DE2406167A1 - Verfahren zur herstellung von stabilen suspensionen von lebensfaehigen viren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von stabilen suspensionen von lebensfaehigen viren

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DE2406167A1 DE19742406167 DE2406167A DE2406167A1 DE 2406167 A1 DE2406167 A1 DE 2406167A1 DE 19742406167 DE19742406167 DE 19742406167 DE 2406167 A DE2406167 A DE 2406167A DE 2406167 A1 DE2406167 A1 DE 2406167A1
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Description

u.Z.: K 625 (Vo/Mü/kä)
Zygraich-Peetermans Case I
RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAFEUTIQUES R.I.T. Genval, Belgien
10
11 Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen von lebensfähigen Viren "
Priorität: 9. Februar 1973, V.St.A., Kr. 330 912
· Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen von lebensfähigen Viren sowie die nach diesem Verfahren hergestellten Viruspräparationen.
20 25
Es ist bekannt, daß die Extraktion von zellassoziierten Viren aus den Zellen, mit denen die Viren assoziiert sind, zu einem Verlust des Großteils des Virusmaterials führt, wenn das Reaktionsmedium nicht mit bestimmten Zusätzen versehen wird, die für eine Stabilisierung der Viren während des Aufbrechens der Zellen sorgen.
von Viren Es ist auch bekannt, daß die Stabilität/tei der Lagerung und bei der Handhabung beispielsweise beim Lyophilisieren, durch bestimmte Zusätze, die als LyophilisationsstaMlisatoren bekannt sind, stark verbessert werden können; vgl. L 409833/0974
US-PS 3 519 ?1O.
Die meisten zur Stabilisierung von Viren während des Aufbrechens der Zellen bekannten Zusätze bewirken keine Stabilisierung der Viren während der anschließenden Lyophilisation und Lagerung. Ebenso ^ewirken im allgemeinen Lyophilisationsstabilisatoren auch keine wesentliche Stabilisierung der Viren während der Extraktion aus den Zellen, mit denen sie ursprünglich assoziiert waren.
Bei Untersuchungen über den Marek-Krankheitsvirus und über den FC-126 des Herpesvirus des Truthahns, der bekanntlich gegen die Marek-Krankheit schützt, wurde festgestellt, daß bestimmte Zusätze gleichzeitig die'Viren während der Extraktion von den Zellen und während der anschließenden Lyophilisation und Lagerung stabilisieren; vgl. beispielsweise Calnek et al., Appl. Microbiol., Bd. 70 (1970), Seiten 723 bis 726. Die bekannten derartigen Zusätze, die eine Stabilisierung sowohl während der Extraktion sowie während de.r Lyophilisation und Lagerung bewirken, bestehen im wesentlichen aus einem tierischen Proteinmaterial, nämlich Albumin und/oder Casein.
Die Verwendung von tierischen Proteinen bringt jedoch verschie-. dene Nachteile mit sich, die beispielsweise auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine und auf häufig diese Materialien begleitende Verunreinigungen zurückzuführen sind. Aufgabe der Erfindung war es daher, stabilisierende Zusätze für Virussuspensionen zu schaffen, die die Nachteile von Proteinmaterialien nicht aufweisen.
L 409833/0974 J
Γ- - 3 - . 240616? π
Es wurde nun 'überraschenderweise festgestellt, daß die vorgenannten Proteine durch Polyvinylpyrrolidon ersetzt werden können. Polyvinylpyrrolidon ist im wesentlichen nicht reaktionsfähig und ist als hochwertiges Handelsprodukt erhaltlich, . das frei von Verunreinigungen ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen von lebensfähigen Viren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Suspension von mit. einem zeilassoziierten Virus infizierten Zellen vor dem Aufbrechen der Zellen mit einer stabilisierenden wäßrigen Pufferlösung versetzt, die 0,1 bis 10 Prozent Polyvinylpyrrolidon mit einem . durchschnittlichen Molekulargewicht bis 40 000, vorzugsweise 10 000 bis 30 000, 2 bis 10 Prozent eines Stärkederivats, wie Saccharose, 0,05 bis 0,2 Prozent eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes von Glutaminsäure, wie Natriumglutamat, und 0,1 bis 0,5 Prozent eines Chelatbildner^ für zweiwertige Metallkationen, wie Calcium (beispielsweise Alkalimetallsalze von Äthylendiamintetraessigsäure, Diäthylendiaminpentaessigsäure oder Citronensäure, insbesondere das Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure) enthält, wobei der pH-Wert der Pufferlösung 6,5 bis 7,5 beträgt.
Vorzugsweise wird ein Phosphatpuffer verwendet, beispielsweise ein 0,1 m Na2HPO4ZNaH2PO4-PUffer vom pH-Wert 7 oder ein 0,05 m KH2P04/Na0H-Puffer vom pH-Wert 7 und insbesondere ein 0,1 m KH2PO4ZNa2HPO4-PUffer vom pH-Wert 7.
L- 409833/0974 J
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise stabile Suspensionen von Herpesviren der Gruppe B, z.B. Herpesviren des Truthahns, wie Truthahn-Herpesvirus FC-126 und · · Varicella/Zoster-Virus,hergestellt.
Gegenstand der Erfindung sind ferner auch die nach diesem Verfahren hergestellten stabilen Virussuspensionen.
■ Die erfindungsgemäß verwendeten stabilisierenden Zusätze bewirken nicht nur eine Stabilisierung der zellfreien Viren während ihrer Extraktion aus den Zellen, mit denen sie ursprünglich assoziiert sind, sondern auch während der weiteren Lyophilisation und Lagerung. Die erfindungsgemäßen stabilen Suspensionen von lebensfähigen Viren können demgemäß nach üblichen Verfahren zur Herstellung von Vaccinpräparaten zu lebensfähigen, trockenen und lagerstabilen Viruspräparaten lyophilisiert werden.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung anhand eines" Herpesvirus des Truthahns (HVT), der als Stamm
FC-126 bezeichnet wird und die Hinterlegungsnummer ATCC VR 585 hat, und an Hand von Varicella/Zoster-Virus erläutert. Die Erfindung ist aber nicht auf die vorgenannten Viren beschränkt, sondern läßt sich auch auf andere mit Zellen assoziierte Viren anwenden, insbesondere auf andere Herpesviren der Gruppe B, wie Zytomegalieviren.
Beispiel- 1 10 Tage alte Hühnerembryonen, die aus bestimmten pathogenfreien Beständen stammen, v/erden zerkleinert und trypsiniert. Die
409833/0974 J
trypsinierten' Zellen werden gesammelt und in- einem Wuchsraedium zentrifugiert. Das Wuchsmedium besteht aus Earle-Basalmedium, das mit 0,84 g/Liter Glucose, 2,5 g/Liter Lact-' albuminhydrolysat, 1,5 g/Liter Tryptosephosphat-Brühe der Firma Difco-Laboratories und 50 ml/Liter inaktiviertem Kälberserum versetzt ist.
Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen . gesammelt und in dem genannten . Wuchsmedium resuspendiert. In jeweils 5 Liter fassenden Kolben v/erden vier Hühnerembryo-Fibroblastenkulturen hergestellt.
Wenn die einschichtigen Zellkulturen konfluent geworden sind, d.h. nach 2-tägiger Inkubation bei 37 C,-werden die Kulturen unter dem Mikroskop untersucht, und das Wuchsmedium wird durch ein gleiches Volumen eines Erhaltungsmediums ersetzt. Dieses Medium besteht aus Ear.le-Basalmedium, das mit 0,84 g/ Liter Glucose, 2,5 g/Liter Lactalbuminhydrolysat, 0,6 g/Liter Tryptosephosphat-Brühe, 20 ml/Liter inaktiviertem Kälberserum, 5 g/Liter Hydrocortison und Neomycinsulfat (entsprechend 50 mg Neomycinbase pro Liter) versetzt ist.
Die Kolben werden mit dem Truthahn-Herpesvirus (HVT) Stamm FC-126 beimpft und bei 370C inkubiert. Zur Ernte wird die über den Kulturen stehende Flüssigkeit verworfen. Die. infizierten einschichtigen Zellkulturen werden mit einer Trypsin/
TLösung
Natrium-äthylendiamintetraäcetat/ entfernt. Die infizierten Zellen werden gesammelt, zentrifugiert und in vier gleiche Teile
aufgeteilt. Diese Teile, die jeweils dem Material eines KuI-L 409833/0974 -1
turkolbens 'entsprechen, werden in jeweils 10 ml der in Tabelle I angegebenen Stabilisatorlösungen suspendiert. Die erhaltenen Zellsüspensionen v/erden 2 Minuten mit einem mit stärkster Kraft betriebenen Sonicator (Branson Europa Sonicator, Modell
mit Ultraschall
J 22)/behandelt. Ein Teil jeder Probe wird zur Titration verwendet, während der Rest vor der Gefriertrocknung bei -700C gelagert v/ird.
Zur Durchführung der Virustitrationen werden die Proben auf zwei 24-stündige Hühner-Fibroblastenkultüren überimpft, wobei das Inoculum, dessen Volumen 0,1 ml beträgt, auf eine Oberfläche
von 45 cm gebracht wird. Die Verdünnungen v/erden in einem SPG-Medium (Saccharose und Kaliumglutamat enthaltender Phosphatpuffer) hergestellt. Vor der Zugabe des Erhaltungsmediums v/ird das Inoculum 30 Minuten bei 38,50C adsorbiert. Anschließend werden die KuItüren bei 38,50C inkubiert. Nach 4- bis-5-tägiger
(Löcher in Zellblasen)
Inkubation v/erden die Pocalverletzungen / gezählt. Die in Tabelle I angegebenen Ergebnisse stammen aus zwei getrennten Titrationen. Aus dem Durchschnitt der gezählten Foci von zwei getrennten Kulturen und dem Verdünnungsfaktor wird die PFU-Zahl pro ml (plaquebildende Einheiten) bestimmt.
Tabelle I
Stabil! sator Titer nach Ultra
schallbehandlung
(x 10 1 in PPU		 Titer nach Ge
friertrocknung
(x102) in PFU		 Prozent
SPGE +■ A-(1*) 49 22 45
SPGE + K15(1%) 65 24 37
SPGE + K3O(1SS) 64 12 18,5
SPGE + K?0(1tf) 44 6 1,4
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~ 7- . 240616?
SPGE "bedeutet eine wäßrige Lösung vom pH-Wert 7,2, mit 0,218 m Saccharose, 0,0038 m Dikaliumhydrogenphosphatj, 0,0072 m Natriumdihydrogenphosphat, 0,0049 m Mononatriumglutämat und 0,2 Prozent Natrium-äthylendiamintetraacetat.
A bedeutet pulverförmiges Rinderalbumin, K 15 Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 10 000, K 30 Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 40 000 und K 90 Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 360 000. 10
Aus der Tabelle I ergibt sich der Zusammenhang zwischen dem Molekulargewicht und der stabilisierenden Wirkung von Polyvinyl-
. pyrrolidon. Der Einfluß des Molekulargewichts auf die Stabili-
Ultraschallbehandlung sierung des Virus tritt während der / nicht stark hervor, während er während der Gefriertrocknung augenfällig ist.
Bei der Verwendung von Polyvinylpyrrolidon mit einem ausreichend geringen Molekulargewicht wird das Virus sowohl während der
Ultraschallbehandlung
/ als auch wahrend der Gefriertrocknung stabilisiert.
- Zwischen der stabilisierenden Wirkung von Rinderalbumin und K 15 besteht kein signifikanter Unterschied.
Beispiel 2
Hühnerembryonen-Fibroblastenmaterial mit einem hohen Titer wird gemäß Beispiel 1 hergestellt. Aus den in Tabelle II zusammengestellten Ergebnissen geht hervor, daß Polyvinylpyrrolidon K 15 auch eine stabilisierende Wirkung auf Viruspräparationen ausübt,deren Titer 10 bis 20 mal höher als in Beispiel 1 ist.
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-β
In ähnlicher 'Weise wie in Beispiel 1 ergibt sich kein signifikanter Unterschied zwischen der stabilisierenden Wirkung von Rinderalbumin und K 15. Jedoch läßt sich feststellen, daß beim Gefriertrocknen K-30 wiederum weniger wirksam als K 15 oder Rinderalbumin ist. Außerdem geht aus Tabelle II hervor, daß das gefriergetrocknete Material bei der Verwendung sämtlicher angegebener Stabilisatoren auch unter ungünstigen Bedingungen (7 Tage bei 370C) lagerstabil ist. Für die Tabelle II gelten 'die gleichen Erläuterungen wie für Tabelle I.
Tabelle II
Nr. "Stabilisator Titer nach der
Gefriertrock
nung (x103)
in PFU		 Titer nach
7-tägiger La
gerung bei
370C (x1(P)
in PFU		 Prozent
392 SPGE + A 117 59 50
SPGE + K30 57 29 50
393 SPGE + A •132 60 45,5
SPGE + K15 122 59 48
394 SPGE + A 199 88 44
SPGE + K15 218 93 43
Beispiel Kulturen von Menschenembryonen-Lungenfibroblasten (WI 38; 30.Passage) werden in einem 1 Liter fassenden Kolben _■ mit vollständigen Zellen von Embryonen-Lungenfibroblasten, die mit dem Varicella/Zoster-Virus Temple-Stamm
(43. Passage auf V/I 38) infiziert sind, inoculiert. Als Wuchsmedium wird das in Beispiel 1 angegebene Medium verwendet. Die Menge des Inoculums wird so gewählt, daß sie ausreicht, um nach 3-tägiger Inkubation bei 35°C eine nahezu konfluente
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cytopathogene Wirkung hervorzurufen. Anschließend werden die einschichtigen Zellkulturen mit einer Natrium-äthylendiamintetraacetat-Lösung entfernt. Die infizierten Zellen v/erden gesammelt, zentrifugiert und in drei gleiche Teile aufgeteilt.
Diese Teile, die jeweils das Material von drei Kulturkolben darstellen, werden in 30 ml der in Tabelle III angegebenen Stabilisatorlösungen suspendiert. Nach 2-minütiger Behandlung mit dem Sonicator gemäß Beispiel 1. wird die Suspension mit einer 3 u-Membran filtriert. Ein Teil jeder Probe wird zur Titration vor und nach der Behandlung mit dem Sonicator und nach der Filtration verwendet. Zur Virustitration wird jede Probe
zwei
auf/Menschenembryonen-Lungenfibroblastenkultüren überimpft, wo-
bei 0,1 ml Inoculum auf eine Oberfläche von 45 cm gebracht
■ werden und die Verdünnung mit SPG-Medium durchgeführt wird.
Vor der Zugabe des Ear le-Basalmediums, das mit 2 Prozent inak-
wird das Inoculum
tiviertem Kälberserum versetzt ist,/30 Minuten bei 35 C adsorbiert. Nach 4- bis 7-tägiger Inkubation bei 35°C werden die Löcher im Zellrasen gezählt.
Tabelle III
Stabilisator Titer vor der
Ultraschallbe
handlung in
PFU/ml ·		 Titer nach der
Ultraschallbe
handlung in
PFU/ml		 Titer nach der
Filtration in
PFU/inl ' ""
SPGE + K15
SPGE + K30
SPGE + A *		 28 000
30 000
30 000		 600
1 000
1 000 ■		 ND
ND
1 000
*) Humarialbumin.
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die Eigenschaften von Polyvinylpyrrolidon mit denen von Humanalbumin vergleichbar sind.
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' · Beispiel '4.
Das gemäß Beispiel 2 erhaltene, mit dem Sonicator behandelte,-zellfreie Material wird in 3 ml fassende Glasampullen gefüllt, wobei jede Ampulle 0,5 ml des zellfreien Materials (entsprechend 250 bis 1000 Dosen der Marek-Krankheit-Vaccine) enthält.
Nach dem Gefriertrocknen werden die Ampullen verschlossen und
Wiederherstellung bei -200C gelagert. Zur / wird dieses Produkt mit der folgenden Stabilisatorlösung versetzt: 74,6 g Saccharose, 0,52 g Dikaliumhydrogenphosphat, 1 g Natriumdihydrogenphosphat und 0,8 g rionokaliumglutamat mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Es werden Impfstoffpräparate mit einem Volumen von 0,2 ml/Dosis hergestellt und intramuskulär oder subcutan verabfolgt.
Beispiel5
Das gemäß Beispiel 3 erhaltene,' mit dem Sonicator behandelte zellfreie Material wird in 3 ml fassende Glasampullen abgefüllt. Jede Ampulle enthält 0,5 ml des zellfreien Materials (entsprechend einer Impfstoff-Dosiseinheit). Nach dem Gefriertrocknen v/erden die Ampullen verschlossen und bei -20°C gelagert.
Wiederherstellung '
Zur / werden pro Dosis· 0,5 ml pyrogenfreies, destilliertes Wasser zugesetzt. Der so erhaltene Varicella /Zoster--Virus-Impfstoff wird parenteral verabfolgt.
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Claims (11)

  1. _. n - 240616?
    Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen von lebensfähigen Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension von mit einem zeilassoziierten Virus infizierten Zellen vor dem Aufbrechen der Zellen mit einer stabilisierenden wäßrigen Pufferlösung versetzt, ■ die 0,1 bis 10·Prozent Polyvinylpyrrolidon mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht bis 40 000, 2 bis 10 Prozent eines Stärkederivats, 0,05 bis 0,2 Prozent eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes der Glutaminsäure und 0,1 bis 0,5 Prozent eines Chelatbildners für zweiwertige Metallkationen enthält, wobei der pH-Wert der Pufferlösung 6,5 bis 7,5 beträgt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Polyvinylpyrrolidon mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10 000 bis 30 000 verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stärkederivat Saccharose verwendet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz der Glutaminsäure das Natriumsalz verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner ein Alkalimetallsalz Von Äthylendiamintetraessigsäure verwendet.
    >L 409833/0974
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pufferlösung einen Phosphatpuffer verwendet.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als zellassoziierten Virus einen Herpesvirus der Gruppe B verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als zellassoziierten Virus eine η Herpesvirus des Truthahns verwendet.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Truthahn-Herpesvirus FC-126 verwendet.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
    daß man den Varicella/Zoster-Virus verwendet.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Virussuspension zusätzlich lyophilisiert.
    409833/0974
DE2406167A 1973-02-09 1974-02-08 Verfahren zur Herstellung von stabilen Suspensionen lebensfähiger Viren Expired DE2406167C2 (de)

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