SU454736A3 - Способ получени пептидов - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к получению пептидов на иолимерных носител х в гомогенной фазе.

Известный способ получени  пептидов на полимерном носителе в органическом растворителе состоит в том, что N-защищенную аминокислоту в виде соли конденсируют при нагревании в органическом растворителе с хлорметилированным полистиролом. N-защиту удал ют известными методами и необходимую аминокислотную последовательность создают конденсацией полимер - аминокислоты с соответствуюш ,ими М-запдищенными аминокислотами в растворе. Иосле каждой стадии полимер - пептид отдел ют от низкомолекул рных веществ осаждением. После постройки аминокислотной последовательности пептид отдел ют от полимера. Применение известного способа св зано с некоторыми трудност ми. Вопервых , присоединение первой аминокислоты к полимеру требует относительно жестких условий реакции (нагревание в присутствии триэтиламина ). Во-вторых, осаждение полимерпептида после каждой стадии происходит не полностью, вызывает его фракционирование и

увлечение в осадок низкомолекул рных примесей . Это ириводит к потер м целевого пептида и его загр знению.

Предлагаемый способ получени  позвол ет

избежать указанных трудностей. N-защищенпую С-концевую аминокислоту создаваемого пептида св зывают в м гких услови х в растворе сложноэфирной св зью с гидроксилсодержащим полимером - носителем с мол. в.

10000-100000. В качестве полимера - носител  могут быть исиользованы полиэтиленгликоли , их сложные эфиры с лимонной кислотой, сополимеры полиэтиленгликол  с  нтарной кислотой и т. д. Образование сложной

эфирной св зи можно проводить, например , с помощью дициклогексилкарбодиимида . Можно также предварительно вводить С-концевую аминокислоту в мономер, а затем получать полимер-носитель с присоединенной

аминокислотой. N-защиту с полимер - аминокислоты удал ют, например, ацидолизом или гидрированием. Полимер отдел ют от низкомолекул рных веществ диализом, ультрафильтрацией , колоночной хроматографией или противоточным распреде пением, а не осаждением , как в известном способе. Дальнейшее ступенчатое наращивание пептидной цепи ведут как обычно, примен   дл  образовани  амидной св зи дициклогексилкарбодиимид, алкилхлорформиат , азиды пли активированные эфиры N-защищенных аминокислот. Реакцию провод т в растворе в органических растворител х . Дл  водорастворимых полимеров-носителей возможно образование амидной св зи в водной среде. В этом случае как конденсирующее средство иримен ют водорастворимый карбодиимид . После каледой стадии конденсации N-защиту отщепл ют подход щим способом и полимер отдел ют от иизкомолекул рных веществ . Разрушение св зи готового пептида с полимером-носителем провод т известными методами, наиример щелочным гидролизом или аммонолизом. Пептид отдел ют от полимера одним из указанных методов.

Пример 1. Этерификаци  БОК -валил-ОН с ПЭТ (мол. в. 20000).

20 г ПЭГ 4,34 г БОК-валил-ОН и 4,12 г ДЦК раствор ют в 200 мл CH2CI2 и перемешивают при комнатной температуре без доступа влаги в течение 5,5 суток. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, прибавл ют 100 мл 4 н. НС1/диоксана, перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и выпаривают досуха в вакууме. Остаток раствор ют иримерно в 1 л воды. Образующийс  при этом осадок выдел ют при помощи фильтровального вспомогательного вещества . Фильтрат довод т до рН 6 при помощи NaOn или триэтиламина и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10 пока в фильтрате можно обнаружить свободный валин . Фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток высушивают смесью бензола с абсолютным этанолом (80/20)до посто нного веса. Выход Н-валил-ПЭГ 19,35г. Содержание аминокислоты 80%, или 0,08 ммоль/г (аминокислотный анализ).

Б. Синтез пептида. 5 г Н-валпл-ПЭГ раствор ют в 50 мл СН2С12 и прибавл ют 0,1 мл триэтиламина. После прибавлени  0,44 г БОКглицил-ОН (2,5 ммол ) и 0,515 г ДЦК (2,5 ммол ) перемешивают 2 часа при комнатной температуре, выпаривают досуха в вакууме , в течение 30 мин обрабатывают при комнатной температуре 40 мл 4 н. ПС1/диоксана и снова выпаривают досуха в вакууме. Масл нистый остаток раствор ют в 500-700 мл воды , осадок отдел ют, фильтрат довод т до рН 6 при помощи NaOH или триэтиламина п подвергают ультрафильтрацпп через Диафло ультрафильтр УМ 2. Фильтрат обрабатывают. Выход Н-глицил-валил-ПЭГ 4,85 г.

Указанным образом к Н-глицил-валпл-ПЭГ прибавл ют триэтилампн и привод т в реакцию с 2,5 мм БОК-аланил-ОН и 2,5 ммоль

БОК - трет-бутоксикарбонил

ПЭГ - полиэтргленгликоль

ДЦК - дициклогексилкарбодиимид

464736

ДЦК. После отщеплени  защитной группы и ультрафильтрации получают 4,75 г П-аланилглицил-валил-ПЭГ . Соответствующим взаимодействием П-аланил-глицил-валил-ПЭГ с БОК-лейцил-ОП и ДЦК иолучают Н-лейцилаланил-глицил-валил-ПЭГ (4,5 г). Аминокислотный анализ гидролизованной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот : валил : глицил : аланил : лейцпл 1,08: 1,00:0,90: 1,04.

В. Отщепление тетрапеитида от носител . Раствор 4,0 г Ц-лейцил-аланил-глицил-валилПЭГ в 75 м воды и 1,5 мл 1 н. КОН перемешивают в течение 2 час при комнатной температуре , точно нейтрализуют 1,5 мл 1 н. ЦС1 и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ iO до тех пор, пока не будет собрано 3,5 л фильтрата. Он дает после выпаривани  в вакууме 280 мг сырого продукта, который частично освобождают от NaCl дигерированием абсолютным метанолом. Метанольный раствор обеспечивают углем, фильтруют и выпаривают досуха. Остаток раствор ют в воде и лиофилизуют . Получают 191,5 мг сырого тетрапептида , аминокислотный анализ которого показывает следующее соотношение аминокислот : валил : глицил : аланил : лейцил 1,03 : : 1,00:0,85: 1,07. Дол  пептида в сыром веи;естве составл ет 35% (аминокислотный анализ ), т. е. рассчитанный на первую аминокислоту (валин) общий выход составл ет 45%. Вещество идентично заведомому образцу, полученному по методу Меррифилда. Пример 2.

А. К 4,34 г БОК-валил-ОП и 2,8 мл триэтиламина в 80 мл СН2С12 прикапывают при перемешивании при -5°С 1,91 мл этилового эфира хлоругольной кислоты в 20 мл СНзС, через 30 мин при -5°С прибавл ют охлажденный (-5°С) раствор 20 г ПЭГ (мол. в. 20 000) и 2,4 г (20 ммоль) диметиламинопиридина в 100 мл СН2С12. Реакционную смесь перемешивают в течение часа при -5°С и 65 час при комнатной температуре. Дл  блокировки

не прореагировавших гидроксильных групп перемешивают реакционную смесь 4 часа с 10 ммол ми уксусного ангидрида и 10 ммоль триэтиламина при комнатной температуре и выпаривают в вакууме досуха. Остаток обрабатывают 30 мин при комнатной температуре 100 мл 4 н. HCl в диоксане, выпаривают досуха в вакууме и раствор ют примерно в 1 л воды. После фильтрации и установки рП ультрафильтруют и обрабатывают как описано

выше. Выход 19 г П-валил-ПЭГ. Содержание аминокислоты 607о, или 0,06 ммоль/г (аминокислотный анализ).

Б. Псход  из 12,7 г П-валил-ПЭГ, синтезируют описанный в примере 1Б тетрапептид

тем же образом. Реагенты: 1 ммоль триэтиламина , 4,0 ммол  БОК-аминокислоты, 4,0 ммол  ДЦК. Получают 11,5 г П-лейцил-аланилглицил-валил-ПЭГ со следующим соотношением аминокислот: валил : глицил : аланил : лейцпл 0,88: 0,86: 1,11 : 1,00.

В. Как описано в примере 1В, гидролизуют 10 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ПЭГ в 100 мл воды и 3 мл 1 н. КОН. После нейтрализации , ультрафильтрации и обработки получают 300 мг сырого тетрапептида, который имеет следующее соотношение аминокислот: валил : глицил : аланил : лейцил 0,96 : 0,91 : : 1,24: 1,00. Дл  пептида в сыром продукте составл ет 41% (аминокислотный анализ), т. е., счита  на первую аминокислоту (валил), общий выход составл ет 57% от теопетического.

Примерз. К 6г Н-валил-ПЭГ (80%, 0,5 ммол  валина и 0,09 мл триэтиламина (0,6 ммол ), растворенным в 600 мл СПоС. прибавл ют 1,05 г БОК-глицил-ОПФ (3.5 ммол ) и перемещивают 24 часа при комнатной температуре. После выпаривани  в вакууме остаток перемешивают 30 мин при комнатной температуре с 60 мл трифторуксусной кислоТЫ/СН9С12 (1:1) и вновь выпаривают досуха в вакууме. Остаток раствор ют примерно в 700 мл воды, фильтруют и фильтрат довод т до рН 6 при ПОМОШ.И NaOH.

После ультрафильтрации (диафло ультрафильтр УМ 10) обрабатывают как описано в примере 1Б. Выход Н-глицил-валил-ПЭГ 5,88 г.

Аналогично примеру 1Б Н-глицил-валилПЭГ обрабатывают БОК-лейцил-ОНП. Получают 5,6 г Н-лейцил-аланил-глицил-валилПЭГ со следующим соотношением аминокислот : валил : глицил : аланил : лейцил 1,00: :0,70 : 0,78 : 0,71. 5,6 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ПЭГ гидролизуют по принтеру 1В и отщепленный тетрапептид обрабатывают соответственно . Получают 250 мг сырого тетрапептида со следующим соотноптением аминокислот: валил : глииил : аланил : лейцил 1.00: : 0,83 : 0,93 : 0,88. Дол  пептида в сыпом тетрапептиде составл ет 32%, т. е., счита  на первую аминокислоту (валин), общий выход составл ет 50% от теоретического.

Пример 4.

А. 10 г ПЭГ (мол. в. 20000), 1,75 г БОКглицил-ОН и 2,06 г ДЦК раствор ют в 100 мл СНдСЬ и перемешивают в течение 6 суток при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, прибавл ют 100 мл 1,2 н. НС1 в лед ной укс сной кислоте и перемешивают 20 мин при комнатной температуре .

Растворитель отгон ют в вакууме, а к остатку прибавл ют 100 мл воды. Полученный осадок отдел ют центрифугированием. Прозрачный верхний слой декантируют, довод т до рН 6 триэтиламином и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10 до тех пор, пока ультра фильтрат еще содержит глицил-ОН. Остаток выпаривают в вакууме и следы воды дважды азеотропно отгон ют с бензолом. Продукт сушат в экссикаторе до посто нного веса. Выход Н-глицил-ПЭГ 9,8 г, содержание аминокислоты 0,06 ммоль/г.

Б. 9,8 г Н-глицил-ПЭГ раствор ют в 60 мл СН2С12 и нейтрализуют 0,7 ммол  М-мети,-;

морфолина. В отдельном сосуде раствор ют 3 ммол  БОК-лейцил-ОН в 5 мл и 1 мл .-пшетилбормамида, нейтпализуют 3 ммол  Х-метилмопфолина, охлаждают до -20°С, прибавл ют 2.6 ммол  изобутилхлопоформиата и перемешивают 10 мин при -20°. Смешанный ангидрид прибавл ют при -20°С к раствору Н-глицил-ПЭГ и перементивают в течение часа при -20° и 2 часа при 4°С. Растворитель отгон ют, остаток обрабатывают 15 мин ПРИ комнатной тнмпературе 50 мл 1.2 н. НС1 в лел иой уксусной кислоте и оп ть выпаривают в вакууме досуха. Остаток раствор ют в 100 мл воды, довод т до рН 6 водНЫА1 паствором аиетата натри  и ультпаЛпльтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10. Остаток выпаривают в вакууме досуха, дважды азеотропно высушивают с бензолом н сушат в экссикаторе. Выход Н-лейцил-глицттлПЭГ 9.5 г.

Аналогично сочетают другие аминокислоты в виде следуюитих пооизводных: БОК-аланилОН , БОК-Ю-бензил)-твеонил-ОН, БОК-лейцил-ОН . БОК-валил-ОН, БОКЮ-бензил)-тпеоиил-ОН , БОК-валил-ОН. После последнего сочетани  получают 8,0 г,

Н-валил-тоеонил - валил - лейцил - треонилбензил

30бензил

алант1л-лейцпл-глицил-О-ПЭГ

Анализ аминокислот гидролизиоованной пробы этого BeniecTBa дал следующий результат:

глицил : лейцил : аланил : треонил j валил 1,0 : 1,89 : 1,67 : 1,0, Значени  дл  отдельных аминокислот получпли из результатов анализов амииокислот на промежуточных ступен х .

Пример 5.

А. Лтпюнную КИСЛОТУ этерифицируют в сложный эфир с ПЭГ (мол. в. 6000) с помощью эквимол рного количества ДЦК (пассчитано на ПЭГ) в метпленхлориде (10%-ный раствор) в течение 3 суток. Растворитель отгон ют , остаток раствор ют в воде н полученный осадок отпеитрифугипуют. Раствор ультрафильтруют (Амикон, УМ-2-фильтр) упаривают Е вакууме и остаток сушат до иосто нного веса. Выход 80% от теоретттческого. Высушенный полимер этерифицируют БОК-валил-ОН и ДНК (оба компонента в 5-кратном избытке, счита  на 0,2 ммоль/г функциональных групп на полимепе) в 10%-ном растворе в СНоСЬ в течение 3 суток при комнатной температуре. Содержание аминокислоты в полимере после прин той обработки и отщеплени  БОК-группы с 4 н. НС1/диоксан:

: 0.2 тмоль/г.

Б, По ДНК-методу получают следующтге активированные сложные эфиры:

) 3-кратный избыток ПЗГ, счита  на функциональ65 iii.ie группы лимонной кислоты БОК-лейцил-ПХФ БОК-глицил-ОНФ, БОК-глутаминил-ОНФ. Сочетани  провод т следующим образом. 1 ммоль (5 г) Н-валил-полимера раствор ют в 50 мл СН2С12/диметилформамид (1:1), нейтрализуют 1,2 ммол  N-метил-морфолина и прибавл ют 3 ммол  активированного эфира БОК-аминокислоты. Через 5 мин к раствору прибавл ют еще 1,2 ммол  N-метил-морфолина и перемещивают 2 часа при комнатной температуре . Растворитель отгон ют в вакууме, к остатку прибавл ют 50 мл 4 и. НС1/диоксана и оставл ют сто ть на 30 мин при комнатной температуре. После повторной отгонки растворител  раствор ют остаток в смеси воды/этанола (3:1) и ультрафильтруют при помощи Диафло ультрафильтра УМ-2. Остаток суилат. Выход Н-глицил-лейцил-валил-полимера 4 г. Результат аминокислотного анализа гидролизованной пробы: валил : лейпил : глицил : глутаминил: 1,0 : 0,9 : 1,0 : 0,98. 2,0 г Н-глутаминил-глицил-лейцил-валил-полимера перемещивают 4 час в 0,2 н. КОН (50 мл) при комнатной температуре, нейтрализуют 2 н. НС1 и пропускают через колонну (2,5X100 см) с Сефадексом G-25. Сырой иептид н-глутаминил - глицил - лейцпл-валилОН получают с выходом примерно 50%Аминокислотный анализ дает следующие значени : валил : лейцил : глицил : глутамиНИЛ 1,0 : 0,88 : 1,05 : 0,98. Пример 6. А. ПЭГ (мол. в. 4000) этерифпцируют 10кратным избытком БОК-глипил-ОН и ДЦК в 10%-ном растворе СН2С12 в течение 5 суток при .домнатной температуре. После этого отщепл ют защитную группу, растворитель отгон ют , остаток раствор ют в воде и полученный осадок отдел ют центрифугированием. Раствор ультрафильтруют с Диафло ультрафильтром УМ-2, растворитель отгон ют и остаток сушат. Содержание аминокислоты найдено аминокислотным анализом как 100%-ное. Малеиновую кислоту подвергают взаимодействию с «-нитрофенолом и ДЦК, получа  диОНФ-эфир малеиновой кислоты. Выход примерно 80% от теоретического, температура плавлени  185-190°С. На двойную св зь полученного таким образом сложного эфира малеиновой кислоты присоедин ют йодоводород. Полученный ди-п-нитрофениловый эфир монойод нтарной кислоты подвергают взаимодействию с Ag-солью БОК-валил-ОН, получа  ди-ОНФ-эфир БОК-валил-О- нтарной кислоты . Эквимол рные количества ПЭГ-глицил-Н (нейтрализованный N-метил-морфолином) и ди-ОНФ-эфира БОК-валил-О- нтарной кислоты раствор ют в СНаСЬ диметилформампдс (I : 1; 10-ный раствор) и перемешивают при комнатной температуре 24 часа. После этого отгон ют растворитель, остаток раствор ют в воде и ультрафильтруют (Диафло ультра ) , -. |11:ит  :лорфени,1

ОНФ - -нитрофенил фильтр УМ-10), пока толпдинова  проба в ультрафильтрате не станет отрицательной. Фильтрат упаривают в вакууме и остаток сущат . Аминогруппы Н-глицил-ПЭГ после этого подвергают взаимодействию с ангидридом 3сульфопропионовой кислоты. Из полученного продукта отщепл ют БОК-группу при помощи 4 н. НС1/диоксана. Полученный полимер 1гмсет мол. в. выще 20000 (согласно удержан1по). Б. 2 г полученного полимера и 6 ммолей БОК-лейцил-ПХФ перемещивают в 20 мл СН2С12/диметилформамида (1 : 1) 3 час при комнатной температуре (через 5 мин прибавл ют к реакционной смеси 2 ммол  N-метилморфолина ). После этого отгон ют растворитель в вакууме, остаток обрабатывают 20 мин 40 мл 4 н. НС1/диоксана и растворитель оп ть отгон ют. Остаток раствор ют в 100 мл воды п ультрафильтруют (УМ-10). Воду выпаривают и остаток сущат. Выход 1,9 г. Анализ: валил : лейцил 1,0: : 0,95. В. 1,9 г дипептид-полимера перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре в 0,2 н. водного КОН, нейтрализуют 2 н. НС1 и ультрафильтруют через УМ-10-фильтр. Фильтрат выпаривают в вакууме. Выход сырого продукта 350 мг. Содержание пептида составл ет 70%. Аминокислотный анализ: валил: : лейцил 1,0 : 0,97. Пример 7. Сначала этерифицируют БОКглицил-ОН с ПЭГ (мол. в. 200) согласно примеру 6А. Удаление избыточных компонентов провод т ультрафильтрацией с Диафло фильтром УМ-2 или хроматографией на Сефадексе . Полученный продукт конденсируют аналогично примеру 6 с ди-ОНФ -эфиром малеиновой кислоты. К продукту конденсации присоедин ют йодоводород и йодированный продукт подвергают взаимодействию с Ag-солью БОК-аланил-ОН. В качестве растворител  примен ют вместо эфира диоксан. После этерификации растворитель отгон ют, остаток раствор ют в воде п ультрафильтруют (УМ-10-фильтр). После сущки остатка получают 95% этерифицированного полимера. После отп1еплеии  защитной группы сочетают с БОК-лейнил-ПХФ. Выход Д111:ептидполимера 1,95 г (93% от теоретического). Аминокислотный анализ: аланил : лейцил 1,0: 1,01. Отщепление пептида от полимерного носител  дает 300 мг сырого продукта. Выход по данным аминокислотного анализа 80% от теоретического: аланил : лейц1 л 1,0 : 1,0. Пептид однороден при тонкослойной хроматографии в системе лед на  уксусна  кислота (бутанол) вода (3:1:1). Пример 8. А. Ю г ПЭГ (моль. D. 20000), 1,16 г БОКизолейцил-ОН и 1,03 г ДЦК раствор ют в 9 100 мл СНгСЬ и перемешивают 6 суток при комнатной температуре без доступа влаги. Реакционную смесь выпаривают досуха в вакууме , прибавл ют 50 мл 4 и. HCl/диоксана п перемешивают 30 мин при комнатной температуре . После отгонки растворител  остаток раствор ют в 100 мл воды и выпавший осадок отдел ют центрифугированием. ОтдеКантированный раствор довод т до рН 6 при помош,п 2н. NaOH и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ-10. Фильтрат выпаривают досуха в вакууме и сушат. Выход Н-изолейцил-ПЭГ 9,8 г. Содержание изолейцила, согласно аминокислотному анализу, 0,07 ммоль/ /г (70% от теоретического). Б. Получеппый продукт сочетают по очереди с БОК производными аланина, валина и фенилаланина ио следуюшей схеме. 10%-ный водный раствор полимера довод т до рН 3,9 при помощи 4 н. NaOH или 5 н. H2SO4 и охлаждают до 4°С. В отдельном сосу.п,е раствор ют БОК-ампнокислоту (5-кратный избыток по сравнению с аминокомпонентной) в 2- 3мл диметилформамида и прибавл ют к водному раствору полимера, поддержива  рН 3,9 посто пным. При тех же рН и температуре при перемешивании прибавл ют эквимол рное БОК-аминокислоте количество д-толуолсульфоната Ы-циклогексил-К- р-(Ы-метил-морфолино )-этил - карбодиимид-п - толуолсульфонат , поддержива  рН 3,9 при помощи 5 н. H2SO4. Примерно через 15 мин, когда рН больше не измен етс , довод т рН до 7,0 при помощи 4 н. NaOH и перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Затем рН оп ть довод т до 3,9 и сиова прибавл ют эквимол рное количество конденсирующего средства. Раствор оставл ют на 3- 4часа при рН 7,0 и комнатной температуре и ультрафильтруют. Выпариванием в вакууме получают тетрапептпд-полимер. в Тетрапеитпд-полимер (9 г) обрабатывают 24 час 2 п. КОН в смеси воды/диоксана (9 г в 50 мл) нейтрализуют и подвергают гель-фильтрации через колонну (2,5X80 см) с Сефадексом G-15 в водном растворе. Воду отгон ют (при 40° С). Остаток раствор ют в метаноле, растворитель отгон ют и пептид сушат . Выход сырого Н-алапил-валпл-фенплизолейцпл-ОН: примерно 300 мг (не совсем свободен от солей). Аминокислотный анализ дает выход примерно 0,5 ммол  (75% от теоретического , счита  па содержание аминокислоты в полимере). Результат анализа после хроматографии на колонне: изолейцил : фенил : валил : алаНил 1 ,0 : 0,99 : 0,90 : 0,97. Пример 9. А. 20 г ПЭГ (мол. ,в. 20000), 5,0 г Ц -валил-ОН и 4,2 г ДЦК раствор ют в 200 мл СН2С12 и перемешивают 10 суток при комнатной тем пературе без доступа влажности. К реакционной смеси прибавл ют 1,2 мл ле ) Ц - бензилоксикарбонил 454 дЯНой уксусной кислоты, перемешивают еще 20 час и выпаривают в вакууме досуха. Остаток раствор ют в 300 мл МеОН, прибавл ют 5 мл 4 н. НС1/МеОН и гидрируют .над Pd/C npjt комнатной температуре и нормальном давлении, пока поглощаетс  водород. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток раствор ют примерио в 1 л воды и образующийс  осадок отдел ют. Фильтрат yльтpaiфильтpyют через Диафло ультрафильтр УМ-40 и его обрабатьсвают дальше, как описано в примере 1А. Выход 18,8 г Н-валИл-ПЭГ-НС1. Содержание аминокислоты 88%, или 0,088 ммоль/г (амииоки-слотный анализ). Б. 10 г Н-валил-ПЭГ-НС1 раствор ют в 50 мл СН2С12, охлаждают до -20° и раствор довод т до рН 8-9 прибавлением 0,11 мл N-метилморфолина. 1,05 г Ц-глицил-ОН раствор ют в 10 мл тетрашдрофурана, охлаждают до -20°, прибавл ют 0,55 Мл N-метилморфолина и 0,65 мл изобутиловото эфира хлормуравьиной кислоты и перемешивают 5 ми.н при -20°. Эту смесь прибавл ют к охлал-сденному до -20° раствору НчвалилПЭГ и перемешивают 30 мин ниже -10°, 30 мин ниже 0° и 3 час при комнатной температуре . Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, остаток раствор ют в 200 мл МеОН, прибавл ют 1,25 мл 4 н. НС1/МеОН и Pd/C и гидрируют ,при комнатной температуре и нормальном давлении до окончани  поглощенп  водорода. Катализатор отфильт1ровывают , фильтрат выпаривают в вакууме досуха , остаток раствор ют примерно в 1 л воды , фильтруют и ультрафч льтруют через Диафло ультрафильтр УМ-10. Фильтрат от ультрафильтрации вьипаривают досуха в вакууме , сушат при помощи бензола/абсолютного этанола (80/20) и ночь в экссикаторе до посто нного веса. Выход Н-глицил-валил-ПЭГ-НС1 8,0 г. Аналогично довод т 4,0 г Н-глицил-валилПЭГ-НС1 до рН 8-9 при помощи 0,05 мл N-метилморфолина и иодвергают взаимодействию с раствором смешанного ангидрида, изготовленным из 500 мг Ц-аланил-ОН, 0,22 мл N-метилморфолина и 0,26 мл изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 5 мл тетрагидрофурана . После отщеплени  защитной группы и ультрафильтрации получают 3,8 г Н-аланил-гл1ЩИЛ-валил-ПЭГ- НС1. Соответствующим взаимодействием этого продукта с Ц-лейцил-ОН. N-метилморфолином и изобутиловым эфиром хлормуравыиной кислоты получают после отщеплени  защитной гру.пиы и ультрафильтрацип 3,5 г Н-лейцил-аланилглидил-валил-ПЭГ НС1. Анализ аминокислот гидролизированной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот: валил : глицил : : аланил : лейцпл 1,00 : 0,89 : 0,92 : О 94. В. 3,4 г Н - лейцил - аланил - глицил - валилПЭГ-НС1 гидролизуют аналогично примеру В в 62 мл воды при помощи 1,25 мл J н,