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Verfahren zur Herstellung von Peptiden Es ist aus Fed. Proc. 21 (1962),
Seite 412, J. Aber. chem.
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Soc. 85 (1963), Seite 2149 und Biochemistry 8 (1965), Seite 2394 bekannt,
Peptide durch Ankondensation einzelner N-geschützter Aminosäuren nach der sogenannten
Festkörpersynthese herzustellen. Diose Reaktionen verlaufen bekanntlich ohne Racemiserung,
wenn als N-Schutzgruppen solche vonr Urethantyp, wie die tert.-Butyloxycarbonyl-
oder die p-methoxybenzyloxycarbonyl-gruppe verwendet werden. Verläuft hierbei nicht
jede einzelne Kondensationsstufe mit quantitativer Ausbeute, so werden neben dem
gewünschten Peptid auch andere1 unerwünschte Peptide gebildet, deren Abtrennung
von dem Hauptprodukt Schwierigkeiten bieten kann.
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Es t weiterhin aus Chem. Ber. 99 (1966), Seite 110 und Z.
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Natuaforschg. 21 b (1966), Seite 426 bekannt, Peptide mit Eilfe von
Dicyclohexyl-carbodiimid in Anwesenheit von N-Hydroxysuecinimid herzustellen. Bei
diesem Verfahren wird gine @@@@ dea @usa@z von N-Hydroxysuccinimid eintretende @@@@@@@@ierung
verhindert.
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Diece verfahren ist auch Gegenstand der Patentanmeldung F 48 611 @@@/@@
q (Fw 5020).
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Die Kondensation von N-geschützten Peptid-derivaten und Arninosäure-
bzw. Peptidderivaten mit einer freien Aminogruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid in
Dimethylformid (siehe oben zitierte Literatur) in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid
verläuft Jedoch nicht racemisierungsfrei, wenn sie auf die Festkörpersynthese, die
bisher lediglich nit N-geschützten Aminosäuren durchgeführt wurde, angewendet wird,
oder wenn nach der Festkörpersynthese Aminosäuren ankondensiert werden, deren N-Schutzgruppe
die Racemisierung nicht verhindert.
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So war bei der Kondensation von p-Methoxy-benzyloxycarbonyl L-leucyl-L-phenylalanin
mit an Polystyrol benzylesterartig gebundenes L-Valin mittels Dicyclohexylcarbodiimid
und N-Hydroxysuccinimid (je dreifacher Überschuß an N-Acyl-dipeptid und Dicyclohexylcarbodiimid
und sechsfacher Überschuß an N.Hydroxysuccinimid) bei -20° nach 24 stündiger Reaktionszeit
nur sehr wenig an Tripeptid gebildet worden und in einem anderen Versuch war nach
24 Stdn. bei + 200 unter sonst gleichen Reaktionsbedingungen zwar quantitative Umsetzung
eingetreten, das erhaltene L-Leucyl-L-phenylalanyl-L-valin enthielt aber 8,8 % an
L-Leucyl-d-phenylalanyl-L-valin.
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Es wurde nun gefunden, daß die Racemisierung vollstandig unterdrückt
werden kann, wenn man die Festkörpersynthese in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid
nicht in Dimethylformamid, sondern in Methylenchlorid ablaufen läßt.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von
Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß nan N-Acyl-aminosäure- bzw. N-Acyl-peptidderivate
mit ainer freien Carboxylgruppe in Gegenwart von N-Hydroxy-succinimid und dicyclohexylcarbodiimid,
oder daß man N-Acyl-aminosäurs-bzw. N-Acyl-peptid-N'-hydroxyauccinimid-ester mit
Aminosäure-bzw.
Peptidderivaten mit einer freien Aminogruppe, welche
über eine Carboxylgruppe benzylesterartig an ein Polystyrol gebunden sind, in Methylenchlorid
als Reaktionsmedium umgesetzt.
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Der Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens ist überraschend, da
weder das Auftreten von Racemisierung bei der Übertragung der Hydroxysucciniaid-aethode
auf die Festkörpersynthese noch die völlige Unterdrückung der Racemisierung durch
die Verwendung von Methylenchlorid zu erwarten war.
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Das Verfahren gesäß der Erfindung bietet gegenüber der bisherigen
Arbeitsweise bei der Festkörpersynthese erhebliche Vorteile; bisher konnte nur Aminosäure
um Aminosäure ankondensiert werden, während nun auch Peptide, welche auf anderem
Wege oft vorteilhafter hergestellt werden können, in einer einzigen Schritt ankondensiert
werden können. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß nunmehr auch solche N-Schutzgruppen
zur Peptidsynthese verwendet werden können, die von sich aus keinen Schutt gegen
Racamisierung bewirken.
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Die nach dem erfindungsemäßen Verfahren als #usgangsstoffe eingesetzten
Aminosäuren sind solche Aminosäuren, die Bausteine tür Peptide darstellen. hierzu
gehören Alanin, Phenylalanin, Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Cystein, Cystin,
Glutaminsäure, Glutamin, Methionin, Glycin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Morleuein,
Lysin, Ornithin, Prolin, Oxyprolin, Serin, Tyrosin, Valin, Tryptophan und Threonin.
Bei Verwendung von trifunktionellen Aminosäuren werden die dritten funktionellen
Gruppen zweckmäßigerweise nach bekannten Methoden geschützt, z.b. die Hydroxylgruppen
von Serin, Threonin, Oxyprolin und Tyrosin sowie die Iminogruppe des Histidins durch
2.2.2-Trihalogen-1-benzyloxycarbonyl-aminoäthyl-Reate (vgl. Ameldung F 49.354.IVb/12
qu (Fw 5102 A) und F Q9 355 IVb/12 qu (Fw 5103 A), die zweiten Carboxylgruppen
von
Asparaginsäure und Glutaminsäure durch die Benzylestergruppe, die 4} ständigen Aminogruppen
von Ornithin und Lysin sowie die Guanido-gruppe des Arginins durch Benzyloxycarbnnylgruppen.
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Unter dem Ausdruck Peptide werden solche Peptide verstanden, die sich
von den Gliedern einer derartigen Gruppe von Aminosäuren ableiten. Das Verfahren
kann beispielsweise zur Herstellung von nachstehenden Peptiden angewendet werden
Die N-Acyl-peptidderivate werden in mindestens äquimolarer Menge, bezogen auf die
Aminkomponente, eingesetzt, doch ist es rorteilhaft, einen größeren molaren Überschuß,
vorzugsweise 1,5 bis 3 Äquivalente, zu verwenden. Dementsprechend werden 1,5 bis
3 Äquivalente Dicyclohexylcarbodiirnid und 3-6 Äquivalente N-Hydroxysuccinimid angewandt.
Einen wesentlichen Teil des Überschusses an der eingesetzten N-Acyl-peptidkomponente
erhält an in Form des N-Ilydroxysuccinirnidesters zurück, der nach Einengen der
Lösung und Abfiltrieren des gebildeten Dicyclohexylharnstoffs in Methylenchlorid
gelöst oder nach dem vollständigen Eindampfen aufbewahrt und für weitere Peptidsynthesen
eingesetzt werden kann. Soll die Synthese besonders schnell durchgeführt werden,
so kann man einen noch wesentlich größeren Überschuß, z.D. den lO-fachen an der
N-Acylkomponenten oder an dem N-Acylaminosäure- bzw.
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N-Acyl-peptid-N' -hydroxysuccinimidester einsetzen Als Reaktionstemperatur
kommen Temperaturen zwischen -20° und der Siedetemperatur des Methylenchloridz infage.
Vorteilhaft arbeitet man bei +150 bis +250. Die Reaktionsdauer hängt von den verwendeten
AuJgangsstoffen, der gewählten Reaktionstemperatur sowie dem Überschuß an N-Acylaminosäure
bzw. N-Acyl-péptidkomponente oder deren N-llydroxysuccininideßtern ab.
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Bei einen dreifachen Überschuß ist bei Raumtemperatur die Reaktion
meist innerhalb 24 Stdn. beendet, doch kann die Reaktionszeit unbedenklich auf mehrere
Tage ausgedehnt werden,
wenn des zur Erzielung einer vollständigen
Umsetzung erforderlich ist.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Peptide sind
Heilmittel oder können als Zwischenprodukte zur Ilerstellung von Heilmitteln verwendet
werden. Durch die nachstehenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
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Beispiel 1 a) p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalaninmethylester
Öliges p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-leucin, aus 16,7 g (35 mMol) des Dicyclohexylammoniumsalzes
(hergestellt nach Chem. Ber. 95, 1 (1962)) mit Dowex 50 freigemacht wird der Lösung
von 7,55 g (35 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid und 3,54 g (35 mMol)
Triäthylamin in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. Man kühlt auf + 5° ab und fügte
7,84 g (38 mMol) Dicyclohexylcarbodiiiaid, in wenig Methylenchlorid gelöst, zu.
Nach einstündigem Rühren wird über ca. 43 - 60 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt1
der gebildete Dicyclohexylharnstoff abgesaugt und mit wenig Methylenchlorid gewaschen.
Nach dem Eindampfen im Vakuum ist die llauptmenge des Rückstandes in 75 ml Essigester
löslich. Die Lösung wird filtriert, mit verdünnter Citronensäurelösung, Natriumhydrogencarbonatlösung
und Wasser gewaschen sowie mit Magnesiumsulfat getrocknet. Ausbeute 13,3 g, Schmp.
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99-101°, nach Umkrist. aus Essigester/Petroläther Schmp.
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102-103°, [#]54627 : 26,60 (c = 1,5 in Methanol). RF auf Kieselgel
G mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1 vol.) 0,38, Sichtbarmachung mit essigsaurer
Ninhydrinlösung bei längerem Erhitzen oder mit Jod.
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C25H32N206 (456,5) Ber. C 65,77 H 7,07 N 6,14 Gef C 65,87 H 7,40
N 6,16 b) p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalamin 9, 13 g (20 mMol)
der nach a) hergestellten Verbindung werden in 30 ml Dioxan und 0,88 g Natriumhydroxyd
in 10 ml Wasser 30 Minuten lang gerührt. Nach Zugabe von 200 ml eiskaltem Wasser
@@@@ mit 22,5 ml in HCl versetzt. Es fällt zunächst ein Öl aus, das @@@@i@schrank
kristallisiert.
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Ausb. 8,34 g (94 %), Schmp. 129-131°, nach Umkrist. aus Essigester/Petroläther
Schmp. 132-133° (Nadeln). [#]54623 -10,20 (c n 2 in Methanol). RF auf Kieselgel
G mit Propanol-Wasses (7 : 3 vol.) 0,64, Sichtbarmachung mit Ninhydrin oder Jod.
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C24H30N206 (442,5) Ber. C 65,14 H 6,83 N 6,33 Gef. C 65,43 H 6,84
N 6,51 Zur Prüfung auf sterische einheitlichkeit wurde von einer Probe der p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-Rest
mit Trifluoressigsäure/Anisol abgespalten, mit methanolischer Salzsäure verestert
und N-trifluoracetyliert. Im Gaschromatogramm wurden nur Spuren von diastereoisomerem
Material gefunden. c) Darstellung von polymergebundenem L-Valin 25 g nach Merrifield
(vgl. J. AM. Chem. Soc. 85, S. 214 (1963) chlormethyliertes Polymer, 4,55 g (45
mMol) Triäthylamin und öliges p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-Valin, aus 23,1 g (50
mMol) p-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-Valindicyclohexylammoniumsalz, (hergestellt
nach Z. Naturforschg.
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20 b, 429 (1965)), mit Dowex 50 freigemacht, werden 2 Tage lang in
Äthanol gekocht. Absaugen und wiederholtes Waschen mit Äthanol, Wasser, Methanol
und Äther sowie Trocknen im Vakuum liefert 32,8 g Material. 15 g davon werden mit
25 g Anisol versetzt und auf 150 gekühlt, Sodann setzt man 50 g Trifluoressigsäure,
ebenfalls auf -150 gekühlt, zu.
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Nach 20-min. Rühren bei dieser Temperatur und 10 Minuten ohne Kühlung
wird in das von Merrifield (vgl. J.Am.Chem.Soc. 85, S. 2149 (1963)) angegebene Spezialgefäß
gegossen, die Flüssigkeit abgesaugt und mit etwas Äther das Polymer gewaschen.
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Dann wird 10 Min. lang mit 6 ml Triäthylamin in 50 ml Methanol geschüttelt.
Weiterhin wird noch mit 3-mal 30 ml Dioxan, 3-mal
30 ml Methanol
und 2-mal 30 ml Äther gewaschen, wobei vor dem Absaugen jeweils 3 Minuten lang geschüttelt
wird. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 12,8 g.
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Zur Bestimmung der an das Polymer gebundenen Menge an L-Valin wurden
200 mg 24 Stunden unter Stickstoff mit konz.
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HCl-Dioxan (1:1 vol.) gekocht. und nach dem Absaugen und Waschen
des Polymers mit Wasser wurde das L-Valin quantitatia mit einem Aminosäureanalysator
bestimmt. Danach lagen 0,480 u polymergebundenes L-Valin vor. d) Umsetzung mit polymergebundenem
L-Valin Alle Umsetzungen werden in dem Von Merrifield (J. AM. hem.
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Soc. 85, 2149 (1963)) angegebenen Spezialgefäß vorgenonnen.
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208 mg Polymer mit 0, 1 Mol L-Valin werden mit einer Lösung von 133
mg (0,3 mMol) p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-Leu-L-Phe-OH, 69 mg (0,6 mMol) N-Hydroxysuccinimid
und 62 mg (0,3 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 20 bis 25 ml Lösungsmittel 24 Stunden
geschüttelt. Die Flüssigkeit wird abgesaugt, worauf 3-mal mit je 25 ml Dimethylformamid
und 25 ml Methanol gewaschen wird. Vor dem Absaugen wird jeweils 3 Minuten lang
geschüttelt. Nun setzt man 5 ml Anisol und 25 ml Trifluoressigsäure zu und leitet
1 Stunde lang Bromwasserstoff aus einer Stahlfalsche ein. Nach dem Absaugen und
Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in einer kleinen Menge Wasser + Äther aufgenommen,
worauf der pH Wert der wässrigen Lösung mit dem Anionenaustascher Lewatit MP 60
auf 5-6 eingestellt wird. Nach dem Eindampfen der wässrigen Lösung wird das erhaltene
L-Leucyl-L-phenylalanyl-L-Valin dünnschichtchromatographisch mit L-Valin als Vergleichsubstanz
auf Vollständigkeit der Reaktion geprüft. Es ist vollständige Umsetzung eingetreten.
Ein anderer Teil wird nach Partialhydrolyse mit methanolischer Salzsäure
und
N-Trifluoracetylierung gaschromatographisch auf das Vorhandensein von D-Phe-L-Val
untersucht. Es wurde keine Racemisierung (< 1 %) festgestellt.
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Beispiel 2 a) p-Hethoxy-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin-X-hydroxy-succinimid-ester
3,98 $ (9 mMol) der nach Beispiel 1 b) hergestellten Verbindung und 2,07 g (18 mMol)
#-Hydroxysuccinimid werden in 75 ml Methylenchlorid bei Zimmertemperatur mit 1,86
g (9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 10-stündigem Rühren wird der gebildete
Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand
mit 20 ml Acetonitril digeriert und weiterer Dicyclohexylharnstoff entfernt. Nach
Eindampfen im Vakuum wird in Essigester aufgenormen und mit wenig Wasser dreimal
gewaschen. Beim Ein dämpfen im Vakuum hinterblieb schaumiges Material, das aus Äthanol
kristallisierte Ausbeute 3,11 g (64 %), nach Trocknen über P2O5 bei 60° Schmp. 133-135°.
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[#]54625: - 41,7° (c = 2 in Methylenchlorid).
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C28H33N308 (539,6) Ber. C 62,33 H 6,16 N 7,79 Gef. C 62,44 11 6,30
N 7,73 b) Umsetzung. mit polymergebundendem L-Valin Alle Umsetzungen werden in dem
von Merrifield (J. Am. Chem.
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Soc. 85, 2149 (1963)) angegebenen Spezialgefäß vorgenommen.
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208 mg Polymer mit 0,1 mMol L-Valin werden mit einer Lösung von 162
mg p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-Leu-L-Phe-OSu in 20 bis 25 ml Lbsungsmittel 24 Stunden
geschüttelt. Die Flüssigkeit wird abgesaugt, worauf 3-mal mit je 25 ml Dimethylformamid
und
25 ml Methanol gewaschen wird. Vor dem Absaugen wird jeweils 3 Minuten lang geschüttelt.
Nun setzt man 5 ml Anisol und 25 ml Trifluoressigsäure zu und leitet 1 Stunde lang
Bromwasserstoff aus einer Stahlflasche ein.
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Nach dem Absaugen und Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in
einer kleinen Menge Wasser + Äther aufgenommen, worauf der pH Wert der wässrigen
Lösung mit dem Anionenaustauscher Lewatit MP 60 auf 5-6 eingestellt wird. Nach dem
Eindampfen der wässrigen Lösung wird dunnschichtchromatographisch mit L-Valin als
Vergleichsubstanz auf Vollständigkeit der Reaktion geprüft. Es ist vollständige
Umsetzung eingetreten. Ein anderer Teil wird nach Partialhydrolyse mit methanolischer
Salzsäure und N-Trifluoracetylierung gaschromatographisch auf das Vorhandensein
von D-Phe-L-Val untersucht. Es wurde keine Racemisierung (< 1 %) festgestellt.
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Beispiel 3 L-Leucyl -L-phenylalanyl-L-leucyl-L-phenylalanyl-L-valin
Alle Umsetzungen werden in dem von Merrifield (J. Am. Chem.
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Soc. 85, 2149 (1963)) angegebenen Spezialgefäß vorgeno:-en. a) 500
mg Polymer mit 0,26 nMol L-Valin werden mit 0,77 iMol p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin
und 1,54 -Mol N-Hydroxysuccinimid in 20 ml Methylenchlorid 10 Min. lang geschüttelt.
Sodann werden 0,77 -Mol Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Methylenchlorid zugegeben,
worauf 24 Stdn. bei Raumtemperatur (20-220) geschüttelt wird. Die Flüssigkeit wird
abgesaugt und das Polymer wird mit Methylenchlorid, Dimethylformamid und Methanol
gewaschen und gut trocken gesaugt.
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Zur Abspaltung des p-Methoxy-benzylozycarbonylrestes gibt man 5 ml
Anisol und 25 ml Trifluoressigsäure zu, schüttelt 15 Min. bei Raumtemperatur, saugt
ab, wäscht das Polymer mit etwas
Äther und schüttelt 10 Min. mit
3 ml Triäthylamin in 25 ml Dimethylformamid und saugt ab. Sodann wäscht man das
Polymer dreimal mit je 25 ml Dimethylformamid und dreimal Mit je 25 ml Methanol,
wobei jeweils 3 Min. lang geschüttelt wird. b) Das gut absgesagute, L-Leucyl-L-phenylalanyl-L-valin-haltige
Polymer wird in derselben Weise, wie unter a) beschrieben, mit p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin
umgesetzt. Sodann wird das gewaschene und getrocknete Polymer zur Abspaltung des
gebildeten pentapeptids in 5 ml Anisol und 25 ml Trifluoressigsäure suspendiert,
worauf 1 Stde. lang ein mäßiger Strom von Bromwasserstoff durchgeleitet wird. Hierauf
wird abgesaugt. und das Polymer mit 25 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Die vereinigten
Lösungen werden i.Vak. eingedampft.
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Der Rückstand wird in 20 ml Wasser und 20 ml Äther suspendiert umd
abgesaugt. Das zurückgebliebene Hydrobromid des Pentapeptids wird in der ausreichenden
Menge siedenden Eisessigs gelöst und mit einem Überschuß an krist. Natriumacetat
versetzt. Durch langsame Zugabe von Wasser erhält man das Pentapeptid in Form von
Nädelchen. Es wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
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Nach dem Trocknen bei 70°/14 -, 1 Stunde. hat das Peptid die Zusammensetzung
C35H51N5O6.H2O. die Aminosäureanalyse liefert mach der Totalhydrolyse das Verhältnis
Valin : Leucin : Phenylalanin = 0,960:2, 085 : 2,030.
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Beispiel 4 Glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanyl-Levalin
Alle Umsetzungen werden in dem von Xerrifield (J.Am.Chem. Soc.
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85, 2149 (1963)) angegebenen Spezialgefäß vorgenommen.
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Zunächst wird, wie in Beispiel 3, Absatz a) beschrieben, polymergebundenes
L-Leucyl-L-phenylalanyl-L-valin hergestellt. Sodann werden 0,77 mMol p-Methoxy-benzyloxycarbonylglycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-leucin
und 1,54 mMol N-Hydroxysuccinimid in 60 ml Methylenchlorid zugegeben. Nach 30-inin.
Schütteln gibt man 0,77 mMol Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Methylenchlorid zu
und schüttelt 24 Stdn. bei Raumtemperatur. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie
unter Beispiel 3 angegeben. Wie dort wird auch in diesem Falle das zunächst gewonnene
Hydrobromid des lleptapeptids in der ausreichenden Menge sied. Eissigs gelöst und
mit einem Überschuß an krist. Natriumacetat versetzt. Bei der langsamen Zugabe von
Wasser krist. das freie lleptapeptid aus. Die Elementaranalyse zeigt, daß nach dem
Trocknen (1 Stunde bei 70°/14 mm) das Peptid mit etwa 2,5 Mol. Kristallwasser vorliegt.
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C401159N707.2.5 H2O Ber. C 59,2 11 7,8 N 12,1 Gef. C 59,4 li 7,5 N
11,6