zu synthetisieren und die Reagenzien der Kupplungen durch einfache Filtration abzutrennen. Es ist ferner bekannt, unvernetzte Polystyrole als lösliche Träger für die Peptidsynthese zu benutzen und die am Polystyrol verknüpfte wachsende Peptidkette durch Ausfällen von den niedermolekularen Reagenzien abzutrennen.

Bei der erstgenannten Methode können keine reinen Polypeptide erhalten werden, da am unlöslichen Träger Fehlsequenzen wachsen. Bei der zweiten Methode erschwert Koprezipitierung die Reinigung.

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein neues Verfahren der Synthese von Polypeptiden, das die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und gleichzeitig deren Vorteile bewahrt und vereinigt. Das neue Verfahren zur Peptidsynthese besteht darin, an die N-terminale oder vorzugsweise an die C-terminale Aminosäure eine makromolekulare Schutzgruppe zu binden. Die makromolekulare Schutzgruppe enthält funktioneile Gruppen, die eine Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln bewirken. Die Peptidsynthese kann somit in homogener Lösung ausgeführt werden.

Beansprucht wird die Verwendung höher molekularer Schutzgruppen, die auf Polykondensations- und Polymerisationsgrundlage beruhen und Funktionen mit Heteroatomen enthalten. Diese Funktionen können sauerstoffhaltig sein, wie bei de*i Äthergruppierungen von Polyäthylenglykolen, den Hydroxyl- ™

gruppen von Polyvinylalkoholen oder den Estergruppierungen von Polyacrylsäureestern. Die funktionellen Gruppierungen können auch stickstoffhaltig sein, wie die Aminogruppierung bei Polylysin. Außerdem können Funktionen mit mehreren Heteroatomen vorkommen, wie z. B. die Säureamidgruppierung O = CR₁ - NH - R₀. Neben diesen für die Löslichkeitseigenschaften wichtigen funktionellen Gruppen muß noch mindestens eine funktioneile Gruppierung vorhanden sein, welche die Verknüpfung der C- oder N-terminalen Aminosäure gestattet. Diese funktionelle Gruppe kann identisch sein mit der anderen funktionellen Gruppe, wie die Hydroxylgruppe in Polyvinylalkohol .öder sie kann

20981 4/1661

verschieden sein, wie die endständige Hydroxylgruppe in Polyäthylenglykol. Beansprucht werden insbesondere hochmolekulare Schutzgruppen, die zur Verknüpfung der ersten Aminosäure Hydroxyl-, Carboxyl- oder Aminogruppierungen enthalten.

Die makromolekulare Schutzgruppe verbleibt während der gesamten Peptidsynthese am wachsenden Peptid und bewirkt dessen Löslichkeit, sodaß die Synthese in homogener Phase vonstatten gehen kann. Beansprucht wird die Abtrennung der niedermolekularen Kupplungsreagenzien durch Dialyse von der durch die Schutzgruppe von vornherein hochmolekularen wachsenden Peptidkette. Die Wahl der semipermeablen Membran regelt die Molekulargröße der Schutzgruppe.

Alle bekannten Kupplungsreaktionen können bei dem neuen Verfahren benutzt werden. Auch für Fragmentkondensationen eignet sich dieses Verfahren.

Beispiele ;

1.) Synthese von H-Ile-Ala-iVal-Gly-rOH in nicht-wäsariger Lösung.

Veresterung am löslichen Träger: Als lösliches Polymer wurde Polyäthylenglykol, MG 20 000, verwendet. Die Veresterung wird mit BOC-geschütztem Glycin und 1, l'Carbonyldiimidazol als Kupplungskomponente durchgeführt.

Synthesezyklus: a) Darstellung des gemischten Anhydrids aus Isobutylchloroformat, Morpholin und BOC-geschützter Aminosäure, b) Zugabe des gemischten Anhydrids in 3-fachem Überschuß zur Aminokomponente (Polymerpeptid). c) Nach beendeter Kupplung: Abspaltung der Schutzgruppe durch 4 N HCL in Dioxan. d) Ab destillieren des Lösungsmittels und Aufnehmen in Wasser, e) Ultrafiltration der überschüssigen Komponenten und Abdestillieren des Wassers.

Umsatztest: Der Umsatz wird wie folgt bestimmt: Während der Kupplung werden dem Reaktionsgemisch aliquote Mengen entnommen und nach der Ninhydrinmethode analysiert. Die einzelnen Kupplungsschritte verliefen mit über 98 % Ausbeute. Auch die bei der Festkörpersynthese nur mit ca. 80 % verlaufende Kupplung von Alanin an Valin verlief mit über 95%iger Ausbeute.

20981 Ul 1 661

Abspaltung vom Träger und Isolierung: Die Abspaltung des Tetrapeptide vom Träger erfolgte in homogener Phase mit 0. 05 N NaOH. Das Tetrapeptid wird durch Ionenaustausch-Chromatographie an Dowex X-50 isoliert.

Ultrafiltration: Die Substanz wird in ca. 50 ml Wasser gelöst (ca. 2 %ige Lösung) und mit einem Membranfilter der MG-Grenze 1000 diafiltriert. Das Ultrafiltrat wird mit Ninhydrin solange auf Aminosäuren getestet, bis keine positive Reaktion mehr eintritt.

2. ) Synthese von H-Ile-Ala-Val-Gly-OH in wässriger Lösung.

Veresterung an Polyäthylenglykol MG 6000 wie bei Beispiel 1.). Synthesezyklus: a) Aminokomponente wird in wenig Wasser gelöst und mit einer Z-geschützten Aminosäure gekuppelt. Als Kupplungskomponente wird das wasserlösliche Carbodiimid N-cyclohexyl-N' -ß-(N-methylmorpholino)-aethylcorbodiimid p-toluolsulfonat benutzt. Kupplungskomponente und Z-Aminosäure werden in dreifachem Überschuß angewandt, b) Nach beendeter Kupplung wird zur wässrigen Lösung das gleiche Volumen Methanol zugegeben und mit Pd/Aktivkohle die Cbo-Schutzgruppe durch Hydrierung entfernt, c) Die überschüssigen Komponenten werden, wie in Beispiel 1.) beschrieben, durch Ultrafiltration entfernt.

209814/1661

Claims (3)

PATENTANSPRÜCHE

1. ) / Verfahren zur Synthese von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, / daß eine höher molekulare, polymere Schutzgruppe an die C-terminale oder N-terminale Aminosäure über Ester- oder Amidbindungen geknüpft wird, die weiteren Aminosäuren stufenweise in homogener Phase gekuppelt werden und die niedermolekularen Kupplungsreagenzien durch Dialyse bzw. Membranfiltration entfernt werden.

^ 2. ) Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die höher molekulare Schutzgruppe funktioneile Gruppen enthält, die Löslichkeit bewirken und die zur Kupplung der ersten Aminosäure notwendigen Funktionen enthält.

3. ) Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Molekulargröße der höher molekularen Schutzgruppe so bemessen wird, daß bei der benutzten semipermeablen Membran während der Dialysezeit weniger als 5 % des geschützten Peptides durch die Membran treten.

2098U/1661