DE2349738C3

DE2349738C3 - Wäßriger Plasmaersatz

Info

Publication number: DE2349738C3
Application number: DE2349738A
Authority: DE
Inventors: Jacques Pierre West Caldwell N.J. Vandevoorde
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1972-10-13
Filing date: 1973-10-03
Publication date: 1981-06-19
Also published as: BE805991A; IL43378A; DE2349738B2; NL161884B; IT1001584B; SE417460B; ZA723264B; AU467511B2; ZA737693B; AU6124273A; DD108151A5; CA1012458A; FR2203525A5; DE2349738A1; JPS4971133A; GB1423244A; NL7314093A; JPS5315130B2; NL161884C; IL43378A0

Description

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine Pufferlösung zu schaffen, die als Ersatz tür Plasmaextrakt der Blutgruppe vom Typ A⁺ verwendet werden kann und die νση Wert ist als Verdünnungsmittel zur Aufnahme von Antiserum-Titrationskurven und von Standard-Antigen-Inhibitionskurven, wie sie zur Messung von im menschlichen Blut zirkulierendem carcinoembryonischem Antigen (CEA) gebraucht werden. Die Aufnahme der Kurven und der Test für CEA sind z. B. in den belgischen Patentschriften 767800 und 767801 beschrieben.

Die Aufgabe wird gelöst durch einen wäßrigen Plasmaersatz mit einem pH von ungefähr 6,5, der gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Alkalimetallsalz einer organischen Säure in einer Menge, die derjenigen von ungefähr 1,3 g/l Dinatriumäthylendiamin-tetraacetatdihydrat äquivalent ist, einem das Wachstum von Mikroorganismen hemmenden Konservierungsmittel und einem Alkalimetallhydroxid, wobei das Alkalimetall im Alkalimetallsalz dasselbe ist wie im Alkalimetallhydroxyd.

Der Plasmaersatz kann gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung auch als Konzentrat vorliegen, aus dem durch Verdünnung mit entionisiertem oder destilliertem Wasser eine Lösung, wie im vorstehenden Absatz beschrieben, hergestellt werden kann. Dieses Konzentrat mit einem pH von ungefähr 6,25 ist vorzugsweise gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Alkalimetallsalz einer organischen Säure in einer Menge, die derjenigen von ungefähr 13 g/l Dinatrium-äthylendiamin-tetraacetat-dihydrat äquivalent ist, einem das Wachstum von Mikroorganismen hemmenden Konservierungsmittel und einem Alkalimetallhydroxyd, dessen Alkalimetall das gleiche ist wie in dem Alkalimetallsalz. Konzentration und Mengen an Ingredienzien sowie der pH-Wert lassen sich so einstellen, daß die Titra-

tions-Kurven praktisch mit denjenigen identisch sind, die mit Plasmaextrakt aus der Blutgruppe vom Typ A⁺ erhalten werden. Dieselbe Pufferlösung kann als Plasmaextraktersatz zur Aufnahme sowohl der einen wie der anderen der obengenannten Kurven verwendet werden.

Die Konzentration der organischen Säure ist abhängig von deren pK-Bereich. Im allgemeinen kommt ein pK von ca. 5-6 in Frage. Dieser Bereich umfaßt die pK-Werte von mehrbasischen Säuren. Für die

is Zwecke dieser Erfindung sind jedoch nur die pK,- und pK₂-Werte von Bedeutung. Ein bevorzugter ρΚ,-Wert liegt im Bereich von ca. 2—3. Andere Kriterien zur Wahl geeigneter organischer Säuren sind die Wasserlöslichkeit ihrer Alkalimetallsalze und die Lage des pH der Lösung auf der sauren Seite annähernd beim Neutralpunkt. Typische geeignete Säuren sind die Tetraessigsäureverbindungen, im besonderen Äthyiendiamin-tetraessigsäure, weiche ein pK, von 2,0 und ein pKj von 2,7 hat. Auch andere ähnliche organische Säuren kommen in Frage, z. B. Diäthylentriamin-pentaessigsäure.

Bevorzugte Alkalimetallsalze sind die Dinatrium- und Dikaliumsalze.

Die Konzentration der organischen Säure soll wie

ω gesagt derjenigen von ungefähr 13 g/l Dinatrium-EDTA äquivalent sein, beispielsweise von 1,28 bis 1,32 g/I, wobei unter Dinatrium-EDTA das Dinatriumsalz von Äthyiendiamin-tetraessigsäure mit zwei Molekülen Hydratationswasser bezeichnet werden soll.

Da CEA die Tendenz hat, an Glas und anderen Materialien zu haften, kann dem Plasmaersatz mit Vorteil eine kleine Menge eines proteinischen Materials zum Schütze des Glases bzw. der anderen Materialien zugesetzt werden. Das proteinische Material muß mit Bezug auf die bei der Aufnehme der Kurven sich abspielenden Antikörper-Antigen-Reaktionen inert sein. Ein typisches, geeignetes proteinisches Material ist Rinderserumalbumin. Dieses ist im Handel als 30%ige wäßrige Lösung erhältlich und wird zweckmäßig in dieser Form verwendet. Es kann jedoch auch in Form von Trockenpulver verwendet werden. Zweckmäßig werden 60 μΙ/l der 30%igen Lösung oder 21 mg/1 des Trockenpulvers zugesetzt.

Das zur Hemmung des Wachstums von Mikroorganismen, im besonderen von Pilzen, erfindungsgemäß verwendete Konservierungsmittel kann irgendein mit der Pufferlösung verträgliches Konservierungsmittel sein, z. B. Natriumazid oder Kaliumsorbat, wobei das Natriumazid zweckmäßig in einer Konzentration von 0,17 g/l eingesetzt wird,

Zur Einstellung des pH-Wertes der Pufferlösung von ungefähr 6,5 (wie 6,45-6,55), wird erfindungsgemäß eine Base verwendet, die sich vom selben Material ableitet wie das Salz der organischen Säure. Wenn z, B. das Dinatriumsalz von EDTA verwendet wird, ist die Base Natriumhydroxyd, im besonderen 1 M Natriumhydroxyd. Die Menge an Base richtet sich nach dem pH der Lösung vor der Basenzugabe.

μ Die Pafferlösung kann dadurch hergestellt werden, daß alle Bestandteile mit Ausnahme der Base in entionisiertem oder destilliertem Wasser vermischt werden. Anschließend wird die Lösung durch Basenzu-

gäbe auf den gewünschten pH-Wert eingestellt und schließlich mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auf die gewünschte Stärke gebracht. Die resultierende Lösung ist bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur (20-25° C) und ca. 4° C mehrere Wochen stabil,

Beispiel 1

Herstellung von Plasma-Ersatz:

1,3 g Na₂ EDTA-2HjO werden in 800 ml Wasser gelöst und 0,17 g Natriuinazid sowie 70 μΐ einer 30%igen wäßrigen Lösung von Rinderserumalbumin zugefügt. Das pH wird mit 1 M Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt und das Volumen mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1000 ml gebracht.

Beispiel 2

Herstellung von konzentriertem Plasma-Ersatz:
13,0 g Na₂ · EDTA · 2H₂O werden in 800 ml Wasser gelöst und 1,7 g Natriumazid sowie 700 μΐ einer 30%igen wäßrigen Lösung von Rinderserumalbumin zugefügt. Das pH wird mit 1 M Natriumhydroxyd auf 6,25 eingestellt und das Volumen mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1000 ml gebrecht.

Antiserum-Titrationskurven und Standard-Inhibitionskurven mit Plasmaextrakt und
erfindungsgemäßem Plasmaersatz

Versuch 1

Herstellung von Plasma-Extrakt:

1 ml von normalem Plasma der Blutgruppe Typ A⁺ wird in einem Reagensglas mit 4 ml Salzlösung verdünnt. 5 ml 1,2 M Perchlorsäure werden in jedes Glas gegeben. Die Mischungen werden während 20 Minuten bei 1000 X g zentrifugiert. Das Überstehende wird in Dialysebeutel dekantiert, letztere dann verschlossen und in ein Dialysebad gestellt. Es wird 18 Stunden gegen 60 Volumenteile entionisiertes oder destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mehrmals ausgewechselt wird. Abschließend wird 3 Stunden gegen 60 Volumenteile 0,01 M Ammoniumacetatpuffer mit einem pH ν on 6,8 dialysiert. Die Extrakte werden dann in Reagensgläser übergeführt.

Versuch 2

Antiserum-Titrationskurve mit Plasma-Extrakt:
Steigende Mengen, d. h. 50, 100, 200 und 500 μΙ von CEA Aniiserum (im Verhältnis von 1 : 2500 in einem 9 Volumenteile Boratpuffer [pH 8,4] und 1 Volumenteil Plasma der Blutgruppe A⁺ enthaltenden Puffer verdünnt) werden in 4 Reagensgläser gegeben, von denen jedes 10 ml Plae/na-Extrakt, wie in Versuch 1 hergestellt, enthält. Zu einem Reagensglas wurde nur Wasser für eine Null-Kontroll-Messung zugefügt. Die Gemische wurden eine halbe Stunde bei 45° C inkubiert. Dann wurden 3 Nanogramm l^m CEA von 150000 bis 200000 cpm (Counts pro Minute) in jedes Teströhrchen gegeben und das Gemisch wurde eine weitere halbe Stunde bei 45° C inkubiert. Dann wurden in jedes Röhrchen 5 ml Zirkonylphosphat-Gel (pH 6,25) gegeben. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur 5 Minuten bei 1000 X g zentrifugiert. Das überstehende wurde verworfen und das Gel-präzipitat in 10 ml Ammoniumacetat-Lösung (Q₁I M, pH 6,25j suspendiert. Das Gel wurde dann durch Zentrifugation (5 Minuten, 1000 χ g) abgetrennt und auf gelgebundenes Ι^ιω untersucht, Vgl. die gestrichelte Kurve in Fig. 1.

Versuch 3

Antiserum-Titrationskurve mit Plasma-Extrakt-Ersatz:

Es wurde nach demselben Verfahren wie im Versuch 2 vorgegangen, mit Ausnahme der Verwendung von 10 ml des Plasma-Ersatzes nach Beispiel 1 an Stelle von 10 ml des Plasma-Extraktes gemäß Versuch 2 (vgl. die ausgezogene Kurve der Fig. 1).

Versuch 4

Antiserum-Titrationskurve mit Plasma-Extrakt-Ersatz:

5 ml des Produktes von Beispiel 2 wurden mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auf 50 ml verdünnt und als Verdünnungsmittel im Verfahren gemäß Versuch. 3 verwendet. Die resultierende Kurve ist identisch mit der nach Versuch 3 erhaltenen.

Versuch 5

Standard-Inhibitionskurve mit Plasma-Extrakt:
Je 100 μΐ CEA Antiserum wurden in 5 Reagensgläser gegebe», die je 10 ml des Plasma-Extraktes von Versuch 1 enthielten. Es wurden steigende CEA-Mengen, nämlich 0,2,5,6,25,12,5 und 25 ng zugegeben und das Gemisch eine halbe Stunde bei 45° C inkubiert. Dann wurden etwa 3 ng I^I?5-CEA mit 150000-200000 cpm zu jedem Röhrchen zugefügt und es wurde eine halbe Stunde bei 45° C inkubiert. Dann wurden je 5 ml Zirkonylphosphatgel (pH 6,25)

J5 zugegeben. NachZentrifugierung (1000 X g, 5 Minuten, Raumtemperatur) wurde das Überstehende verworfen und das Gelpräzipitat wurde in 10 ml Ammoniumacetatlösung (0,1 M, pH 6,25) suspendiert. Das Gel wurde dann durch Zentrifugieren (1000 X g, 5

Minuten) abgetrennt und auf gelgebundenes I¹²⁵ vatersucht (vgl. die gestrichelte Kurve von Fig. 2). Die Kurve kann zur Bestimmung der CEA-Menge in einer Plasma-Extrakt-Probe verwendet werden.

Versuch 6

Standard-Inhibitionskurve mit Plasma-Extrakt-Ersatz:

Das im Versuch 5 beschriebene Verfahren wurde

befolgt, mit Ausnahme der Verwendung von 10 ml des Plasma-Extrakt-Ersatzes nach Beispiel 1 an Stelle von 10 ml Plasma-Extrakt (vgl. die ausgezogene Kurve von Fig. 2).

Versuch 7

Standard-Inhibitionskurve mit Plasma-Extrakt-Ersatz aus Beispiel 2:

5 ml des nach Beispiel 2 erhaltenen Produktes wurden mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auf 50 ml verdünnt und als Verdünnungsmittel im Verfahren gemäß Versuch 6 benutzt. Die erhaltene Kurve ist identisch mit der nach Versuch 6 erhaltenen.

Die leicht höhere Radioaktivität beim Nullwert gibt die Anwesenheit einer sehr kleinen, aber doch meßbaren Menge an CEA im Plasmaextrakt sn.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Wäßriger Plasmaersatz mit einem pH von ungefähr 6,5, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Alkalimetallsalz einer organischen Säure in einer Menge, die derjenigen von ungefähr 1,3 g/l Dinatrium-äthylendiamin-tetraacetatdihydrat äquivalent ist, einem das Wachstum von Mikroorganismen hemmenden Konservierungsmittel und einem Alkalimetallhydroxyd, wobei das Alkalimetall im Alkalimetallsalz dasselbe ist wie im Alkalimetallhydroxyd.

2. Konzentrat, aus dem durch Verdünnung mit entionisiertem oder destilliertem Wasser eine Lösung gemäß Anspruch 1 hergestellt werden kann.

3. Konzentrat gemäß Anspruch 2, mit einem pH von ungefähr 6,25, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Alkalimetallsalz einer organischen Säure in einer Menge, die derjenigen von ungefähr 13 g/l Dinatriumäthylendiarajii-tetraacetat-dihydrat äquivalent ist, einem das Wachstum von Mikroorganismen hemmenden Konservierungsmittel und einem Alkalimetallhydroxyd, dessen Alkalimetall das gleiche ist wie in dem Alkalimetallsalz.

4. Verwendung von wäßrigem Plasmaersatz gemäß Anspruch 1 zur Aufnahme von CEA-Antisemm-Titrationskurven oder CEA-Standard-Antigen-Inhibitionskurven.