DE69109886T2

DE69109886T2 - Verfahren zur Herstellung von humanem Faktor VIII und dessen Analogen.

Info

Publication number: DE69109886T2
Application number: DE69109886T
Authority: DE
Inventors: Philippe Adamowicz; Nicolas Bihoreau; Gerard Mignot
Original assignee: TM Innovation
Current assignee: TM Innovation
Priority date: 1990-02-05
Filing date: 1991-02-05
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2011-02-06
Also published as: US5707832A; GR3017201T3; FR2657884A1; DK0441695T3; FR2657884B1; JPH06113879A; ATE123069T1; ES2075378T3; CA2035691A1; US5422250A; DE69109886D1; EP0441695A1; EP0441695B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Human-Faktors VIII und von Analoga des Faktors VIII.
Der Faktor VIII ist ein Blutgerinnungsfaktor, der für die Behandlung von Patienten verwendet wird, die unter der Hämophilie A leiden.
Der Faktor VIII, der bei dieser Behandlung verwendet wird, besteht derzeit im wesentlichen aus Konzentraten des Faktors VIII, die durch Fraktionierung aus Human-Plasma erhalten werden. Seither hat man versucht, diese Quelle für den Faktor VIII durch eine leichter zugängliche und Viren-Kontaminationen oder anderen Kontaminationen weniger ausgesetzte Quellen zu ersetzen, wehalb eine beachtliche Anstrengung unternommen wurde, um den Faktor VIII auf gentechnischem Wege zu erhalten. Die derzeit erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Rekombinations-Faktor VIII alle Eigenschaften des natürlichen Faktors VIII aufweist und daß er unter industriell sehr zufriedenstellenden Bedingungen erhalten werden kann.
Die Herstellung des Faktors VIII nach Verfahren, bei denen die Gentechnik eingesetzt wird, ist bereits in sehr großem Umfange beschrieben worden, insbesondere in den Patenten EP-A-162 067, EP-A-182 448, EP-A-150 735, EP-A-157 556 und EP-A-160 457.
Insbesondere in dem Patent EP-A-162 067 ist die Expression des Faktors VIII in verschiedenen Typen von Eukaryontenzellen, insbesondere CHO-Zellen, beschrieben.
Auch in dem Patent EP-A-160 457 ist die Expression des Faktors VIII in Eukaryontenzellen, insbesondere in BHK-Zellen, beschrieben.
In den Patenten FR-A-86 08258 und FR-A-87 04699 ist die Herstellung des Faktors VIII unter Verwendung von Eukaryontenzellen und des Vaccinevirus als Expressionssystem beschrieben. Um eine optimale Bildung des Faktors VIII zu erzielen, enthält das Kulturmedium den Von Willebrand-Faktor.
In dem Patent EP-A-253 455 wird auch vorgeschlagen, als Eukaryontenzellen Hefen für die Herstellung des Faktors VIII zu verwenden.
Es wurden bereits zahlreiche Analoga zu dem Faktor VIII vorgeschlagen. Unter den Patenten, in denen diese Derivate behandelt sind, können insbesondere genannt werden WO-A-86 06101, EP-A-232 112, WO-A-87 07144, WO-A-88 00381, EP-A-265 778, EP-A-294 910 und EP-A-303 540.
Diese Analoga des Faktors VIII weisen verschiedene Vorteile gegenüber dem "natürlichen Faktor VIII" auf und können wie dieser durch gentechnische Methoden erhalten werden.
In den derzeit angewendeten Verfahren werden vorzugsweise Eukaryontenzellen verwendet, die den Faktor VIII exprimieren, bei denen es sich entweder um Zellen, die eine oder inehrere codierende Seguenzen für den Faktor VIII im Chromosomen-Bereich integriert haben, oder um Zellen handelt, denen Virus-Vektoren einverleibt worden sind, die den Faktor VIII exprimieren.
Dieser Technologie-Typ ist in den obengenannten Patenten ausführlich beschrieben und braucht hier im Detail nicht erneut beschrieben zu werden. Es werden einfach Zellen genannt, die den Faktor VIII oder ein Analogon des Faktors VIII exprimieren.
Unter einem Analogon des Faktors VIII ist ein Molekül zu verstehen, das die Aktivität des Faktors VIII hat und durch Deletion bestimmter Aminosäuren aus dem Faktor VIII erhalten wird, oder auch ein Molekül des Faktors VIII, das bestimmte potentielle Mutationen erlitten hat, das jedoch dennoch die Hauptaktivität des Faktors VIII beibehält.
In dem Dokument EP-A-53 046 ist ein Verfahren zur Stabilisierung der Aktivität des Faktors VIII in frischem Blutplasma beschrieben, das gerade gesammelt worden ist, durch Zugabe eines chelatbildenden Antikoagulationsmittels von Calcium und von gelöstem Heparin in einer Menge in der Größenordnung von 2 bis 20 Einheiten pro ml für Heparin und in der Weise, daß die Konzentration an freien Calciumionen etwa 5 mg Calcium auf 100 ml Plasma beträgt.
Darüber hinaus ist in dem Dokument EP-A-98 256 ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII:C aus Blutplasma beschrieben, das umfaßt die Fraktionierung des Blutplasmas unter Anwendung von Adsorptionsstufen, wobei man zwei verschiedene, in Wasser unlösliche vernetzte Polyelektrolyt-Copolymere verwendet, von denen jedes jeweils in Gegenwart von exogenem Heparin zugegeben wird.
Wie in den Patenten WO-87 04 187, FR-A-86 08 258 und FR-A-87 04 699 beschrieben, kann es vorteilhaft sein, zur Optimierung der Herstellung des Faktors VIII oder eines Analogons des Faktors VIII die Zugabe des Von Willebrand- Faktors oder auch eines Phospholipids zu dem Zellen-Kulturmedium vorzusehen.
Es wurde nämlich gezeigt, daß die Anwesenheit dieses Von Willebrand-Faktors in dem Kulturmedium die Stabilisierung des Faktors VIII und die beträchtliche Verbesserung der Ausbeute erlaubte.
Aus ähnlichen Gründen wie den bereits genannten, ist der verwendete Von Willebrand-Faktor selbstverständlich ein rekombinanter Von Willebrand-Faktor, um jedes Risiko einer Kontamination zu vermeiden. Dies erfordert die Durchführung einer zusätzlichen Herstellungsstufe und bringt eine Erhöhung der Kosten des Verfahrens zur Herstellung des Faktors VIII, insbesondere praktisch eine Verdoppelung des Preises, mit sich.
Es wäre daher von Vorteil (interessant), über ein Verfahren zur Herstellung des Faktors VIII zu verfügen, das nicht die Verwendung des Von Willebrand-Faktors erfordert und trotzdem zu beträchtlichen Ausbeuten an dem Faktor VIII führt.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Lösung dieses Problems vorzuschlagen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung des Faktors VIII oder eines Analogons des Faktors VIII durch Kultivierung von Eukaryontenzellen, denen ein Expressionsvektor einverleibt worden ist, der ein Gen enthält, das für den genannten Faktor VIII oder ein Analogon des Faktors VIII codiert, und Abtrennung des Faktors VIII oder seines Analogons, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturmedium mindestens ein Derivat eines polysulfatierten polyanionischen Polymers enthält und frei von Serum ist.
Unter den Analoga des Faktors VIII sind insbesondere zu nennen der Faktor VIII Delta 2, der einer Deletion der dessen Herstellung insbesondere in dem Patent EP 303 540 beschrieben ist.
Die erfindungsgemäßen Polymeren sind vorzugsweise Derivate von Polyosid-Polymeren, insbesondere Polysacchariden.
Dieser Polymer-Typ ist-bekannt, es handelt sich dabei insbesondere um Produkte, die durch bakterielle Fermentation beispielsweise von auf chemischem Wege sulfatiertem Dextran erhalten wurden, oder es kann sich dabei auch handeln um in natürlicher Weise sulfatierte Extraktionsprodukte, wie die Mucopolysaccharide vom Heparin-Typ, Heparin mit einem niedrigen Molekulargewicht oder Heparinoide, Heparansulfat, Dermatansulfat.
Das Hydroxyethylsulfat von Stärke kann ebenfalls als Polymer verwendet werden.
Diese Verbindungen sind insbesondere interessant (vorteilhaft) wegen ihrer geringen Kosten und ihrer leichten Verfügbarkeit.
Das erfindungsgemäß verwendete Polymer hat ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 1 000 000.
Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Polymer ein sulfatiertes Dextran. Der Grad der Sulfatierung dieses sulfatierten Dextrans liegt in der Größenordnung von 0,5 bis etwa 18 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis etwa 18 Gew.-% Schwefel.
Erfindungsgemäß können sulfatierte Dextrane mit unterschiedlichem Molekulargewicht verwendet werden. Ihr Molekulargewicht kann variieren von 5000 bis 700 000 Dalton.
Die Anwesenheit eines erfindungsgemäßen polyanionischen Polymers in einem Kulturmedium, das für die Bildung des Faktors VIII oder des Analogons des Faktors VIII geeignet ist und frei von dem Von Willebrand-Faktor ist, führt somit zu Ausbeuten an dem Faktor VIII oder dem Analogon des Faktors VIII, die deutlich höher sind als diejenigen, die in einem Medium erhalten werden, das weder den Von Willebrand-Faktor noch das erfindungsgemäße Polymer enthält.
Aus Versuchen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wurden und in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, geht somit hervor, daß es möglich ist, ausgehend von einem Kulturmedium auf Basis von sulfatiertem Dextran mit einem Molekulargewicht von 500 000, beträchtliche Ausbeuten an dem Faktor VIII Delta 2 zu erzielen, bestimmt nach zwei unterschiedlichen Verfahren, von denen eines auf einer immunoenzymatischen Methode beruht, bei dem man monoklonale Anti-Faktor VIII-Antikörper einsetzt, und das andere auf einer physikalisch-chemischen Methode beruht, beispielsweise der Analyse durch PAGE-SDS unter reduzierenden Bedingungen, oder bei denen man keine Hauptbande bei 165 KDa nachweist, welche die Hauptform des Faktors VIII Delta 2 repräsentiert, der in Abwesenheit von Kalbsserum exprimiert wurde.
Molekulargewichte von 5000, 8000, 15 000, 50 000, 500 000 Da haben zu Ergebnissen geführt, die im wesentlichen äquivalent zur Expression des Faktors VIII sind.
Das Kulturmedium, das durch ein polyanionisches Polymer ergänzt worden ist, kann selbstverständlich auch andere Agentien enthalten, welche die Bildung des Faktors VIII fördern können. Es kann sich dabei um Antiprotease- Agentien und/oder um Calciumchlorid, die für ihre stabilisierenden Eigenschaften bekannt sind, handeln.
Unter diesen Bedingungen wurde gezeigt, daß für ein Kulturmedium, das mit 1000 mg/l sulfatiertem Dextran und 2 mmol Calciumchlorid (1 mM in dem Basis-Medium + 1 mM hinzugefügt) ergänzt worden ist, es möglich ist, innerhalb von 24 h Mengen an dem Faktor VIII Delta 2 anzureichern die, gemessen unter Anwendung eines immunoenzymatischen Verfahrens, 6 bis 7 mal höher sind als die Menge, die in Abwesenheit des exogenen Von Willebrand-Faktors angereichert wird.
Das vollständige Molekül des Faktors VIII oder das Molekül des Faktors VIII, aus dem die Region B deletiert worden ist, hat die Besonderheit, daß es sehr hohe, sehr nahe beieinanderliegende Ladungsdichten aufweist, die positiv und negativ geladene Pole schaffen, die sich durch Coulomb-Kräfte (Wechselwirkungen vom ionischen Typ) an Polyanionen bzw. Polykationen binden können. Die günstige Wirkung des sulfatieften Dextrans auf die Bildung des Faktors VIII kann erklärt werden durch das Vorhandensein solcher Wechselwirkungen zwischen den Sulfatgruppen des Dextrans und den basischen Aminosäuren des Faktors VIII. Diese Stabilisierung des vollständigen oder deletierten Moleküls des Faktors VIII ist außerdem zurückzuführen auf eine Erhöhung des Gehaltes an Expression des Faktors VIII oder Derivat des Faktors VIII.
Es tritt wahrscheinlich die Bildung eines Komplexes zwischen dem vollständigen oder deletierten Molekül des Faktors VIII und mindestens einem der Moleküle des in dem Kulturmedium eingesetzten polyanionischen Derivats auf.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf diese komplexe Form des Faktors VIII oder des Derivats des Faktors VIII.
Diese stabilisierte Form des Faktors VIII oder eines seiner Derivate kann von großem Vorteil sein, insbesondere für die Lagerung des genannten Faktors VIII oder des Derivats des Faktors VIII im Verlaufe des Herstellungsverfahrens oder am Ende desselben. Darüber hinaus kann man, wenn der Faktor VIII oder eines seiner Derivate an sulfatiertes Dextran komplex gebunden ist, das ein Lyophilisierungsmittel darstellt, erwarten, daß der auf diese Weise gebildete Komplex sich ebenfalls für die Lyophilisierung gut eignet.
Die Anwesenheit von sulfatiertem Dextran kann somit sowohl eine stabilisierende Wirkung gegenüber dem Faktor VIII als auch eine stimulierende Wirkung auf die Expression des Faktors VIII durch Wechselwirkung im Bereich der Zellmembranen mit sich bringen.
Das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium ist ein Kulturmedium ohne Serum, vorzugsweise insbesondere auf Basis von rekombinantem Human-Insulin, das andere (weitere) exogene Proteine enthalten kann.
Diese Proteine werden vorzugsweise in einer Konzentration in der Größenordnung von 4 mg/l verwendet.
Die für die Bildung des Faktors VIII oder des Analogons des Faktors VIII verwendeten Zellen sind vorzugsweise Säugetierzellen und insbesondere rekombinierte CHO-Zellen, die den Faktor VIII oder das Analogon des Faktors VIII auf permanente Weise exprimieren.
Diese Zellen werden durch einen Integrations-Vektor transfektiert, der die cDNA des Faktors VIII oder des Derivats des Faktors VIII enthält, der von den zu seiner Expression in den Eukaryontenzellen erforderlichen Elementen und von einem Abschnitt der DNA, welche die Integration des Vektors in die zelluläre DNA fördert, umgeben ist. Es ist auf diese Weise möglich, als Expressionsvektor des Faktors VIII das pTG 1020 und des Faktors VIII Delta 2 das pTG 1509 zu verwenden, die in dem Patent EP 0 303 540 ebenso wie die Expressionsvektoren von äquivalenten Konstruktionen beschrieben sind. Die Stämme der Plasmide pTG 1509 und pTG 1020 wurden unter der Nr. 1-679 und unter der Nr. 1-681 bei der Collection Nationale de Culture des Microorganismes hinterlegt.
Die Transfektion der CHO-Zellen durch diese Integrations-Vektoren erfolgt nach dem Verfahren, wie es in dem Patent EP 0 303 540 beschrieben ist und das hier nicht wiederholt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist somit zahlreiche Vorteile auf.
Es erlaubt die Herstellung des Faktors VIII oder des Analogons des Faktors VIII auf gentechnischem Wege mit einer optimierten Ausbeute.
Es erlaubt das Weg lassen des Von Willebrand-Faktors in dem Kulturmedium und führt dadurch zu einem beträchtlichen Zeitgewinn und zu beträchtlich niedrigeren Kosten für die industrielle Herstellung des Faktors VIII oder des Analogons des Faktors VIII.
Schließlich bringen bestimmte Polymer-Typen, die erfindungsgemäß verwendet werden, wie Dextransulfat, keinerlei Risiko einer Viruskontamination oder anderer Kontaminationen mit sich-und es ist einfach und leicht zugänglich für den Fachmann.
Weitere Vorteile und Charakteristika der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachfolgenden Beispielen hervor, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist,

Experimenteller Teil

Die Untersuchungen der Wirkungen der sulfatierten Pölyosid-Polymeren einerseits auf die Expression des Faktors VIII Delta 2 wurden durchgeführt unter Verwendung des Klons CHO TG2307-11-3 (Beispiele 1 bis 4) und andererseits auf die Expression des vollständigen Faktors VIII unter Verwendung des Klons CHO TG1566-3013 (Beispiele 5 und 6).

Beispiel 1

Untersuchung der Wirkungen von Dextran T 2000 auf die Expression des Faktors VIII Delta 2

Innerhalb eines ersten Bezugs-Zeitraums wurden die Wirkungen von Dextran T2000 (PHARMACIA MG: 2 000 000 Da) bewertet. In der nachstehenden Tabelle 1 sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt im Vergleich zu einem Medium, das 2 U/ml rekombinanten Von Willebrand-Faktor enthält.
Das Dextran, T2000 (nicht sulfatiert) ist ohne Wirkungen auf die Expression des Faktors VIII Delta 2 in Abwesenheit von Serum und rekombinantem Von Willebrand-Faktor.
Infolgedessen stört die Dextran-Matrix, die aus unsubstituierten Glucopyranosil-Einheiten besteht, das Molekül des Faktors VIII Delta 2 nicht. Tabelle 1 Untersuchung der Wirkungen der Zugabe von Dextran T 2000 zu Medien für die Bildung des Faktors VIII Delta 2 Klon CHO TG 2307-11-3 Produktions-Medien Mittelwert DEXTRAN T2000
Fußnoten:
Durchgang P15 nach dem Auftauen und P12 innerhalb des MEM HT-Wachstums (37) und Versuche zur Produktion (35C) unter Austausch des Mediums alle 24 h
Human-INS ELI LILLY 319KK9B
Dextran T 2000 (PHARMACIA): Molekulargewicht (MG) 2 000 000 Da

Beispiel 2

Untersuchung der Wirkungen von sulfatierten Polymeren auf die Expression des Faktors VIII Delta 2

1) Sulfatiertes Dextran

Es wurde eine wirksame Dosis des sulfatierten Dextrans (PHARMACIA MG:500 000) verabreicht. In der nachstehend angegebenen Tabelle 2 sind auch die Daten berücksichtigt, die mit dem gleichen Medium erhalten werden, das 2 Einheiten des rekombinanten Von Willebrand-Faktors enthält.
Unter diesen Bedingungen ist es möglich, in einem Produktionscyclus, der vom dritten bis zum sechsten Tag dauert, unter täglicher Erneuerung des Mediums, in einer der Inkubationsperioden (vom fünften bis zum sechsten Tag) Mengen an dem Faktor VIII Delta 2, gemessen durch ELISA, zu erhalten, die höchstens 2/3 der angereicherten Aktivitäten in Gegenwart von 2 Einheiten/ml rekombinantem Von Willebrand-Faktor entsprechen.
Diese Aktivitäten repräsentieren außerdem etwas das 2- bis 3-fache der Aktivitäten, die in einem Medium erhalten werden, das weder den rekombinanten Von Willebrand- Faktor noch sulfatiertes Dextran enthält, und dies in Abwesenheit von Phospholipiden.

2) Rinder-Heparin (KABI VITRUM)

Die Ergebnisse einer Untersuchung einer wirksamen Dosis Rinderheparin sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt.
Über die ersten Produktionszyklen zeigt das Heparin eine sehr begrenzte Wirkung von sogar 0 auf die Expression des Faktors VIII Delta 2. Über den letzten Inkubationstag JJ5-J6 kann eine sehr geringe Dosis-Wirkungs-Relation nachgewiesen werden. Tabelle 2 Untersuchung der Wirkungen der Zugabe von Dextransulfat zu Produktionsmedien für den Faktor VIII Delta 2 Klon CHO TG2307-11-3 Produktionsmedien
Durchgang P24 nach dem Auftauen und P21 innerhalb des MEM HT SVF ND 701121-Wachstums (37) und Produktionsversuche (35C) in Platten mit 6 Vertiefungen NUNC bei einem Wechsel des Mediums alle 24 h
Human-INS ELI LILLY 319KK96
Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
DS: Dextransulfat MG 500 000 PHARMACIA 17 % S
ND = nicht dosierbar aufgrund des Antikoagulationsvermögens des Sulfatdextrans Tabelle 3 Untersuchung der Wirkungen der Zugabe von Rinder-Heparin zu den Produktionsmedien für den Faktor VIII Delta 2 Klon CHO TG2307-11-3 Produktionsmedien
Durchgang P24 nach dem Auftauen und P21 innerhalb des MEM HT SVF MD 701121-Wachstums (37) und Produktionsversuche (35C) in Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
Austausch des Mediums alle 24 h
Human-INS ELI LILLY 319KK9B
Rinderheparin KABI VITRUM
ND = nicht dosierbar aufgrund des Antikoagulationsvermögens von Heparin

Beispiel 3

Es wurden auch die Wirkungen einer Kombination von sulfatiertem Dextran und Calciumchlorid auf die Expressionsgrade des Faktors VIII Delta 2 bewertet im Vergleich zu Vergleichs-Medien, die entweder 10 % Kalbsfötusserum oder 2 U/ml Von Willebrand-Faktor oder nur Human-Insulin enthalten, das in der Zusammensetzung aller in dem Versuch verwendeten serumfreien Medien enthalten ist.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 dargestellt.
Daraus geht hervor, daß für die Punkte, die nahe bei dem Optimum liegen, d.h. 1000 mg/ml sulfatiertes Dextran und 2 mM Calciumchlorid (1 mM in dem Basis-Medium + 1 mM hinzugegeben), es möglich ist, innerhalb von 24 h zwischen 20 und 21 Antigen-Einheiten des Faktors VIII Delta 2 entsprechend etwa 2/3 der in Gegenwart von zwei Einheiten des rekombinanten Von Willebrand-Faktors (2 U/ml) angereichterten Menge und dem 6- bis 7-fachen der in Abwesenheit von fötalem Kalbsserum oder des Von Willebrand- Faktors angereicherten Menge anzureichern.
Es ist auch festzustellen, daß in Abwesenheit von fötalem Kalbsserum oder des rekombinanten Von Willebrand- Faktors die innerhalb von 24 h angereicherten Aktivitäten niemals 3 Einheiten/ml übersteigen und im Mittel 2,27 Einheiten/ml betragen, somit signifikant niedriger sind als die in Gegenwart von optimalen Mengen von sulfatiertem Dextran angereichten Aktivitäten. Tabelle 4 Untersuchung der Wirkungen der Zugabe von Dextransulfat zu Produktionsmedien für den Faktor VIII Delta 2 Klon CHO TG2307-11-3 Doehlert-Dextransulfat (0-2000 mg/l)/CHCl&sub2; (2-11 mM) Produktionsmedien
Fußnoten:
Durchgang P24 nach dem Auftauen und P21 innerhalb des MEM HT SVF MD 701121-Wachstums (37) und Produktionsversuche (35C) in Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
Wechsel des Mediums alle 24 h
Human-INS ELI LILLY 319KK9B
Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
DS = Dextransulfat, MG 500 000, PHARMACIA 17 % -Mittelwert von 6 Vertiefungen (BO) andere Mittelwerte von zwei Vertiefungen
ELISA J3-J4 durchgeführt 24 h nach jeder Entnahme
ND: nicht dosierbar wegen des Antikoagulationsvermögens von Dextransulfat Tabelle 5 Untersuchung der Wirkungen der Zugabe von Sulfatpolymeren zu den Produktionsmedien des Faktors VIII Delta 2 Klon CHO TG2307-11-3 Wirkungen von Hydroxymethylstärkesulfaten mit einem MG von 200 000 Da auf 3,76 % und 13,1 % DE S und Carboxymethylcellulose mit niedriger Viskosität, SIGMA Produktionsmedien
Fußnoten:
Durchgang P19 nach dem Auftauen und P18 innerhalb des MEM HT SVF ND 701121-Wachstums (37) und Produktionsversuche (35C) in Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
Wechsel des Mediums alle 24 h
Human-INS ELI LILLY 319KK9B
Platten mit 6 Vertiefungen NUNC
Hydroxymethylstärkesulfat, MG 200 000, PFEIFER und LANGEN, 3,76 und 13,1 % S
VWFrec CNTS-Konzentrat mit 63,7 U/ml vom 11/12/89
ND: nicht dosierbar wegen des Antikoagulationsvermögen der sulfatierten Polymeren
ELISA von J4-J5: Inkubation Ag 14 h bei +20 ºC

Beispiel 4

Es wurden andere Polymer und insbesondere Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylstärkesulfat (MG 200 000) mit 3,76 und 13,1 % Schwefel bewertet anhand ihrer Fähigkeit, den Grad der Expression des Faktors VIII Delta 2 in einem Medium ohne Serum und ohne den Von Willebrand-Faktor zu beeinflussen, und dies bezogen auf Vergleichsproben, die 10 % Rinderserum, 2 Einheiten/ml rekombinanten Von Willebrand-Faktor oder weder Serum noch Von Willebrand- Faktor enthalten.
Die Carboxymethylcellulose hat bei den getesteten Konzentrationen keine ausgeprägten Wirkungen auf die Expression des Faktors VIII Delta 2, während das Hydroxyethylstärkesulfat mit 13 % Schwefel bei Konzentrationen von 0,5 und 1,0 g/l die Anreicherung von bis zu etwa 20 Einheiten C:Ag/ml Faktor VIII Delta 2 innerhalb von 24 h entsprechend etwa 2/3 der Menge, die erhalten wird innerhalb der gleichen Zeit in Gegenwart von 2 Einheiten/ml rekombinantem Von Willebrand-Faktor, erlaubt. Das gleiche Polymer, das nur 3,76 % Schwefel enthält, hat eine deutlich weniger ausgeprägte Wirkung auf die Expression des Faktors VIII Delta 2. Dieser Versuch bestätigt den Vorteil der sulfatierten Polysaccharide und zeigt die Bedeutung des Sulfatierungsgrades auf die Wechselwirkung der Polymeren mit dem Molekül des Faktors VIII Delta 2.

Beispiel 5

Untersuchung der Wirkungen von sulfatiertem Dextran auf die Expression des Faktors VIII

Die Untersuchung wird durchgeführt unter Verwendung des Klons CHO TG 1566-3013, der das Molekül des vollständigen Faktors VIII exprimiert.
Die Fig. 1 zeigt das Vorhandensein einer Dosiswirkung des sulfatierten Dextrans (Pharmacia MG: 500 000) auf die Expression des Faktors VIII in Platten mit 6 Vertiefungen.
Man stellt fest, daß nach 2-tägiger Produktion J4-J5 und J5-J6 die Produktion des Faktors VIII auf signifikante Weise erhöht ist, bezogen auf einen Vergleich ohne sulfatiertes Dextran. Eine Schwelle wird bei 500 mg/l sulfatiertem Dextran erreicht.

Beispiel 6

Vergleich der Wirkungen von VWF und sulfatiertem Dextran (MG: 50 000) auf die Expression des Faktors VIII in einem chemisch definierten Medium

Diese Untersuchung wird in einem 1 l-Biogenerator (SGI) durchgeführt. Der Klon CHO TG 1566-3013, der den vollständigen Faktor VIII exprimiert, wird auf dem Träger Cultispher-G in einer Konzentration von 4 g/l (mikroporöse Kugeln aus vernetzter Rindergelatine) kultiviert.
Nach einer Wachstumsphase von 4 Tagen in einen Iscove-Medium, das 5 % SVF enthält, untersucht man den Einfluß von drei unterschiedlichen Produktionsmedien:
- ein Medium, das 5 % SVF und weder VWF noch sulfatiertes Dextran enthält (Medium A),
- ein Medium ohne SVF, das 1 UI VWF/ml enthält (Medium B)
- ein Medium ohne VWF und ohne SVF, das 200 mg/l sulftiertes Dextran (MG 50 000) enthält (Medium C).
Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt.
Die Aktivität an dem Faktor VIII ist ausgedrückt in Einheiten APTT/1 Medium in einem Medium, das kein sulfatiertes Dextran enthält, und in der Einheiten Cag in einem Medium, das sulfatiertes Dextran enthält (ELISA-Dosierung). Das Verhältnis zwischen den ATPP-Dosierungen und den ELISA-Dosierungen liegt in der Größenordnung von 1,2 bis 1,4.
Man stellt fest, daß die in dem Medium B erhaltenen Produktionen höher sind als diejenigen, die in dem Medium A erhalten wurden (680 67 U APTT/l gegenüber 502 96 U APTT/l). Die in dem Medium C erhaltenen Produktionen sind vergleichbar mit denjenigen, die in dem Medium B erhalten wurden.
Zusammenfassend wurde eindeutig gezeigt, daß das sulfatierte Dextran den Von Willebrand-Faktor ersetzen kann zur Erhöhung der Expression des Faktors VIII in einem chemisch definierten Medium.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung des Faktors VIII oder eines Analogons des Faktors VIII durch Kultivierung von Eukaryontenzellen, denen ein Expressionsvektor einverleibt worden ist, der ein Gen enthält, das für den genannten Faktor VIII oder ein Analogon des Faktors VIII codiert, und Abtrennung des Faktors VIII oder seines Analogons, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mindestens ein Derivat eines polysulfatierten polyanionischen Polymers enthält und frei von Serum ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Polyosid-Polymer ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Polysaccharidderivat ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein sulfatiertes Polysaccharid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polysulfatierte Derivat vorzugsweise ausgwählt wird aus der Gruppe Heparin, sulfatiertes Dextran und Hydroxyethylstärkesulfat.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 1 000 000 hat.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein sulfatiertes Dextran mit einem Molekulargewicht zwischen 5000 und 700 000 und einem Sulfatierungsgrad von 0,5 bis 18 Gew.-% Schwefel handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatierte Dextran vorzugsweise einen Sulfatierungsgrad von 10 bis 18 % aufweist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Analogon des Faktors VIII der Faktor VIII Delta 2 ist.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in der Kultur Säugetierzellen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in der Kultur rekombinierte CHO-Zellen sind, die das Molekül des Faktors VIII oder des Analogons des Faktors VIII auf permanente Weise exprimieren.