DE2047413B2

DE2047413B2 - Verfahren zur Herstellung von Peptid en in homogener Phase

Info

Publication number: DE2047413B2
Application number: DE2047413A
Authority: DE
Inventors: Ernst Prof. Dr. 7400 Tuebingen Bayer; Dieter Dr. Birsfelden Gillessen; Hans Dr. Riehen Kuenzi
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1970-09-26
Filing date: 1970-09-26
Publication date: 1979-09-06
Also published as: CH567458A5; DE2047413C3; SU454736A3; US3772264A; IL37698A; FR2108520A5; NL7113179A; BE773013A; IL37698A0; SE398347B; DE2047413A1; GB1310656A; CA1000271A

Description

Durch die Anwendung unlöslicher, poiymerer träger ist die Peptidsynthese vereinfacht worden, da die löslichen, überschüssigen Reagentien durch Filtration entfernt werden können. Die Kupplungsreaktionen verlaufen jedoch meist nicht vollständig, und so können Fehlsequenzen entstehen, die sich vom gewünschten Endprodukt schwer oder nicht mehr abtrennen lassen. Außerdem erlaubt die Synthese am unlöslichen Träger weniger Variationen von Lösungsmittel, Schutzgruppen und Kupplungsmethoden als die Peptidsynthese in Lösung. Auch durch Verwendung von festen Trägern mit geordneter Oberfläche (»Bürstenträgern«) oder von unvernetzten Polystyrolen konnte man diese Schwierigkeiten reicht völlig umgehen.

So wurde z. B. von Schemjakin et al. (vgl. H.-D. Jakubke, H. Jeschkeit, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Akademie-Verlag Berlin, 1969, Seiten 179-180) ein polymerer, in organischen Lösungsmitteln löslicher Träger ills Alternative zur Merrifield-Technik entwikkelt Nach Ansicht dieser Autoren sollten dadurch einige Mängel der Festphasenpeptidsynthese, wie z. B. die unvollständigen Umsetzungen in heterogener Phase, ausgeschaltet werden. Als löslicher Träger diente ein durch Emulsionspolymerisation erhaltenes Polystyrol mit einem Molekulargewicht von 200 000. In bekannter Weise wird das Harz chlormethyliert und mit C-terminaler teirt-Butyloxycarbonyl-aminosäure verestert Die stufenweise Kettenverlängerung vom C-terminalen Ende erfolgte durch Umsetzung mit den entsprechenden tert-Butyloxycarbonylaminosäure-N-hydroxysuccinimideslern. Überschüssige Reagenzien und Nebenpro· dukte werden nach jeder Kupplungsreaktion dadurch abgetrennt, daß man die Reaktionsmischung z. B. mit Wasser verdünnt und das am wasserunlöslichen Träger gebundene Peptid abfiltriert Nicht umgesetzte tert-Butyloxycarbonylaminosäure-N-hydroxysuccinimidester und Nebenprodukte bleiben in Lösung.

Aber auch dieses Verfahren weist verschiedene Mängel auf. Einmal resultieren aus der strukturellen Inhomogenität des Aminoacyl- Polystyrols Ausbeuteverluste, die sich durch die Ausfällungsoperationen mit Wasser erhöhen. Erfahrungsgemäß verbleiben Teile des mit dem Peptid beladenen Trägers in Lösung, während sich andererseits mit dem Kettenwachstum weiterhin die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln vermindert

Erfindungsgemäß wurde jetzt ein Verfahren ausgearbeitet, das sowohl in homogener Phase arbeitet als auch eine sichere und einfache Abtrennung der Reagentien von der wachsenden Peptidkette gestattet Dabei wird an die C-terminale Aminocarbonsäure eine löslichmachende Polyäthylenglykol(PÄG)-Gruppe esterartig gebunden, die während der gesamten Synthese dort verbleibt Sowohl die erste Aminosäure als auch die folgenden Aminosäuren können in homogener Lösung gekuppelt werden.

Der entscheidende zweite Schritt des Verfahrens, die

Abtrennung der niedermolekularen Reagentien von der durch den Träger von vornherein hochmolekularen, wachsenden Peptidkette, geschieht nun dur»h·Ultrafiltration (Membranfiltration), die in ihrer modernen Ausführung schnelle Trennungen ermöglicht

Die Synthesemethode bietet folgende Vorteile und Möglichkeiten: Durchführung der Synthese und Abtrennen der überschüssigen Reagentien in homogener Phase ohne die zeitraubenden Trennungen der »klassischen« Peptidsynthese und die vielfältigen Waschvorgänge der

?ί Festkörpermethode: Steigerung der Ausbeute gegenüber dem Arbeiten in heterogener Phase; Anwendung aller bekannten Schutzgruppen und Kupplungsmethoden; vielfältige Variationsmöglichkeiten der Polyäthylenglykol-Trägergruppen bezüglich Molekulargewicht und Löslichkeitseigenschaften; Möglichkeiten der Abtrennung von Rumpfsequenzen bei jedem schlecht verlaufenden Kupplungsschritt; vereinfachte Umsatzkontrolle in aliquoten Anteilen (besonders geeignet sind ^I9F-Kernresonanz- und Radioaktivitätsmessungen); Möglichkeit der Wiederholung eines Kupplungsschrittes nach einer beliebigen anderen Methode bei unbefriedigenden Ausbeuten; Möglichkeit der Kondensation größerer, mit dem makromolekularen Träger versehener Peptide; Möglichkeit der Automatisierung einschließlich der Umsatzkontrolle.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden in homogener Phase durch Kupplung einer über Esterbindungen an einen hochmolekularen Träger gebundenen C-terminalen Aminocarbonsäure

-)5 mit Aminocarbonsäure-Derivaten ist dadurch gekennzeichnet, daß man die C-terminale Aminocarbonsäure mit Polyäthylenglykolen verestert, die Kupplung mit den weiteren Aminosäuren in an sich bekannter Weise durchführt und die niedermolekulare.^ Aminocarbonsäure-Derivate und Kupplungsreagenzien durch Dialyse S)LW, Membranfiltration abtrennt

Die Herstellung de» Ausgangsmaterials für das erfindungsgemäße Verfahren, d.h. des mit einer C-terminalen Aminocarbonsäure esterartig verknüpften Polyäthylenglykols kann in an sich bekannter Weise geschehen. So kann man eine an der Aminogruppe geschützte C-terminale Aminocarbonsäure mit einem Polyäthylenglykol unter Anwendung bekannter Methoden der Peptidchemie verestern und danach die

M) Amjnoschutzgruppe abspalten,

Die Kupplung der Aminosäuren erfolgt nach bekannten Methoden (siehe z. B. Schröder-Lübke, The Peptides, New York, 1967).
Nach erfolgter Kupplung werden die niedermolekula-

<>5 ren Aminocarbonsäure-Derivate und Kupplungsreagenzien durch Dialyse bzw. Membranfiltration abgetrennt. Um optimale Trennbedingungen zu erhalten, verwendet man vorteilhafterweise als Ausgangsmate-

j Vi,!

rial Polyäthylenglykole mit Molekulargewichten von 10 000 bis 100000.

Die Trennverfahren als solche können in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Es können die handelsüblichen Membranen verwendet werden, deren Porengröße nach dem Molekulargewicht des zur Synthese verwendeten Polyäthylenglykols ausgewählt wird. Beispielsweise können bei der Verwendung eines Polymers vom Molekulargewicht 20000 bis 100 000 Membranen mit einer Durchlässigkeit bis zu 10000 eingesetzt werden.

Die abschließende Abspaltung des Peptids vom Träger kann durch Behandlung mit Basen, z. B. verdünnten Alkalihydroxidlösungen, mit verdünnten: Säuren, z. B. verdünnten Mineralsäuren, oder durch. Aminolyse, z.B. durch Behandlung mit Ammoniak in: einem organischen Lösungsmittel, erfolgen.

Beispiel 1

a) Veresterung von BOC-VaI-OH mit PÄG
(MG 20 000)

20 g PÄG (MG 20000), 434g BOC-VaI-OH und 4,12 g DCC werden in 200 ml CH₂Q₂ gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit während 5^!/z Tagen geführt Das ReäktionsgcffiiäCii wird L V. zur Trockne eingedampft mit 100 ml 4N HCl/Dioxan versetzt und bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und wiederum LV. zur Trockne eingedampfL Der Rückstand wird in ca. 1 Liter H₂O aufgenommen und ar dabei entstehende Niederschlag; mit Hilfe eines Filtrierhilfcjnittek abgetrennt Das; Filtrat wird mit NaOH oder Triäthylamin auf pH6i gestellt und durch ein Ultrafilter fixiert, bis in der· zurückbleibenden Lösung kein freies Valin mehr nachgewiesen werden kann. Der Rückstand aus der Ultrafiltration wird L V. zur Trockne eingedampft mil; Hilfe von Benzol/abs. Äthanol (80/20) nachgetrocknet und über Nacht im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet

Ausbeute: 1935 g H - VaI - PÄG.
Beladung: 80% resp.0,08 mM/g (Aminosäureanalyse)

b) Peptidsynthese

5 g H - VaI - PÄG werden in 50 ml CH₂Cb gelöst und mit 0,1 ml Triäthylamin versetzt Nach Zugabe von 0,44 g BOC-GIy-OH (23 mM) und 0315 g DCC (23 mM) wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt danach LV. zur Trockne eingedampft, während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 40 ml 4N HCl/Dioxan behandelt und erneut L V. zur Trockne eingedampft Der ölige Rückstand wird in 500 bis 700 ml H₂O aufgenommen. Nach Abtrennung des entstehenden Niederschlags wird das Filtrat mit NaOH oder Triäthylamin auf pH 6 gestellt und durch ein Ultrafilter nitriert Der Rückstand aus der Ultrafiltration wird LV. zur Trockne eingedampft mit Hilfe von Benzol/abs. Äthanol (80/20]i nachgetrocknet und Ober Nacht im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet

Ausbeute: 435 g H - GIy - VaI - PÄG.

Genau in der eben beschriebenen Weise wird H-GIy-VaI-PÄG zuerst mit Triäthylamin versetzt und dann mit 23 mM BOC - AIa - OH und 23 mM DCC zur Reaktion gebracht Nach Abspaltung der Schutzgruppe und Ultrafiltration erhält man 4,75 g H-Ala-GIy-VaI-PÄG. Durch entsprechendes Umsetzen von H-Ala-GIy-VaI-PÄG mit BOC-Leu-OH und DCC wird

H-Leu-Ala-Gly-Val-PÄG (43g) erhalten. Die ^r) Aminosäureanalyse einer hydrolysierten Probe dieser Substanz zeigt folgendes Aminosäureverhältnis:

VaI: GIy: AIa : Leu = 1,08:1,00:0,90:1,04

c) Abspaltung des Tetrapeptide vom Träger

Eine Lösung von 4,0 g

H-Leu-Ala-Gly-Val-PÄG in 75ml H₂O und 13 ml IN KOH wird während 2 Stunden bei Ra'jmtemperatur gerührt Mit 13 ml IN HCl wird genau

i^ri neutralisiert und durch ein Ultrafilter filtriert bis 33 Liter Filtrat gesammelt sind. Das Filtrat liefert nach dem Eindampfen i.V. 280mg rohes Produkt das durch Digerieren mit abs. Methanol teilweise von NaCl befreit wird. Die Methanol-Phase wird mit Kohle entfärbt filtriert und zur Trockne eingedampfL Der Rückstand wird in K₂O aufgenommen und lyophiiisiert Man erhält 1913 mg rohes Tetrapeptid, das gemäß Aminosäureanalyse folgendes Aminosäureverhältnis zeigt:

VaI: GIy: AIa: Leu - 1,03:1,00:035:1,07

Der Peptidanieü im rohen Teirapepüd üeträgt 35% (Aminosäureanalyse), d.h. bezogen auf die erste Aminosäure (VaI) beträgt die Totalausbeute 45%.
Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit

jo authentischem H—Lcu-Ala-Gly—Val—OH (nach der Merrifield-Methode hergestellt) verhält sich das Produkt identisch. R_f in Butanol/Essigsäure/Wasser Äthylacetat 1/1/1/1: 032; Rf in Butanol/Essigsäure/ Wasser 4/1/1: 036; Rf in Butanol/Essigsäure/Wasser/

J5 Pyridin 15/3/12/10:0,45.

Beispiel 2

a) Zu 434 g BOC-VaI-OH und £8 ml Triäthylamin in 80 ml CH₂Cl₂ werden tropfenweise tinier Rühren bei -5⁰C 1,91ml Chlorkohlensäureäthylester in 20 ml CH₂Cl₂ gegeben. Danach wird während 30 Minuten bei -5° C weitergerührt und dann eine gekühlte (-5"C) Lösung von 20 g PÄG (MG 20 000) und 2,4 g (20 mM) Dimethylaminopyridin in 100 ml CH₂Cl₂ zugegeben.

v-, Das Reaktionsgemisch wird während 1 Stunde bei -5° C und anschließend während 65 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Blockierung nicht reagierter OH-Funktionen wird das Reaktionsgemisch während 4 Stunden mit 1OmM Acetanhydrid und

->o 10 mM Triäthylamin bei Raumtemperatur gerührt und anschließend i.V. zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 ml 4N HCl/Dioxan behandelt LV. zur Trockne eingedampft und in ca. 1 Liter H₂O

v, aufgenommen. Nach Filtration und pH-Einstellung (vgl. Beispiel la) wird ultrafiltriert und aufgearbeitet

Ausbeute: 19 g H-VaI-PÄG.
Beladung: 60% resp. 0,06 mM/g (Aminosäureanalyse)

b) Ausgehend von 12,7 g H-VaI-PÄG wird das im Beispiel Ib beschriebene Tetrapeptid in der gleichen Weise synthetisiert Reagenzien: 1 mM Triäthylamin, 4,OmM BOC-Aminosäure, 4,OmM DCC. Man erhält 113g H-Leu-Ala-Gly-Val-PÄG, das folgendes Aminosäureverhältnis zeigt:

VaI: GIy: AIa : Leu - 0,88 :0,86:1,11 :1,00

c) Wie im Beispiel lc beschrieben, werden 10 g

H - Leu-Ala-GIy-VaI-PÄG in 100 ml H₂O und 3ml IN KOH hydrolysiert Nach Neutralisation, Ultrafiltration uind Aufarbeitung erhält man 300 mg s rohes Tetrapepttd, das folgendes Aminosäureverhältnis aufweist:

Val:G:y:Ala:Leu = 0,96:0,91 : 1,24:1,00

Der Peptidanteil im rohen Tetrapeptid beträgt 41% (Aminosäureanalyse), d.h. bezogen auf die erste Aminosäure (Valj beträgt die totalausbeute 57% d. Th.

Beispiel 3

6 g H - VaI - PÄG (80%, 0,5 mM VaI, VgL Beispiel 1 a) und 0,09 ml Triäthylamin (0,6 mM) gelöst in 60 ml CH₂Cl₂, werden mit 1,05 g BOC-GIy-ONP (3,5 mM) versetzt und während 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Nach dem Eindampfen L V. wird der Rückstand während 30 Minuten bei Raumtemperatur in 60 ml Trifiuoressigsäure/CHzCk (1 :1) gerührt und anschließend wieder LV. zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in ca. 700 ml H₂O aufgenommen, filtriert und das Fiitrat mit NaOH auf pH 6 gestellt ?"> Nach der Ultrafiltration wird wie im Beispiel Ib beschrieben aufgearbeitet

Ausbeute: 5,88 g H - GIy- VaI - PÄG.

In zu Beispiel Ib analoger Weise wird H-Gly-Val-PÄG zuerst mit BOC-AIa-ONP und entsprechend schließlich H-AIa- GIy - VaI - PÄG mit BOC-Leu-ONP behandelt Man erhält 5,6 g H-Leu-Ala-GIy-VaI-PÄG mit folgendem Aminosäureverhältnis:

b) 9,8 g H -GIy- PÄG werden im 60 ml CH₂Cl₂ gelöst und mit 0,7 mM N-Methylmorpholin neutralisiert In einem separaten Gefäß werden 3 mM BOC- Leu -OH in 5 ml CH₂Cl₂ und 1 ml Dimethylformamid gelöst mit 3 mM N-Methylrnorpholin neutralisiert, auf -2O⁰C gekühlt, mit 2,6 mM Isobutylchloroformat versetzt und während 10 Minuten bei —20⁰C gerührt Das gemischte Anhydrid wird dann bei - 20° C zur H - GIy - PÄG-Lösung gegeben und 1 Stunde bei — 20⁰C und 2 Stunden bei 4°C gerührt Anschließend wird das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 ml 1,2N HCl/Eisessig behandelt und erneut L V. zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in 100 ml H₂O aufgenommen, mit wäßriger Na-Acetatlösung auf pH 6 gestellt und durch ein Ultrafilter filtriert Das Rerentat wird LV. zur Trockne eingedampft zweimal mit Benzol azeotrop destilliert und im Exsikkator getrocknet

Ausbeute: 9,5 g H - Leu - Gr - PÄG.

Nach dem gleichen Verfahren werden anschließend die weiteren AS als folgende Derivate gekuppelt:
BOC-AIa-OH, BOC - (OBzI)-Thr-OH,
BOC-LeU-OH₁BOC-VaI-OH,
BOC(OBzi)-Thr-OH, BOC-VaI-OH.

Nach der letzten Kupplung werden 8,0 g H-Val-Thr-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-O-PÄG

30

VaI: GIy: AIa: Leu = 1,00:0,70:0,78 :0,71

5,6 g H — Leu—AIa—GIy—VaI — PÄG werden wie im Beispiel '.c beschrieben hydrolysiert und das abgespaltene Tetrapeptid entsprechend aufgearbeitet Man erhält 250 mg rohes Tetrapeptid mit folgendem Aminosäureverhältnis:

VaI: GIy: AIa: Leu = 1,00:0,83_:0,93:0,88

Der Peptidanteil im rohen Teirapeptid beträgt 32%, d. h. bezogen auf die erste Aminosäure (VaI) beträgt die Totalausbeute 50% d. Th.

Beispiel 4

a) 10 g PAG(MG 20 000), 1,75 g BOC-GIy-OH und 2,06 g DCC werden in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst und bei Raumtemperatur während 6 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wird i. V. zur Trockne eingedampft, mit 100 ml i.2 N HCl/Eisessig versetzt und bei Raumtemperatur während 20 Minuten gerührt.

Das Lösungsmittel wird i.V. a.bdestilliert, der Rückstand mit 100 ml H₂O versetzt und der entstehende Niederschlag abzentrifugiert. Der klare Überstand wird abdekantiert, mit Triäthylamin auf pH 6 gestellt und durch ein Ultrafilter filtriert, bis das Ultrafiltrat kein Glycin mehr enthält Das Retentat wird i.V. eingedampft und mit Benzol zweimal azeotrop destilliert, um Spuren von H₂O vollständig zu entfernen. Das Produkt wird im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Ausbeute: 9,8gH-GIy-PÄG
Beladung: 0,06 mM/g.

OBz!

OBzI

erhalten. Die Aminosäureanalyse einer hydrolysieren Probe dieser Substanz ergab folgende Werte:

GIy: Leu: AIa :Thr: VaI = 1,0:139:1,67 :1,0

Die Werte der einzelnen Aminosäuren ergaben sich aus den Ergebnissen der Aminosäurenanalysen der Zwischenstufen.

_4f| Beispiel 5

a) 20g PÄG (MG 20 000), 5,0g Z-Pro-OH und 4,2 g DCC werden in 200 ml CFI₂Cl₂ gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit während 13 Tagen gerührt Dem Reaktic.nsgemisch

•ι- werden 1,2 ml Eisessig zugesetzt und es wird nochmals während 20 Stunden gerührt Daraufhin wird die Reaktionsmischung L V. zur Trockne eingedampft in 300 m¹ MeOH gelöst mit 5 ml 4N HC1/MeOH und Pd/C versetzt und bei Raumtemperatur und Normaldruck

">() hydriert, bis kehl Wasserstoff mehr aufgenommen wird. Der Katalysator wird abfiltriert, das Fiitrat i.V. zur Trockne eingedampft, der Rückstand in ca. 1 Liter H₂O aufgenommen und der dabei entstandene Niederschlag abfiltriert Das Fiitrat wird ultrafiltriert und wie in

>"> Beispiel 1, Absatz (a)beschrieben weiterbehandelt.

Ausbeute: 19,3 g H - Pro - PÄG · HCI.
Beladung: 50% resp. 0,05 mM/g (Aminosäureanalyse).

W) b) 10g H-Pro-PÄG - HCl werden in einer Mischung aus 20 ml CH₂CH₂ und 4¹D ml Dimethylformamid gelöst, auf -30°C gekühlt und mit 0,07 ml Triäthylamin auf pH 8 gestellt
700 mg Pyrojrlu- His -N₂H₃ werden in einer Mi-

t>5 schung aus 10 ml Dimethylsulfoxidt 10 ml Dimethylformamid und 63 m) 2.4N HCI/Tetruhydrofuran bei 0⁰C gelöst, auf -20⁰C gekühlt, mit 0^5 ml Isoamylnitrit versetzt, 30 Minuten bei -20⁰C gerührt und durch

Zugabe von 2,1 ml Triäthylamin neutralisiert Diese Reaktionsmischung wird zur ebenfalls auf -3O⁰C gekühlten H-Pro-PÄO-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten unterhalb 0°C und 15 Stunden bei 4° C gerührt, L V. zur Trockne «!ingedampft, der Rückstand wird in ca. 1 Liter H₂O gelönt, mit einem Ultrafilter flltriert und aufgearbeitet

Ausbeute: 9,9 g Pyroglu - His - Pro - PÄG.
Die Substanz zeigt ein AminosflureverhBltnis von
Pro: GIu- 1,00:0,65.

Dieses Produkt wird in 50 ml CH₂CI₂ gelöst mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt, erneut der gleichen Reaktion mit 700 mg Pyroglu - His - N₂Hj unterworfen und wie vorher beschrieben aufgearbeitet.

Ausbeute: 9,5 g Pyroglu - His - Pro - PÄG. Dieses pTödüki Zeigt ein Amiiiüsäü! ever näiiliis VUII

Pro:GIu - 1,00:1,00.

c) 5,0 g Pyroglu - His - Pro - PÄG werden in einer Mischung aus 250 ml MeOH und 25 ml CH₂CI₂ gelöst.

Die Lösung wird mit trockenem NH₃ bei -5° C gesättigt wahrend 36 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt erneut bei -5° C gesattigt wahrend 4 Tagen bei Raumtemperatur aufbewahrt und LV. zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in MeOH gelöst nochmals zur Trockne eingedampft in 750 ml H₂O gelöst und über einen Ultrafilter filtriert Dazu wird die Lösung zunächst auf 250 ml konzentriert und anschließend mit 1,5 Liter H₂O diafiltriert Das Filtrat

in wird i. V. zur Trockne eingedampft der Rückstand in ca. 20 ml MeOH gelöst, mit Kohle behandelt nitriert, i. V. zur Trockne eingedampft in 100 ml H₂O gelöst und lyophylisiert. Ausbeute 210 mg rohes Pyroglu-His-Pro-NH₂. Das Material zeigt ein Amino-

i) säureverhältnis von Pro : His : GIu - 1,00 :037 :1,03. Der Peptidanteil im rohen Material beträgt 28% (Aminosäureanalyse), was einer Ausbeute von 63%, bezogen auf die erste Aminosäure (Prol entspricht. Das dünnschichtchromatografische Verhalten dieses Mate-

:ii rials entspricht demjenigen von rohem Pyroglu -His — Pm-NH₂, das auf klassischem Weg durch die gleiche Kupplung hergestellt wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur von Peptiden in homogener Phase durch Kupplung einer Ober Esterbindungen an einen hochmolekularen Träger gebundenen C-tenninalen Aminocarbonsäure mit Aminocarbonsäurc-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man die C-terminale Aminocarbonsäure mit Polylthylenglykolen verestert, in an sich bekannter Weise die Kupplung mit den weiteren Aminocarbonsäuren durchführt und die niedermolekularen Aminocarbonsäure-Derivate und Kupplungsreagenzien durch Dialyse bzw. Membranfiltration abtrennt

2. Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung mit Polyäthylenglykolen eines solchen Molekulargewichtes durchführt, daß bei der benutzten semipermeablen Membran während der Dialysezeit weniger als 5% des Peptids durch die Membran hindurchgehen.