DE1543575C

DE1543575C - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE1543575C
Application number: DE19661543575
Authority: DE
Inventors: Erich Dr. 8132 Tutzing Wünsch
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vormals Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt
Priority date: 1966-03-09
Filing date: 1966-03-09
Publication date: 1973-09-06

Description

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gekühlt wird. Sodann fügt man 1,36 mMol Dicyclo- Beispiel2

hexylcarbodiimid zu und läßt unter Rühren 1 Stunde _. _, ,, . „. _/XTTT . „ _T ,, . ,„ _ «

bei dieser Temperatur stehen. Anschließend läßt man Pht-Phe-Val-Glu-(NH₂)-Try-Leu-Met-Asp(OtBu)-

das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über lnr-Otöu . . .

Nacht stehen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff 5 _a) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren,

wird abgesaugt, das Lösungsmittel im Vakuum ein- b) nach dem bisher üblichen Carbodiimid-Verfahren,

gedampft und der Rückstand in Essigester auf- c) nach dem Azidverfahren.

genommen. Die Essigesterlösung wird mit Wasser,

0,5 η-Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencärbonat- „ . a) 2,49 g Pht-Phe-Val-Glu-(NH₂)-Try-Leu-OH, 1,43 g

lösung und Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat ίο H-Met-Asp-(ÖtBu)-Thr-OtBu und 345 mg N-Hydroxy-

getrocknet. Beim Eindampfen im Vakkum hinterbleibt succinimid in 20 ecm Dimethylformamid werden bei

ein Öl. Ausbeute 90%. , ... -1O⁰C mit 619 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.

Zur Charakterisierung wird die tertButylestergruppe "Man rührt, 2 Stunden bei dieser Temperatur, läßt durch. Stehenlassen in wasserfreier Trifluoressigsäure weitere 48 Stunden bei —3°C stehen und filtriert vom abgespalten, worauf eingedampft und Äther nach- 15 ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das auf Zudestilliert wird. Beim Anreiben mit Petroläther kristal- satz von 100 cm Wasser sich abscheidende Produkt lisiert die Verbindung. F = 180 bis 181 ° C in Überein- wird nach kurzer Zeit fest. Man filtriert ab, wäscht mit Stimmung mit der Literatur. Ausbeute 94%· lOprozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung, 0,1 n-

Zur Prüfung auf Racemisierung wurde das gas- ^Salzsäure und Wasser und trocknet über Phosphorchromatographische Racemisierungstest nach F. W e y- so pentoxydimVakuum.F = 225 bis 226° C (Zersetzung), g a η d und Mitarbeiter angewandt (vergleiche Angew. ^; Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt h\ Chemie, 75,282 [1963], und Rec. trav.. chim. Pays-Bas, ;(3,62 g) in Chloroform/n-Butanol (3:1) aufgenommen, 84, 213 [1965]). ^;die erhaltene Lösung mit lOprozentiger Natrium-" iiierbei wird Z-Leu-Phe-VaI-OtBu der Partial- hydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und hydrolyse in 8,5 n-methänolischer Salzsäure unter-«25 "über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen der worfen, worauf N-trifluoracetyliert wird; Die ari- ""Lösungsmittel im Vakuum wird der verbleibende Rückschließende gaschromatographische Trennung zeigt, stand aus Äthanol—Wasser umgefällt: Blaßgelbes ob der Verknüpfung von Z-Leu-Phe mit VaI-OtBu eine Pulver von F = 226 bis 227 ⁰C (Zersetzung), [oc]f: Racemisierung im Phenylalanin eingetreten ist: —31,8 ± 1° bzw. [oc]f°₆: —39° (c = 1,0, in Dimethyl-

% c .u 1, η j · · ·λ 3o formamid), Ausbeute 2,90 g (75 %).

a) Synthese ohne Hydroxysuccimmidzusatz:

5 bis 6% Racemisierung, C₆₅H₈₉N₁₁O₁₄S (1280,6)

b) Synthese mit Hydroxysuccimmidzusatz: weniger Berechnet ... C 60,97, H 7,01, N 12,03, S 2,50; als 1 % Racemisierung. gefunden ... C 60,78, H 6,87, N 11,99, S 2,41.

Aminosäure-Analyse
Phe VaI GIu Try Leu Met Asp Thr HN₂

Berechnet ...11 11 1 1 1 12

gefunden ... 1,00 0,99 1,00 — 1,02 1,02 0,99 0,98 2

^ b) Zur Suspension von 1,64 g Pht-Phe-VaI-GIu- bei —5°C vorsichtig mit 5 ecm 2m-Salzsäure ver-

J (NH^Try-Leu-OH und 953 mg H-Met-Asp-(OtBu)- setzt, mit 40 ecm Essigester überzüchtet und nach Thr-OtBu in 50 ecm Acetonitril gibt man unter Rühren 45 Abkühlen auf —10⁰C wie üblich tropfenweise mit bei Raumtemperatur bis zur völligen Lösung Di- 0,22 g Natriumnitrit in 3 ecm Wasser in das Azid übermethylformamid. Man kühlt auf —10⁰C ab und. geführt. Nach 5 Min. wird die Essigesterphase auf versetzt mit 413 mg Dicyclohexylcarbodiimid, rührt Zugabe von 20 ecm Wasser abgetrennt, mit Natriumweiter Senftleben hydrogencarbonatlösung und wenig Wasser gewa-1 Std. bei —5°C und läßt 48 Std. in der Kühltruhe 50 sehen (alle Operationen bei 0⁰C), über Magnesiumbei —10⁰C stehen. Das Filtrat wird im Vakuum einge- sulfat getrocknet und schließlich mit einer auf —10⁰C dampft, der erhaltene Rückstand mit Essigester dige- vorgekühlten Lösung von 1,0 g H-Met-Asp(OtBu)-riert und schließlich aus Äthanol/Wasser umgefällt. Thr-OtBu in 10 ecm Essigester vereinigt. Nach Blaßgelbes Pulver vom Zers.-P. 198 bis 200⁰C. Bei 48 Std. Stehenlassen bei 0⁰C filtriert man das ausfraktionierter Fällung aus Äthanol/Wasser erhält man 55 gefallene voluminöse Produkt ab. Nach Waschen mit als letzte Fraktion ein gelbliches Pulver: Zers.-P. 223 Essigester und Trocknen bei 60°C/0,03 Torr über bis 224°C, [<x]f: —34,0 ± 2⁰C bzw. [oc]f_M: —42,0⁰C Phosphorpentoxyd hellbeige Substanz, die mit 5 ecm (c = 1,0, in Dimethylformamid), Ausbeute 0,8 g (31 % absol. Äthanol ausgekocht wird: F = 222 bis 225⁰C (c = 1,0, in Dimethylformamid), Ausbeute 0,8 g (Zers.). Das so erhaltene Rohprodukt wird aus 30 ecm (31%). 60 absol. Äthanol umgefällt und wie oben getrocknet:

fast farbloses Pulver von F = 224 bis 225° C (Zers.).

C₆₅H₈₉N₁₁O₁₄S (1280,6) [«]£: -31,1 ± I⁰C (c = 1, in Dimethylformamid).

Ausbeute 0,82 g (31 % bez. auf eingesetzte Amino-Berechnet C 60,87, H 7,01, N 12,03, S 2,50; komponente),

gefunden ... C 60,86, H 7,20, N 12,08, S 2,40. ₆*

⁵ C₆₅H₈₉N₁₁O₁₄S (1280,6)

c) 2,70 g Pht-Phe-Val-Glu-(NH₂)-Try-Leu-hydra- Berechnet ... C 60,97, H 7,01, N 12,03, S 2,50,

zid-hydrochlorid in 20 ecm Dimethylformamid werden gefunden ... C 60,95, H 7,25, N 12,05, S 2,60.

	5	VaI	1 543 575	Met	Asp	6	Thr	NH₃
		1		1	1		1	2
	Phe	0,96	Aminosäure-Analyse:	1,02	1,02	0,96	2,03
	1	GIu Trp Leu
Berechnet ..	0,98	111
gefunden ...		1,04 — 1,04

Beispiel3 ^?: formamid nachgewaschen. Nach Abdampfen des Lö-

sungsmittels im Vakuum wird der Rückstand nach-

_{αο eina} ^B _{nder in Äth Essi ter und Wasser di iert}

pCJigg .^ _{dem jeweili} Lösungsmittel nachgewaschen und

Asp(OtBU)-Phe-Val-OtBu-dihydrobrom_ld anschließend aus Dimethylformamid/Wasser und Di-

a) 600 mg (0,44 mMol) Z-Asp-(0tBu)-Tyr-(tBu> methylformamid/Essigester umgefällt. Fp. 230° C. Ser-(tBu)-Lys-(BOC)-Tyr-Leu-Asp-(OtBu) und 600 mg

(0,415 mMol) H-SeKtBu)-ATg-ATg-AIa-GIu-(NHj₁)- 15 Ausbeute 970 mg = 88 % der Theorie (Th. 1,10), Asp-(OtBu)-Phe-Val-OtBu-dihydrobromid sowie 55 mg CHR Butanol/Eisessig/Wasser (6: 2: 2),

(0,48 mMol) Hydroxy-succinimid werden in 10 ml CHR Propanol/Essigester/Wasser (7:1: 2),

Dimethylformamid gelöst, auf —15 ⁰C abgekühlt und CHR Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35: 35 : 30),

dann 100 mg (0,48 mMol) N^'-Dicyclohexylcarbo-

diimid dazugegeben. Die Reaktionslösung wird 24 αο C₁₂₃H₁₉₅N₂₃O₃₁Br₂ (2651,929) Stunden bei -5°C bis 0°C gerührt das ausgefallene Berechnet ... C 55,71, H 7,41, N 12,15, Br 6,03;

Reaktionsprodukt mit weiteren 15 ml Dimethyl- _gefunden ... C 56,01, H 7,60, N 11,86, Br 5,66. r

formamid in Losung gebracht und 24 Stunden bei (

Raumtemperatur gerührt. Nun wird auf —10° C ab- b) Der gleiche Ansatz wie oben, jedoch ohne Zusatz

gekühlt, vom ausgefallenen Ν,Ν'-Dicyclohexylharn- 25 von Hydroxysuccinimid liefert 650 mg Rohprodukt stoff (110 mg) abgenutscht und mit eiskaltem Dimethyl- mit 15 ± 5 °/₀ Acylharnstoff.

Claims

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solche Peptide verstanden, die sich von den Gliedern

Patentanspruch: einer derartigen Gruppe von Aminosäuren ableiten.

Als Acylreste der acylierten Aminosäuren bzw.

Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Peptide kommen aliphatische Acylreste, wie der

Umsetzung von N-Acyl-aminosäure- bzw. N-Acyl- 5 Formyl- oder Acetylrest, aromatische Acylreste, wie

peptidderivaten mit einer freien Carboxylgruppe der Benzoylrest uiid die in der Peptidchemie üblicher-

mit Aminosäure- bzw. Peptid-derivaten mit einer weise verwendeten Acylreste, wie der Carbobenzoxy-

freien Aminogruppe in Gegenwart eines peptid- rest, der tert.-Butyloxycarbonyl-, Phthalyl- oder der

bildenden Reagens, dadurch gekenn- 2-Nitrophenylsulfenylrest in Frage. ,

ζ e i c h η e t, daß man die Umsetzung in Gegen- ίο Als Aminosäure- oder Peptidderivate mit einer

wart von N-Acyl-hydroxylaminen durchführt. freien Aminogruppe werden insbesondere Amino-'

' '". ■ säure- oder Peptidester von niederen aliphatischen

. Alkoholen, wie der Methyl-, Äthyl- oder tert.-Butyl-

·. ester, ferner Benzylester einschließlich. »Merrifield-

15 Ester« (vergleiche z.B. Biochemistry, Bd. 3 [1964] S. 1385) oder andere carboxyl-geschützte Aminosäuren- bzw. Peptid-derivate, wie z. B. Amide, ver-

Bei der Verknüpfung von N-acylierten Peptiden mit wendet.

carboxylendständiger optisch-aktiver Aminosäure tritt Die in den als Ausgangsstoffe verwendeten Peptid-

bei fast allen Verfahren mehr oder minder Racemisie- 20 derivaten noch vorhandenen funktioneilen Gruppen,

rung an dieser Aminosäure ein. Eine Ausnahme allein die nicht zur Peptidbindung benötigt werden, können

macht die Azidmethode, die jedoch relativ kompliziert gegebenenfalls die jeweils geeigneten Schutzgruppen

in ihrer Ausführung ist und oft, vor allem bei der tragen, wie beispielsweise den Methyl-, Äthyl-, tert.- (..(*

Verknüpfung höherer Peptide, auf Grund einer Azid- Butyl-, Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenyl-

Isocyanat-Umlagerung zu Nebenreaktionen neigt. 25 methylrest oder auch einen der obengenannten Acyl-

Dem anwendungstechnisch einfacheren und meist- reste, falls es sich bei den funktionellen Gruppen um

gebrauchten Carbodiimid-Verfahren hängt obenge- Aminogruppen handelt. -

nannter Nachteil der Racemisierung und der leicht- Als peptidbildende Reagenzien kommen vorzugsverlaufenden Bildung von Nebenprodukten (ins- weise in Frage: Carbodiimide, insbesondere Dicyclobesondere von N-Acyl-Harnstoffen) an, wodurch 3° hexylcarbodiimid, Inamine, wie l-Dimethylaminogleichzeitig die Ausbeute am gewünschten Produkt propin-1, ferner Ketenimine, N,N-Dialkylcyanamide, gemindert wird. Isoxazolium-Salze (z. B. Woodward-Reagenz).

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Als N-Acylhydroxylamine werden Hydroxamsäuren Peptiden durch Umsetzung von N-Acyl-aminosäure- der Typen N-Acyl-NHOH, N-Acyl-N-alkyl-NOH und bzw. N-Acyl-peptid-derivaten mit einer freien Carb- 35 Ν,Ν-Di-acyl-NOH, vorzugsweise N-Hydroxysuccinoxylgruppe mit Aminosäure- bzw. Peptid-derivaten imid und N-Hydroxy-phthalimid, verwendet,
einer freien Aminogruppe in Gegenwart eines peptid- Die Kondensation nach dem erfindungsgemäßen bildenden Reagens gefunden, das dadurch gekenn- Verfahren wird unter den zur Peptidkondensationen zeichnet ist, daß man die Umsetzung in Gegenwart üblichen Reaktionsbedingungen durchgeführt. So von N-Acyl-hydroxylaminen durchführt. 4° wird zweckmäßig in Gegenwart von indifferenten Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wird über- organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Tetraraschenderweise. der Racemisierungsgrad erheblich hydrofuran, Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, gesenkt, obwohl keine besonderen Vorsichtsmaß- Hexamethylphosphorsäure-tris-amid und Mischungen regeln, z.B. Abwesenheit. von tert. Basen-Salzen, zu dieser Lösungsmittel gearbeitet. Die Reaktionstempe- Γ/> beachten sind, sondern die bei Peptidkondensationen 45 raturen liegen zwischen —25 und +25⁰C, vorzugsüblichen Reaktionsbedingungen eingehalten werden. weise zwischen—20 und+15⁰C.
Diese starke Verminderung der Racemisierung der Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren heroptisch aktiven Aminosäure gegenüber den bisher stellbaren Peptide sind wertvolle Heilmittel oder bekannten Peptidsynthesen war in keiner Weise vor- können als Zwischenprodukte zur Herstellung von auszusehen und bringt außerdem den entscheidenden 50 Heilmitteln verwendet werden.

Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens mit sich. Durch die nachstehenden Beispiele wird die Erfin-

Die erfindungsgemäße Peptidherstellung unter Ver- dung näher erläutert. Alle eingesetzten Aminosäuren

Wendung von N-Acyl-hydroxylaminen hat jedoch gehören der L-Reihe an.

noch weitere Vorteile; die Ausbeuten an dem ge- Außer den in der Peptidchemie üblichen Abkürzun-

wünschten Kondensationsprodukt werden in vielen 55 gen für die einzelnen Aminosäuren wurden folgende

Fällen erheblich gesteigert. Werden Carbodiimide, Abkürzungen gebraucht:

insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid als peptid- _ „ , , / „ ■ 1 ■ ' · ■*

bildendes Reagens verwendet, so wird die Bildung von ^{Z =} Carbobenzoxy-(=Benzyl-oxy-carbonyl-),

N-Acylharnstoffen fast völlig unterdrückt. ^BOC = tert.-Biityl-oxycarbonyl-,

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als 60 ^^nt ~~ Pntalyl,

Ausgangsstoffe eingesetzten Aminosäuren sind solche *"^{u = tert}-^Buty··
Aminosäuren, die Bausteine für Peptide darstellen.

Hierzu gehören Alanin, Phenylalanin, Arginin, Äspa- Beispiel 1
raginsäure. Asparagin, Cystein, Cystin, Glutamin-

säure, Glutamin, Methionin, Glycin, Histidin, Leucin, 6₅ Z-Leu-Pne-Val-DtBu

Isoleucin, Norleucin, Lysin, Ornithin, Prolin, Oxy- Je 1 mMol Z-Leu-Phe-OH und H-VaI-OtBu sowie

pyrolin, Serin, Tyrosin, Valin, Tryptophan und 2 mMol N-Hydroxysuccinimid werden in 25 ml abso-

Threonin. Unter dem Ausdruck Peptide werden lutem Tetrahydrofuran gelöst, worauf auf —25°C ab-