DE2334652A1 - Antilipaemisches mittel auf der grundlage einer sojabohnenoelfraktion - Google Patents

Description

Takashi Kanada und Toshikazu Tabata, Sendai-shi und Yokohama-shi Japan

Antilipämisches Mittel auf der Grundlage einer Sojabohnenölfraktion

Die Erfindung betrifft ein antilipämisches Mittel, das eine therapeutisch wirksame Menge einer nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl enthält. Antilipämische Mittel sind Substanzen, die dazu dienen, den Fettspiegel oder den Gehalt an Lipiden im Blutserum zu senken. Die Erfindung betrifft weiterhin ein oral zu verabreichendes therapeutisches Präparat in Form eines pharmazeutischen Trägers und einer nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl.

Es ist bekannt, dass bestimmte Pflanzensterine, auch Phytosterine genannt, wie beispielsweise ß-Sitosterin und Stigmasterin, den Cholesterinspiegel im Blutserum erniedrigen, (vgl. beispielsweise "Steroid Biochemistry and Pharmacology" von M. H. Briggs und J. Brotherton - Academic Press (London 1970, Seite 183). E_s gibt eine Reihe von Veröffentlichungen über die antilipämische Aktivität von Pflanzensterinen. Ein antilipämische Mittel mit einen Gehalt von 20 Gewichtsprozent ß-Sitosterin, suspendiert in k<fo-lger alkoholischer Lösung, wurde vor kurzem von der Firma E. Lilly Co. auf den Markt gebracht. Gegenwärtig gibt es jedochkeine Methode, nach der andere Pflanzensterine ausser ß-Sitosterin , wie beispielsweise Stigmasterin und Campesterin, in reiner Form aus' pflanz Liehen Ölen extrahiert und isoliert werden können. Die Verwendung von ß-Sitosterin als antilipämisches Mittel erfordert, dass Dosierungen in nachteilig grossen Mengen angewandt werden müssen,

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d.h. 20 bis 30 g ß-Sitosterin pro Tag, da der Körper ß-Sitosterin nur in geringem Masse absorbiert, so dass bei Langzeittherapie Leber- oder Nierenbeschwerden auftreten können (vgl. a.a.O.). Wenn das antilipämische Mittel , das ß-Sitosterin enthält, über lange Zeit verabreicht wird, tritt während der Verabreichungsdauer ausserdem im Cholesterinwert ein Reboundeffekt auf.

Es wurde nun gefunden, dass bei Verwendung bestimmter antilipämischer Mittel die Dosierung auf weniger al3 1/10 (i,2 bis 1»8 S J^e Tag) derjenigen Menge herabgesetzt werden kann, die für ß-Sitosterin erforderlich ist, so dass mögliche Nieren- und Leberbeschwerden vermieden werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein antilipamiscb.es Präparat, enthaltend eine zur Herabdrückung des Lipügehaltes von Blutserum wirksame Menge einer nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl,

Blut- und Urinuntersuchungen zeigen, dass das erfindungsgemässe antilipämische Mittel selbst bei Langzeitverabreichung keine schädlichen Sekundärwirkungen entfaltet. Ausserdem wurde durch Laboratoriums- und klinische Untersuchungen bestätigt, dass die pflanzlichen Sterine in der Leber und im Blut einen Teil der tierischen Sterine (Cholesterine) ersetzen. Das die nichtverselfbaren Anteile von Sojabohnenöl enthaltende Mittel sollte zur Erzielung zufriedenstellender klinischer Ergebnisse in Dosen verabreicht werden, die nicht über 600 bis 900 mg pflanzlicher Sterine betragen. Es wurde gefunden, dass bei Verabreichung der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl an Menschen in Gesamtdosen von 1200 bis 1800 mg je Tag der Gesamtcholesterinspiegel im Blutserum durchschnittlich um 10 bis 15$ erniedrigt wird, Jedoch beträgt die wirkliche Erniedrigung des Choleeterinspiegels vermutlich etwa 20 bis 25% ■, da etwa 10^ des Cholesterina im Serum durch pflanzliche Sterine ersetzt werden.

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Aus dem Vorstehenden ergibt sich, dass das erfindmigsgemässe antilipämische Mittel den Vorteil bietet, dass die Dosierung im Vergleich zu den bisher bekannten ß-Sitosterin enthaltenden Mitteln, die Gesamtdosierungen von 20 bis 30 g je Tag erfordern, beträchtlich erniedrigt werden kann.

Die Erfindung soll im folgenden an Hand von Zeichnungen näher erläutert werden, worin

Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Veränderungen in der Gesamtmenge an Cholesterin im Serum zweier Gruppen von Kaninchen zeigt, die während einer 12-wöchigen Periode auftraten , in der die Kaninchen in der im weiter unten auf,
wurden;

7
ten aufgeführten Beispiel beschriebenen Weise gefüttert

Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Veränderungen in der Gesamtmenge an freiem Cholesterin im Serum während der bei der Durchführung des Versuchs geniäss Beispiel 7 verstrichenen Zeit zeigt;

Fig. 3 eine graphische Darstellung ist, die die Veränderungen in der Menge an Phospholipiden im Serum in der während der Durchführung des Versuche gemäss Beispiel 7 verstrichenen Zeit zeigt;

Fig. h eine graphische Darstellurg ist, die die Veränderungen in der Meng-e an Neutralfett im Serum während der bei der Durchführung des Versuchs gernär ε Beispiel 7 verstrichenen Zeit zeigt, und

Fig. 5 eine graphische Darstellung ist, die die Veränderungen in der Menge an Lipoproteinen im Serum während der Dauer des Versucht- gemäss Beispiel 7 zeigt.

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Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl, die als aktiver Bestandteil des antilipämischen Mittels gemäss der Erfindung verwendet wird, kann hergestellt werden, indem man ein deodoriertes Sojabohnenöl verseift und der Molekulardestillation unterzieht. Die so erzeugte Ölfraktion enthält grosse Mengen an Phytosterinen und Tocopherolen. Die Analyse der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohenöl mit Hilfe eines Farbreaktionsversuches, eines Versuches unter Bildung von Digitoniden, mit Hilfe der Infrarot- und Ultraviolettspektrographie sowie der Dünnschicht- und Gas/Flüssigkeits-Chromatographie ergibt, dass in der nichtverseifbaren Fraktion die folgenden&ubstanzen enthalten sind: Sitosterine: ß-Sitosterin, Stigmasterin und Campesterin; natürliche Tocopherole: q-, y- und Ö-Tocopherol; Fettsäuren: Laurin-» Myristin-, Palmitln- und Linoleinsäure sowie eine geringe Menge Squälen.

Zur Erklärung der physiologischen Wirksamkeit von oC-Tocopherol (Vitamin E), das ein Bestandteil der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl ist, sind bereits verschiedene Theorien entwickelt worden. Eine/von diesen Theorien ist die biologische Antioxidanstheorie. Man hat sich vorgestellt, dass (^-Tocopherol antioxydierende Eigenschaften besitzt, weil Tiere mit Vitamin E Mangel in ihrem Körper Verbindungen aufweisen, die als Peroxyde von Lipiden angesehen werden. Gemäss einer anderen Theorie nimmt Vitamin E unmittelbar an einer enzymatisehen Umsetzung teil, wobei es in Gegenwart ungesättigter Fettsäuren Cytochrom C reduziert. Es wurden noch andere interessante Theorien über Vitamin E aufgestellt, wie beispielsweise die, nach der Vitamin E an der Biosynthese von Ubichinon sowie an seiner Zurückhaltung im Körper beteiligt ist. Nach einer weiteren Theorie verursacht ein Vitamin E Mangel die Peroxydation ungesättigter aliphatischer Säuren, die in lebenden Membranen enthalten sind, und ändert somit die Durchlässigkeit oder die Diffusionseigenschaften der Membranen.

Wie oben erwähnt werden den Tocopherolen viele unerwartete physiologische Wirkungsweisen über die eines Antioxidans hinaus-

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zugeschrieben, so dass sie sich auf verschiedenen Anwendungsgebieten als nützliche Heilmittel erweisen. Die medizinische Wirkungsweise der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl, die gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, scheint auf den Tocopherolen zu beruhen, die in dieser Fraktion in grossen Mengen vorhanden sind.

Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl gemäss der Erfindung lässt sich durch Destillation und Kondensation natürlichen Sojabohnenöls erhalten. Im gegenwärtigen Zeitpunkt ist es nicht möglich, ein Mittel derselben Zusammensetzung, wie sie das Destillat besitzt, synthetisch herzustellen.

Gegenwärtig ist es ausserdem schwierig, die Gründe für die physiologische Potenzierung der in der Ölfraktion enthaltenen Komponenten oder für die Unterdrückung der unerwünschten Nebenwirkungen wissenschaftlich zu erklären.

Experimente zeigen, dass eine nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl mit einer Zusammensetzung von etwa 45 Gewichtsprozent Phytosterinen und etwa 20 Gewichtsprozent Tocopherolen zur Verwendung als antilipämisches Mittel besonders geeignet ist. Somit wird die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl, die gemäss der.°Erfindung verwendet wird, vorzugsweise derart hergestellt, dass sie etwa 45 Gewichtsprozent Phytosterine und etwa 20 % Tocopherole enthält. Der Gehalt an pflanzlichen Sterinen und Tocopherolen hängt von der Art des verwendeten Sojabohnenöls ab. Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl gemäss der Erfindung kann unter Verwendung roher Fettsäuren von Sojabohnenöl (deodoriertes Sojabohnenöldestillat), die etwa 25 Gewichtsprozent pflanzliche Sterine und etwa 18 Gewichtsprozent Tocopherole enthalten, hergestellt werden, indem man die rohen Säuren mit Methanol verestert und die Ester der Molekulardestillation unterwirft, um die freien Fettsäuren von ihnen abzutrennen, wonach man die nichtverseifbare Fraktion, die etwa

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45 Gewichtsprozent pflanzlicher Sterine und etwa 20 Gewichtsprozent Tocopherole enthält, gewinnt.

Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl, die gemäss der Erfindung verwendet wird, ist bei Raumtemperatur ein trüber, brauner halbfester Stoff und geht beim Erhitzen auf eine Temperatur über etwa 80° C in eine halbtransparente ölige Flüssigkeit über. Die nichtverseifbare Fraktion besitzt einen charakteristischen Geruch und schmeckt leicht süsslich.

Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl weist in verschiedenen Lösungsmitteln selektive Löslichkeit auf. Sie ist äusserst leicht in Chloroform, leicht in Äther, wenig in Aceton, kaum in Äthanol und fast überhaupt nicht in Wasser löslich. Die Löslichkeit der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl in den genannten Lösungsmitteln beträgt:

Lösungsmittel Löslichkeit

Chloroform 1 g/0,9 ml

Äther 1 g/2,0 ml

Aceton . 1 g/500 ml

Äthanol 1 g/5000 ml

Wasser 1 g ist unlöslich in

10 000 1 Wasser

Beispiel 1 - Temperaturstabilität

Von der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl gemäss der Erfindung wurden Temperaturbeständigkeit, Feuchtigkeitsfestigkeit und Lichtechtheit bestimmt. Zur Bestimmung der Temperaturbeständigkeit wurde eine nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl in eine durchsichtige Weithals-Arzneiflasche einge» bracht und die Flasche mit einem metallenen Sperhahiy^erschlossen und zwei Jahre lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Dabei veränderte sich die Farbe der nichtverseifbaren Fraktion von braun in gelblich braun, jedoch traten keine Verschiebungen im

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Maximum und Minimum des Ultraviolettabsorptionsspektrumsbei 295 bzw 261 nm in äthanolischer Lösung auf. Ausserdem wurde gefunden, dass sich der Gehalt an Tocopherolen nach dem ersten Jahr lediglich um etwa 2 Gewichtsprozent und nach zwei Jahren um etwa 10$verringert hatte. Wurde ein Bindemittel, wie Siliziumdioxid, granuliert und eingekapselt, so wurden während der gleichen Zeit keinerlei Veränderungen in der Färbung oder im Tocopherolgehalt beobachtet.

Beispiel 2 - Feuchtigkeitsbeständigkeit

Zur Untersuchung der Feuchtigkeitsbeständigkeit der nichtverseifbaren Fraktion wurde diese granuliert und verkapselt, und die erhaltenen Granula wurden in neun verschiedene Behälter eingebracht, in denen die Atmosphäre unter Verwendung unterschiedlicher gesättigter Salzlösungen gesteuert wurde. Nachdem die Proben 15 Tage lang in den Behältern belassen worden waren, wurde die Hygroskopizität der Granula gemessen.

Die Ergebnisse der Feuchtigkeitsversuche sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

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Tabelle 1 Kontrollversuch

Relative Feuchtigkeit während der
Einschlussdauer %

20,** 40,2 53,7 70,2 79,1 82,3 85,6 90,3 95,5

Hygroskopizität

keine keine keine keine ja

ja

ja

Färbung

blassgelb blass- blass- blass- gelb gelb gelb gelb gelb gelb

gelb dunkel- dunkelgelb gelb *

CO CD OO Ol to

CO CO

σ> cn

K)

Die bei den obigen Bestimmungen verwendeten gesättigten Salzlösungen waren aus den folgenden Salzen hergestellt und ergaben die folgenden Feuchtigkeitawertβ:

Salz bzw. Oxid relative Feuchtigkeit

CH₃COOK 20,4

CrO₃ 40,2

NaBr · 2H₂O 53,7

NaHO₃ 70,2

(NH^)₂SO₄ 79,1

KCl 82,3

85,6

KNO₃ 90,3

Die gesättigten Salzlösungen, die aus den in der linken Spalte aufgeführten Salzen hergestellt waren, halten die in der rechten Spalte angegebenen entsprechenden relativen Feuchtigkeiten aufrecht, wenn das ganze System in verschlossenen Flaschen bei 37 C gehalten wird.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ist die verkapselte nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl unterhalb - einer relativen Feuchtigkeit von etwa 60$ stabil. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass die kritische Feuchtigkeit für die Stabilität der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl bei 63,1$ liegt.

Beispiel 3 - Lichtechtheit

Die Lichtechtheit der nicht verseif bar en Fraktion wurde mit und ohne Verkapselung bestimmt, indem man Proben mit einem bei niedriger Temperatur arbeitenden Xenon-Fadeometer mit einer Lichtmenge (etwa 180 Langley, UV-Strahlung von 300 bis hOO nm) bestrahlte, die einer Bestrahlung mit unmittelbarem Sonnenlicht von 10 im Jahresdurchschnitt genommenen Tagen entsprach. Während

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der Bestrahlung wurden die Proben auf Änderungen der Färbung und des Geruchs untersucht sowie der qualitativen Analyse, der Messung des UV Spektrums, der Dünnschichtchromotographie und der quantitativen Analyse unterworfen« Bei den Proben der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl, die nicht verkapselt waren, veränderte sich die Farbe von braun nach gelblichbraun, und die Wilenlänge der maximalen und minimalen Absorptionsspektren bei 295 bzw.261 nm in äthanolischer Lösung verschoben sich überhaupt nicht, obwohl das Verhältnis der Lichtabsorptionspektren nach fünftägiger Bestrahlung um etwa 3,5% und nach 1O-tägiger Bestrahlung um etwa8,7# vergrössert war· Der Gehalt an Tocopherolen war nach 5-tägiger Bestrahlung um etwa &fa und nach 10-tägiger Bestrahlung um etwa 1056 verringert. Andererseits war das Ausmass der Veränderung bei den verkapselten Proben geringer als bei den nicht verkapselten! Das Verhältnis der UV Absorptionsspektra war nach 5-tägiger Bestrahlung um 3,6$ und nach 10-tägiger Bestrahlung um 5$ erhöht, während der Tocopherolgehalt nach 5-tägiger Bestrahlung um nach 10-tägiger Bestrahlung um 6$ verringert war.

Toxizi t ät eversuche

Aus den obigen Versuchsergebnissen ergibt sich, dass die antilipämischen Mittel, die therapeutisch wirksame Mengen der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl enthalten, im Dunkeln aufbewahrt werden müssen. Experimentell ergibt sich, dass, wenn die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl (sowohl im verkapselten als auch im unverkapselten Zustand) in einem verschlossenen Behälter vor Licht geschützt aufbewahrt wird, sie ihre therapeutische Wirksamkeit langer als 2 Jahre beibehält.

Die Toxizität der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl, die erfindungsgemäss verwendet wird, wurde mittels Versuchen zur Bestimmung der akuten, subakuten und chronischen Toxizität bestimmt, wobei die Versuche in der folgenden Weise durchgeführt wurden.

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Beispiel h - Bestimmtang der akuten Toxizität

Eine Anzahl männlicher und weiblicher dd Mäuse mit einem Gewicht von 12 bis 18 g sowie weiblicher und männlicher Wistarratten mit einem Gewicht von 60 bis 90 g, die beide im Alter von k Wochen beschafft und im Laboratorium eine Woche lang aufgezogen wurden, dienten als Versuchstiere. 5 Mäuse und 5 Ratten wurden jeweils als eine Gruppe in dem Versuch verwendet· Eine Lösung der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl in Sesamöl wurde genäss den folgenden Vorschriften an diese Tiergruppen mittels eines Magenschlauches verabreicht. Jede Tiergruppe, die auf diese Weise behandelt worden war, wurde in einem Zuchtkasten bei einer Temperatur von 22 - 2°C und einer relativen Feuchtigkeit von 55 - 5% gehalten.

Mäuse: 8,0 g/kg peroral 4,0 g/kg s. c. 2,0 g/kg abdominale Injektion

Ratten: 8,0 g/kg peroral 2,0 g/kg s.c. 1,0 g/kg abdominale Injektion

72 Stunden nach der Verabfolgung wurden die Lebenszeichen der Versuchstiere beobachtet und 10 Tage danach der LD„-Wert bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

LD__o: 72 Stunden nach der Verabreichung waren sämtliche Mäuse und Ratten am Leben und selbst nach den darauffolgenden 10 Tagen waren noch alle ί Wertes unmöglich.

waren noch alle am Leben. Somit war eine Bestimmung des LD„-

Toxische Symptome: Xm Hinblick auf toxische Symptome oder toxisches Verhalten konnten keine Unterschiede zwischen den Versuchstieren und normalen Tieren beobachtet werden.

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Beispiel 5 - Bestimmung der subakuten Toxizität

Eine Anzahl von männlichen Wistar-Ratten (Gewicht 120 bis 160 g) und weiblicher Wistar-Ratten (Gewicht 105 bis 135 g)* die im Alter von h Wochen beschafft und eine Woche lang im Laboratorium aufgezogen worden waren, wurden als Versuchstiere verwendet· 10 männliche und 10 weibliche Ratten wurden für Jede Versuchsgruppe verwendet. Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnen öl wurde mit einem gepulverten Nahrungsmittel vermischt und das Gemisch jeder der Gruppen in den unten angegebenen unterschiedlichen Mengen verabfolgt. Die behandelten Ratten wurden in Brutkästen bei einer Temperatur von 22 - 2°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 - 5$ gehalten. Die Brutkästen wurden 10 mal je Stunde belüftet. Täglich verabreichte Dosen: 9000 mg/kg 4500 mg/kg 2250 mg/kg

Die angegebenen unterschiedlichen Dosierungen wurden auf der Grundlage von Vorversuchen bestimmt, bei denen Ratten 2 Vochen lang mit der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl behandelt worden waren. Das antilipämlsche Mittel gemäss der Erfindung wurde jeder Gruppe von Ratten, wobei weibliche und männliche voneinander getrennt gehalten wurden, täglich in den oben erwähnten drei verschiedenen Dosierungen peroral verabreicht, indem man das Mittel mit einem gepulverten Nahrungsmittel der Nippon Clare K.K. vermischte. Der Dosierungstest wurde einen Monat lang durchgeführt, wobejroeriodisch das Gewicht jedes Versuchstieres bestimmt wurde. Ausserdem wurden die Mengen an Nahrung und Wasser, die von jedem Versuchstier aufgenommen wurden, festgestellt und die Tiere auf toxische Symptome hin beobachtet. Am Ende der ersten zwei Wochen der Dosierungsperiode wurden die Versuchstiere einer Urinanalyse (Bestimmung des pH Wertes, Protein- und Zuckergehaltes), einer Blutuntersuchung (Bestimmung der Zahl der roten Blutkörperchen^ weissen Blutkörperchen, des Hamoglobingehaltes und des weissen

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Blutbildes) einer pathomorph.ologisch.en Untersuchung (Untersuchung der Hauptorgane durch Sezierung und Bestimmung des Gewichts) sowie einer biochemischen Untersuchung des Serums (Bestimmung von GOT, GPT, Al-P, Ch-E, LDH, T.Ch, F-Ch, Na⁺, K , Cl"*, Serumprotein und Blutzucker) unterworfen«

Die Versuchsergebnisse sind im folgenden zusammengestellt

1. Die allgemeinen Symptome waren die gleichen wie bei den Kontrolltieren; Todesfälle oder toxische Symptome wurden nicht beobachtet«

2. Keine signifikanten Gewichtsveränderungen oder Veränderungen in der aufgenommenen Nahrungs- oder Wassermenge wurden für irgendein Tier beobachtet.

3· Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Testgruppen und den Vergleichsgruppen wurden im Hinblick auf die Blutunt ersuchungen beobachtet·

k. Die biochemische Untersuchung des Blutserums jedes Versuchstieres ergab keine Unterschiede, die den Unterschieden iiyäen verabfolgten Mengen der nicht verseif bar en Fraktion von Sojabohnenöl zugeschrieben werden könnte.

5« Bei der patho-morphologischen Untersuchung wurden keine nachteiligen Wirkungen auf das Organgewicht festgestellt.

Beispiel 6 - Bestimmung der chronischen Toxizität

Eine Anzahl von männlichen Donryu-Ratten (Gewicht 90 bis 130 g), die im Alter von k Wochen beschafft und eine geeignete Zeitlang aufgezogen worden waren, wurden als Versuchstiere verwendet· Für jede Versuchsgruppe wurden 10 Ratten genommen. Das antilipämische Mittel, das die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl enthielt, wurde mit einem gepulverten Nahrungsmittel

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vermischt, und das Gemisch wurde jedem der Versuchstiere in den unten angegebenen unterschiedlichen Mengen verabreicht. Die auf diese Weise gefütterten Ratten wurden in Brutkästen bei einer Temperatur von 22 - 2°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 - 5i> gehalten.

Die täglich verabfolgte Dosis betrug: 9000 mg/kg

6000 mg/kg 3000 mg/kg

Bei einer der Gruppen von 10 Ratten wurden drei Ratten dreizehn Wochen lang und sieben Ratten 27 Wochen lang behandelt. Während der Versuchsperiode wurden Gewicht und Futteraufnahme jeder Ratte festgestellt und die Tiere auf toxische Symptome hin beobachtet. Nach Beendigung der einzelnen Versuchsperloden wurden die Versuchstiere einer Urinanalyse (pH Wert, Proteingehalt, Zuckergehalt), einem Bluttest (Zahl der roten Blutkörperchen, Zahl der weissen Blutkörperchen, Hämoglobinmenge, weisses Blutbild), einer patho-morphologischen Untersuchung (Untersuchung der Hauptorgane durch Sezierung und Bestimmung des Gewichtes) sowie einer biochemischen Untersuchung des Serums (Bestimmung GOT, GPT, Al-P, Ch<E, LDH, T«Ch, P-Ch, Na⁺, K⁺, Cl", Serumprotein und Blutzucker) unterworfen. Die Ergebnisse sind lat folgenden zusammengefasst.

1« Die allgemeinen Symptome der mit dem antilipämischen Mittel gefütterten Ratten waren die gleichen wie bei den Kontrolltieren; Todesfälle oder Vergiftungen kamen nicht vor.

2« In den arteriellen Systemen,Koronararterien, Nierenarterien

usw wurden keine optisch-mikroskopischen Veränderungen festgestellt.

3· In den Nieren wurden keine wesentlichen Unterschiede bei der Fettablagerung , bei der Menge an Glykogen, bei der Erzeugung von sternförmigen Zellen oder bei den Parenthemalzellen im Vergleich zu der Kontrollgruppe festgestellt.

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4. Köine Veränderungen wurden bei den. myelopöetischen Funktionen beobachtet.

5. Die biochemische Untersuchung ergab keine ungewöhnlichen Veränderungen·

6. Keine signifikanten Unterschiede wurden im Hinblick auf Gewicht, Nahrungs- und Vasseraufηahme, bei der Blutuntersuchung oder hinsichtlich des Gewichtes der untersuchten Organcjifestges teilt _.

Aus den oben zusammengefassten Ergebnissen ist ersichtlich, dass das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung ausserst ungiftig ist, so dass es möglich ist, das Mittel über lange Zeit ohne ungünstige Auswirkungen zu verabfolgen.

Die medizinische Wirkung des antilipämischen Mittels gemäss der Erfindung wurde durch Laboratoriumsversuche an Tieren und an klinischen Fällen bestimmt. Einige dieser Versuche sind im folgenden beschrieben.

Beispiel 7 - Pharmakologische Wirkungen

Versuchsnethode: Eine Anzahl männlicher Kaninchen wurde als Versuchstiere verwendet. Die Kaninchen wurden mit einem Gewicht von etwa 2,0 kg angeschafft und etwa 2 Wochen lang aufgezogen, während nan sie sich an ihre neue Umgebung gewöhnen liess, bevor man sie als Versuchstiere verwendete. Dreizehn Kaninchen wurden in dem Versuch verwendet, und zwar in einer Kontrollgruppe und in einer Versuchsgruppe. Ein festes Nahrungsmittel (Produkt der Nippon Clare K.K.) , das 1 Gewichtsprozent Cholesterin enthielt, wurde täglich an beide Kaninchengruppen in einer Menge von 100 g je Kaninchen verfüttert. Wasser wurde ad libitum mit Hilfe eines automatischen Tränkmechanismus verabreicht. Das antilipämische Mittel wurde der Versuchsgruppe in Kapselform in einer Menge von 1,7 g je Tag zwölf Wochen lang verabfolgt; der

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Kontrollgruppe wurde in gleicher Weise Kartoffelstärke verabreicht· Der Lipidspiegel im Blutserum sämtlicher Tiere wurde in der weiter unten beschriebenen Weise bestimmt, wobei man Blut verwendete, das der Ohrenvene entnommen war. Die Bestimmung erfolgte vor Beginn der Testperiode und danach alle zwei Wochen während der Versuchsperiode.

Gesamtcholesterin: Nach Kitamura modifizierte Zak-Henry-Methode Freies Cholesterin: Digitonln-Methode

Neutralfettet Von Van Handel-Kawade verbesserte Yamamoto-Methode Phoapholipide: Von Nakamura modifizierte Alien-Methode Liprotein: Elektrophorese

A) Gewichtsänderung

Das Gewicht der mit dem Mittel behandelten Kaninchengruppe sowie das der Kontrollgruppe nahm normal su. In dieser Hinsicht wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt.

B) Lipide im Serum 1. Cholesterin

Ein bemerkenswerter Anstieg in der Menge an Gesamtcholesterin und freiem Cholesterin wurde bei der Kontrollgruppe beobachtet, während die Gruppe,der das antilipämische Mittel verabfolgt worden war, einen verhältnismässig geringen Anstieg in sowohl Gesamtcholesterin als auch freiem Cholesterin aufwies, der etwa die Hälfte von dem der Kontrollgruppe ausmachte. Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der Veränderung in der Menge an Gesamtcholesterin im Serum als Funktion der Zeit während der Versucheperiode für sowohl die mit dem Mittel behandelt· Gruppe als auch die Kon tr oll gruppe. Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der Veränderungen in der Menge an freiem Cholesterin im Serum als Funktion der Zeit. In diesen Darstellungen bedeutet "ST-2" das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung, das eine nichtverseifbare Fraktion von SojabohnenSl enthielt· Die in den Fig« 1 und 2 angegebenen Daten zeigen, dass das antilipämische

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Mittel gemäss der Erfindung die Zunahme von Cholesterin im Serum wirksam unterdrückt,

2. Phosphoriipide:

Fig· 3 ist eine grafische Darstellung der Veränderungen in der Menge an Phosphorlipiden im Serum als Funktion der Zeit für sowohl die mit dem Mittel behandelte Tiergruppe als auch die 'Kontrollgruppe. Vie sich aus Fig. 3 ergibt, ist das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung ebenfalle zur Unterdrückung des Anwachsens, der Phosphor lipide im Serum wirksam·

3· Neutralfette:

Fig· h ist eine grafische Darstellung von Veränderungen in der Menge an Neutralfett im Serum als Funktion der Zeit für sowohl die mit dem Mittel behandelte Gruppe als auch die Kontrollgruppe. Wie sich aus Fig. k ergibt, war der Neutralfettwert für die mit dem Mittel behandelte Gruppe vor Testbeginn geringfügig höher als der für die Kontrollgruppe, wurde Jedoch niedriger als der der Kontrollgruppe, nachdem sechs Wochen lang das Mittel verabreicht worden war· Nach zwölf Wochen betrug der ,Neutralfettwert für die mit dem Mittel behandelte Gruppe nur noch die Hälfte des Wertes für die Kontrollgruppe·

k· Lipoprotein im Serum:

Fig. 5 ist eine grafische Darstellung der Veränderungen in der Menge an Lipoprοteinsam Serum als Funktion der Zeit sowohl für die mit dem Mittel behandelte Gruppe als auch für die Kontrollgruppe· Wie aus Fig. 5 hervorgeht, erhöhte sich bei der Kontrollgruppe das Verhältnis von ß-Lipoprotein zu CC -Lipoprotein stark, während das Verhältnis sich bei der mit dem Mittel behandelten Gruppe lediglich geringfügig erhöhte und nach 8-wöchiger Behandlung einen konstanten Wert erreichte. Daraus.geht hervor, dass das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung auch den Anstieg der Bildung von Lipoprotein im Serum unterdrückt«

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C) Eingeweidelipid (Lebercholesterin)

Vie in Tabelle 2 dargestellt, wurde die Gesamtmenge an Cholesterin im Eingeweide sowie von freiem Cholesterin lsi Eingeweide der mit dem Mittel behandelten Gruppe auf niedrige Verte verringert, die signifikant von den Werten der Kontrollgruppe abwichen«

Tabelle 2

_ft_ ^ Lebercholesterin

Gruppe _ . frei·. Gesamt (mg/g) freies (mg/g)

Kontroll- 4.57 1,09 24,84

gruppe (* 0,890) (± 0,166) (t 1,43

mit ST-2* _t

Anmerkungent

- . * - das antillpamische Mittel gemSss der Erfindung

- Ea besteht ein signifikanter unterschied in

ρ 0,01 - Standardfehler

D) PflanaIiehe Sterine im Serum und in der Leber

Die Menge an Gesamtcholesterin im Serum und in der Leber wurde mitfcelsondorimetrischer Analyse bestimmt, wobei eine Verbindung mit einem Sterinring eine Reaktion hervorruft. Venn pflanzliche Sterine in einer Probe/vorhanden sind, tritt eine Farbreaktion auf, die der fUr Cholesterin kennzeichnenden gleich ist. Deshalb wird in den Fällen, in denen die Menge an Gesamt cholesterin i« Serum nach Verabreichung des antllipämischen Mittels gemass der Erfindung bestimmt worden war, dieser Gesamtcholesterlnwert als Summe der Werte für Cholesterin und Pflanzensterine angesehen.

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Demgemäss ergibt die Verwendung eines Wertes für das Gesamtcholesterin keine genaue Diagnose für Lipämie. Um den Cholesterinspiegel sowohl im Eingeveid$4ls auch im Serum fehlerfrei zu bestimmen, ist es daher erforderlich, die Menge an Pflanzensterine genau zu bestimmen und abzuziehen. Der Wert der Pflanzensterine kann mit Hilfe der FID Gas/Flüssigkeits-Chromatographie in Verbindung mit der DünnschichtChromatographie bestimmt werden·

Beispiel. 8A - Tierversuche im Laboratorium

Bei diesem Versuch wurden vier Gruppen von weissen Ratten verwendet. Eine Kontrollgruppe wurde mit einem cholesterinfreien Nahrungsmittel gefüttert, während eine zweite Kontrollgruppe mit einem Nahrungsmittel gefüttert wurde, das 0,5% Cholesterin enthielt. Eine dritte Gruppe wurde mit einem Nahrungsmittel gefüttert, dem Cholesterin zugesetzt war und das 1,5 Gewichtsprozent Pflanzensterine enthielt, während die vierte Gruppe mit einem mit Cholesterin versehenen Nahrungsmittel gefüttert wurde, das ausserdem das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung enthielt. Diese Nahrungsmittel wurden den einzelnen Gruppen vier Wochen lang verabreicht. Nach Beendigung der vierwöchigen Versuchsperlode wurden die Cholesterinwerte im Serum und in Form der Leberlipide bestimmt, und die Lipidfraktionen des Serums und der Leberproben wurden mittels FID Gas/Flüssigkeits-Chromatographie in Verbindung mit DünnschichtChromatographie analysiert. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass etwa 50 Gewichtsprozent des Gesamtcholesterinwertes substituierten Pflanzensterinen zuzuschreiben war. Demgemäas ist-der Wert, der durch Subtraktion des Pflanzensterinwertes von dem Gesamtcholesterinwert erhalten wurde, als der wahre Cholesterinwert für das Serum und die Leberlipide anzusehen. Aus den Daten ist ersichtlich, dass bei Verabfolgung des antilipämischen Mittels gemäss der Erfindung an die Ratten der wahre Cholesterinwert in beträchtlichem Ausmass erniedrigt wird.

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Tabello

Komponenten und Konzentrationen von Sterinen im Serum (Plasma) und den Leberlipiden von Ratten, die mit Sojasterinen gefüttert worden waren (Beispiel 8A)

Gruppe

(Plasma)-LSerumsterin mg/dl

Lebersterin mg/g

Gesamt-	Cholesterin	Stigma	ß-Sito-	Gesamt-	Chole
cholesterin		sterin	sterin	chole	sterin
				sterin

Stigma- ß-Sitosterin sterin

ω •ό m

Futter ohne Cholesterine

II Futter mit 0,5 Gew.-^ Cholesterin en

III Futter mit 1,5 Gew.-# an Fraktionen, die hauptsächlich aus Phytoeterinen bestanden

16O

195

87

2.8

60.0

6.4

2.8

60.0

k.6

1.3

0.5

IV Futter mit 1,5 Gew.-^ des antilipämisehen Mittels gemäß der Erfindung

147

81

16

5.6

1.7

2.8

CJ GJ

-P-CD

ÖT

1.1

Beispiel 8B- klinische Versuche

Das antilipämische Mittel gemäss der Erfindung, das in den Versuchen gemäss den Beispielen 8A und 8B sowie in dem klinischen Versuch gemäss Beispiel 9 verwendet und im folgenden beschrieben wird, wurde in Kapselform oral verabreicht, wobei jede Kapsel 200 mg der nichtverseifbaren Fraktion von SojabohnenSl enthielt.

A) Versuch Bit Gesunden

Eine vorherbestimmte Nahrungsmenge (etwa 2700 Kalorien täglich), die Fleisch mit hohem Fettgehalt (40$ Fett) enthielt, wurde jeder von neun gesunden Personen sechs Wochen lang verabreicht. Während dieses Versuches wurde den Versuchspersonen täglich in der ersten Woche ein Placebo und in den nächsten vier Wochen das antilipämische Mittel verabreicht. Während der letzten Woche wurde wiederum das Placebo verabfolgt. In jedem Falle betrug die Dosierung 6 Kapseln täglich. Die Werte für das Gesamtcholesterin und für die pflanzlichen Sterine im Serum der Versuchspersonen wurden nach der Zak-Henry-Methode bzw. der oben in Beispiel 2A beschriebnen Methode bestimmt.

Es ergab sich, dass die Pflanzensterine 10 Gewichsprozent de· gesamten Cholesterins im Serum ausmachten. Weiterhin ergab sich» dass eine Woche nach Beendigung der Behandlung mit de» antilipämischen Mittel gemäss der Erfindung Pflanzensterine i« Serum überhaupt nicht mehr ermittelt werden konnten. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle k zusammengefasst.

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Tabelle 4

Änderungen in den biochemischen Koa>pon*nten von Serumlipiden, di· durch «in Placebo und ST-2 verursacht wurden

	verabreich	(u)	Optische Dich te bei	Wert vor	Placebo	einer	ST-2	drei	24P 246-106 (S)	Placebo	•
	tes Mittel	(u)	530 m/u/ml	der Be		Woche		Wochen	I 15,3*4,3		IO to
		(u)	handlung					0,06		I
		(u)			9		9,6
	Untersucht·	(mg/dl)		Wert nach	6		4,2	Wert nach
	Substanzen	(mg/dl)		einer	4,8	Werte nach	5,7	einer Woche
		,pro. (mg/dl)		Woche	250	zwei	260
O	O. ■"""	T.T.** (#ml)			240*40	Wochen	240*40 240*29
Q	S G0T	TBA	19	12	21		20	13,4	ro
INA	fl» GPT		15	11	300*82	12	230*94	11,3
Γ"	"V ALP	7,1	5,0	4,8*3,0	9	9,2*3,'	4,5
CO "Π	Ii. LDH	280	200	0,072	4,6	.0,068	290
m O	♦* TCH	197*25	228*36		280		240*62
H ΓΠ r—ι	PS»	O	321 98		0
	ß-Lip,	325*122	7,5-1,0		280*90
		6,1*4,7	0,05		17,1*4,6
		0,058		0,06

PSt Phytosterin

** T,T. t Oesanttocopherol

**♦ TBAt Thiobarbitursäurewert ♦*♦♦ ST - 2 . Mittel gemüse der Erfindung

O « p< 0,05

0,01, wobei ρ di· Zuverlässigkeitsgrenzen bedeutet

Ca) CD

Β) Versuche mit Patienten

Der folgende Versuch wurde mit 45 Patienten durchgeführt, die einen zu hohen Blutdruck hatten und einen Gesamtserumlipidcholesterinspiegel von über 220 mg/dl aufwiesen. Neun Kapseln eines Placebos wurden in den ersten drei Wochen einer sechswöchigen Versuchsperiode täglich jedem Patienten oral verabreicht, während in den folgenden drei Vochen neun Kapseln des antilipämisehen Mittels gemäss der Erfindung täglich oral verabreicht wurden. Das Gesamtcholesterin in Form von Blutserumlipiden wurde nach der Zak-Henry-Methode bestimmt, und die Lipidfraktionen desselben Serums wurden mit Hilfe eines PID Gas/Fltissigkeits-Chromatographen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefasst.

Vie sich aus der Tabelle 5 ergibt, wurde der Gesamtserumlipidcholesterinwert durch die Behandlung mix^eiantilipämischen Mittel gemäss der Erfindung im Mittel um 13,5$ (P<0,05), verglichen mit dem Placebo - Kontrollversuch verringert. Venn die substituierten Pflanzensterine, im Mittel etwa 9%_t von dem Gesamtcholesterinwert abgezogen werden, wird der wahre Serumlipidcholesterinwert um 22,5% gegenüber dem.entsprechenden Vert für den Placebo-Kontrollversuch erniedrigt. Vährend das Placebo verabfolgt wurde, wurde im Serum kein Pflanzensterin entdeckt.

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	2	3	4	5	Tabell' 5	6	Sterine	218	8	9	■ 1,0	5	11	12	13	14	■	10'	GPT	ALP	15	*	260	I	I I	ro
	Name	Ge schlecht	Al- . ter	Vor Ver suchs- beginn		7	200	'ver- rin- ge- rung mg/dl		Pflanzen- sterine . P* ST-2**»*	3	Ge samt Toco phe role mg/dl			Leberfunkt ionei	" 64.	11	8.6	1 LDH		560 ^		OJ
1	T. T.	M*	36	225	Nach Nach 3-wöoh. 3-wöoh Placebo- ST-2 verab- Verab rei'- rei- ohung chung mg/dl . Bg/dl	240	-2		0	20	0.5			GOT	8'	5.6		310 \		CO
	S.T.	M	42	240	220	215	-45	0	4	0.35	32				200		CJI
Pall	K. K.	M	50	232 *	245	230'	-30	0	10	1.35	16				1, 130
1	T.T.	M	48	238	270	300	-20	0	25	0.45	.	8	5.8		210
2	M. M.	M .	59	293	235	220	-55	0	4	0.70		•29	12
3	T.T.	ρ***	56	307	285	240	-10	0	8	. 0.45	15 ·	44	4
4	s.o.	P	45	294	310	250 ■ .	-70	0	"21 ·	0.85	74	7	3 '	3C0-
5	M.T..	P	40	271	290	230	-35	0	18 '	1.90	26	29	4.7
6	I.Y.	P	52	255	275	220	-15	0	15	1.70	13	• 8"	4.9	200
7	Ν.Ϋ.	M	74	290	265	200 .	-50	0	10	1.70	,' 2S	4		240
•8	H. R.	. P	66	277	280 '	250	-50	o.		1,70	. 13
9	K. T.	H	62	198	' 270	240	-5	0	6	1.20	16	13	" 4.6
10	•W.T*	M t	19	275	205 .	225	«20 .	0	0	1.60
11	K. T.	P	78	285	270	210'.	-50 '	Q	.7' ' '	. 1.50	60	. 5 _	4.5
.12	A. K.	M	34	235	290		-25 ·' ·	0		0.70	58	6.7
13	I. K.	H	58	275	250		-50	0 4		0.90
14				260
15
16

ITk

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CM

VO

οοοοοοοοοοο α> ν ο η to co η «·■> »-ι ο «*>

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H H « N NW «.N M N co c\ ο >-ι cm r» fMCM««««

ο >-ι cm

409885/1146

Tabtllt 5 (fortittiung)

	•	1	2	•	•	•	3	4	P	■ · -	-	5	6.	7	8	P	11	12	*	13	14	*	15
	35	Z. X.		«Pll		.H	63			2.40	235	238	+3	0	1.15	33		52	4.3	3.6	230
	36	I.I.		P	58			207	' 215 .	.200'	-15	0	0.80	10	Mi-fc-fcel irmmüß	15	3.8	6.7	200
	37	H.A.		P	62			220	228	230	+2.	ο	1.90	18	16	2.9	3.1	2QO
«ο	38	■S.T. ,	K	60	LOebO ·" **MJmATtTiT IeK ·	223	.219	200	-19	0	. 1.70	35	15	5.3	5.6	240
O ie	39	T.P.	K	71	300	305	220	-85	t 0	0.75	26	22	7.2	6.7	230
«a ο»	40·	S.S.*	U*	61	305	309	300	. -9	0	0.95
«η	. 41	t X.Y.	P	55	325	320 .	295	-25	0	1.35	57	48		450 j
—*	42	N.T.	.P	53 .	290	.300	240	-60	0	1.15	26	20		310 1NJ (V
cn	43	H* K.	H	69	229	225	190	-35	.0	1.55	14	6		290 .
	44	S. X.	P ,	57	250	260	190	-70	0	1.25	35	22		390 '
	45	K.M.	P	61	266	270	195	-75	0	0.80	38	13		300
	Mittelwert i	' Standard-	• 265	267	231	-36 '	■ 1 ■				'ti11*1
	abweichung	I	+30	ί3ο	+31
		P	0.05 P	0.05	Yerrlxi«-					is) OJ
	•	·■	• * '	' gerung •13.5 w					OJ
		■ φ *♦ ■ *			ites			cn
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5) Pathologische Befunde

a) Viscerale Beobachtungen

Herz: In Teilen der Herzapex und der Kranzarterie beider Gruppen wurde Fettablagerung beobachtet, jedoch war die Zahl

der Fälle, die derartige Ablagerungen erkennei/liessen, bei der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe geringer.

Milz: In beiden Gruppen wurde eine milchweisee Substanz gefunden, jedoch in grosserer Menge bei der Kontollgruppe·

Leber: Nahezu sämtliche Patienten der Kontrollgruppe besassen eine Fettleber, während die meisten Patienten der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe eine normale Leberfärbung aufwiesen«

Aorta: Bei der Kontrollgruppe war das Ausmass der Arteriosklerose am grössten in dem Bogenabschnitt mit einer absteigendabschwächenden Tendenz auf den Thorax und den Abdominalbereich zu. Klar umgrenzte Fettablagerungen wurden ausserdem in der ärteriomesenterialen Herzarterien- und Nierenarterienöffnungen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden diese Symptome bei der mit des antilipämischen Mittel behandelten Gruppe lediglich in ein oder zwei Fällen gefunden.

b) Gewichtsveränderungen der Eingeweide

Hinsichtlich Nieren, Lunge und Herz wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt, jedoch bei der Leber, den Nebennierendrüsen und der Milz war das Gewicht der betreffenden Organe bei der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe etwas geringer als bei der Kontrollgruppe· Ein^eignifikanter Unterschied wurde lediglich beim Lebergewicht festgestellt.

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c) Histologische Untersuchung

Die Aorta (Bogenabschnitt), das Herz, die Lunge, Milz und die Nebennierendrüsen wurden histologisch untersucht.

Aorta: Bei. der Kontroll gruppe fand eine Bildung und Degenerierung von Schaumzellen statt (Schaumzelle = gequollene, mit Vakuolen versehene, reticuloendotheliale Zelle, die mit Lipideinschlüssen gefüllt ist und deren Auftreten für bestimmte Zustände, wie Störung des Lipilat off wechsele, kennzeichnend ist). Ausserdem war Fett diffus auf Teilen der medi an en Membran in Tropan- oder oraler Form abgelagert. Ausserdem wurden einige Fälle von atheromatöser Degeneration innerhalb der Aorta beobachtet, die eine Schwellung und ein Brechen der elastischen Fasern sowie die Proliferation oder das Wachstum von leimartigen -Fasern aufwiesen. Xn einigen Fällen existierten innerhalb der Kontrollgruppe Schaumzellen zusammen mit einem verhältnisraässig grossen Fettkomplex an der/obersten Schicht der inneren Membran und mit feinen Tröpfchen an der unteren Schicht, was ein geringes Ausmass an arteromatöser Veränderung der Gefässwände anzeigt. In den anderen Fällen wurde entweder nahezu keine Veränderung oder lediglich eine geringe Infiltration von Liplden In die Endothelia der inneren Membran beobachtet·

Bei der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe wurden lediglich in einem schweren Fall granuläre Fettablagerungen im Endothel der Aorta beobachtet. Schaumzellen wurden in einem Einzelfall ebenfalls beobachtet. In den anderen Fällen innerhalb der behandelten Gruppe wurden derartige Zustände nicht beobachtet.

Lunge: In zwei Fällen innerhalb der Kontrollgruppe wurde eine ödemalose Hypertrophie der inneren Membran der Arterlenwände festgestellt. Bei der behandelten Gruppe wurden derartige Symptome nicht in einem einzigen Fall festgestellt.

Herzt In keinem Fall wurden Fettablagerungen an den Herzmuskelfasern festgestellt, ausgenommen einige wenige Fälle innerhalb

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der Kontrollgruppe mit einer leichten Ansammlung von Fett an dem Epicard. Membranödeme am Aortenbogen wurden in vier Fällen innerhalb der Kontrollgruppe beobachtet, bei denen atheromatöse Symptome deutlich sichtbar waren. In einem Falle innerhalb der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe wurde ein intimales Ödem beobachtet, das sich mit Eosin schwach färbte«

Milz: Unter der Membran wurden nestartige Fettablagerungen in vier Fällen bei der Kontrollgruppe und in drei Fällen bei der behandelten Gruppe beobachtet, wenngleich das Ausmass unterschied» lieh war. In den drei mit dem antilipämischen Mittel behandelten Fällen war eine leichte Hypertrophie der Milz festzustellen.

Leber: Wenngleich mit dem unbewaffneten Auge starke Fettlebersymptome beobachtet wurden, waren .tatsächlich lediglich gering· Ablagerungen von Fettkugelchen in den Leberzellen vorhanden» und es ergab sich ein Bild der zirkumferentiellen Fimelose· Die Fettablagerungen wurden hauptsächlich im Stroma oder in den Interstitialzellen sowie in den Kupffersehen Sternzellen, insbesondere in und um die Mitte der Vene der Guss on sehen Kapsel beobachtet« Diese Lebersymptome wurden bei der Kontrollgruppe in grösserem Ausnass, bei der mit dem antilipämischen Mittel behandelten Gruppe dagegeiyim allgemeinen nur in leichter Form beobachtet«

Beispiel 9 - Klinische Versuche

Die folgenden klinischen Versuche wurden am Tokyo Medical College durchgeführt.

Versuchsmethode: 38 Patienten mit verschiedenen Symptomen» wie beispielsweise einem ischemischen Herzleiden, Bluthochdruck, Diabetis, akuter Hepatitis und Magengeschwüren, wurden diesen klinischen Untersuchungen unterworfen. Die Gesamtcholesterinmenge im Serum lag vor der Behandlung innerhalb -des Bereiches von 205 his 335 mg/dl und betrug im Mittel 260,4 mg/dl. Z6 Patienten wiesen einen Gesamtcholesterinspiegel von über 250mg/dl

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auf und 12 Patienten einen Wert innerhalb des Bereiches von 205 bis 248 mg/dl. Sechs Kapseln mit dem antilipämischen Mittel gemäss der Erfindung wurden jedem Patienten täglich vier bis zwanzig Wochen lang oder 7 »6 Wochen im Durchschnitt oral verabreicht. 24 Patienten erhielten ein inaktives Placebo statt des Mittels zwischen der 8. und 12. Woche (einschliesslich).

Ergebnisse: Serumcholesterinwerte:

Der Mittelwert für die Serumcholesterine vor Behandlung alt den antil!panischen Mittel gemäss der Erfindung betrug 260 mg/dl und wurde innerhalb der ersten zwei Wochen nach Beginn der Behandlung auf 225,9 mg/dl und vier Wochen nach Behandlung auf 229t9 ""g/dl gesenkt. Sechs Wochen und acht Wochen nach Behandlungsbeginn stieg der Wert wieder leicht auf 232,2 mg/dl bzw· 240 mg/dl. Xn der zwölften Woche, nach 4-wöchiger Verabfolgung des Placebos anstelle des antilipämischen Mittels war derWert auf 244,8 mg/dl angestiegen.

fl-Lipoprotein» 1· Fried-Hoeflmayr-Methode

Der Mittelwert für ß-Lipoprotein vor der Behandlung betrug 592,3 mg/dl, zwei Wochen nach Behandlungsbeginn war er auf 527,1 mg/dl, vier Wochen danach auf 529,8 mg/dl, sechs Wochen danach auf 535,1 mg/dl und acht Wochen danach auf 550 mg/dl verändert worden. Somit fiel der Wert während der zwei bis sechs Wochen nach Behandlungsbeginn· Xn den Fällen, in denen nach der achten Woche ein Placebo verabfolgt worden war, betrugen die Werte nach zehn Wochen 524,8 mg/dl und nach zwölf Wochen 520,7 ■g/dl. Somit war kein Rebound-Effekt zu beobachten.

2, Kapillare Ausfällungsmethode

Der Durchschnittswert für elf Testfälle betrug 4,5 mm,bevor mit der Behandlung durch das antilipämische Mittel gemäss der Erfln -

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dung begonnen wurde; dieser Wert wurde vier Wochen nach Behandlungsbeginn auf 3,7 mm und acht Wochen danach auf 4,0 mm verändert. Weiterhin betrug der Durchschnittswert in fünf Fällen, in denen das Mittel vier Wochen lang verabreicht und anschliessend durch ein Placebo ersetzt worden war, nach acht Wochen 3,7 mm· Somit wurde kein Rebound-Effekt beobachtet.

GOT, GPT:

Es wurden 38 Fälle untersucht, bei denen die Mittelwerte für GOT vor der Behandlung 31,2 und danach 25,1 und für GPT vor der Behandlung 32,9 und nach der Behandlung 26,2 betrugen.

Der Meulengrachtswert und der ALP-Wert wurden in 38 Fällen untersucht. Das Mittel für den Meulengrachtswert betrug 6,9 vor der Behandlung mit dem antilipämischen Mittel und 6,8 nach der Behandlung, während die Mittelwerte für ALP vor der Behandlung 8,8 und danach 8,6 betrugen. Diese Werte blieben vor und nach der Behandlung verhältnismässig konstant, woraus sich ergibt, dass das Mittel gemäss der Erfindung keine nachteiligen. Wirkungen aufwies.

S ekundärwirkung:

Keine Sekundäreffekte wurden beobachtet.

Beispiel 10: Herstellung der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl;

Eine rohe Fettsäurefraktion (deodoriertes Destillat von Soja— bohnenöl) von Sojabohnenöl mit einem Gehalt von etwa 25 Gewichtsprozent an Phytosterinen und etwa 18 Gewichtsprozent an Tocopherolen wurden in Gegenwart von konzentrierter Schwefelsäure bei einer Temperatur von 68°C drei bis vier Stunden mit Methanol zu einem Ester umgesetzt. Das überschüssige Methanol wurde von dem Umsetzungsprodukt entfernt, das anschliessend bei 170 bis 18O°C mit Wasser gewaschen, kondensiert und durch Molekulardestillation bei 170 bis 180⁰C und einem Druck von 20 bis 50 mm Hg gereinigt wurde. Die gereinigte nichtverseifbare Fraktion

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von Sojabohnenöl oder anschliessend mit Hilfe eines Farbreaktionstestes, einer Digitoninausfällung sowie der Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektren und Dünnschicht- und Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse waren:

Pflanzensterine einschliesslich Campesterin, Stigmasterin und Q- Sitosterin etwa 45 Gewichtsprozent

Tocopherole enthaltend Οζ-, Jf- und O-Tocopherol etwa 20 Gewichtsprozent

Squalen geringe Mengen

Die Tocopherole in der nichtverseifbaren Fraktion wurden als natürliche Tocopherole auf der Grundlage der in der folgenden Tabelle 6 angegebenen Daten identifiziert.

409885/1 U6

Tabelle 6

c£- Tocopherol

J— Tocopherol Q - Tocopherol

Farbreaktion

Emmerie-Engel- Reaktion

Rotfärbung

Furter-Meyer-Reaktlon

Rötlich-braune Farbe

O	ο
JJ	co
Q	co
"P.	co
'T-	cn
a	—*
ΓΠ
ο

Dünnschicht-Chromatographie

(Lösungsmittel) Chloroform

(Lösungsmittel) n-Hexen/ Äther/Eisessig

Rf Ο.65 - 0.7 Rf O.3I

Rf Ο.45 - 0.5 Rf Ο.25

Rf Ο.25 Rf 0.18

297 - 298 nm 296 - 297 298

Ultraviolett- Soja-Sterin absorptions-

spektrum (Wel- Kontrolle lenlänße der maximalen Ab- Merck Index 8th sorption)

295 nm

290

294

296 - 297 nm
296 - 297
298

.mit Chloroform wurden schwache Flecken bei Rf-Werten von 0*98 und 0.92 zusätzlich gefunden und als von Verbindungen stammend identifiziert, die Tocopherolen ähnlich sind und eine ^ phenolische OH Gruppe aufweisen. ^j

cn

cn

K)

- 3k -

Die Fettsäureester, die in dem nichtverseifbaren Material enthalten sind, wurden durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie als Ester der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Linolensäure und dergleichen identifiziert. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt:

Tabelle 7

Maximum Retentions- Verbin- Maximum Nr. zeit (Min) dung Nr.

Retentionszeit (Min)

Verbindung

50	9	Laurin säure
8,	7	Myrietin säure
15,	Palmitin säure

PA,

PA,

PA,

280 Stearinsäure

31,4 . Oleinsäure

39,0 Linoleinsäure

Die nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl besitzt eine bräunliche Farbe und ist bei Raumtemperatur ein opaker halbfester Körper. Wird die Fraktion auf über etwa 80°C erhitzt, so verwandelt sie sich in eine durchscheinende ölige Flüssigkeit .

Herstellung von Granulat, das die nichtverseifbare Fraktion ▼on Sojabohnenöl enthält:

Die nichtverseifbare Fraktion, die, wie oben erwähnt, hergesteliyWurde, wird im allgemeinen in verkapselter Granulatform verwendet. Bei der Granulierung ist es erforderlich, als Absorptionsmittel eine Verbindung zu verwenden, die Öl stark absorbiert und nicht die Stabilität der in der nichtverseifbaren Fraktion enthaltenen Tocopherole beeinträchtigt. Die Verwendung

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von Silikaten als Trägersubstanzen muss vermieden werden, da derartige Träger Leberbeschwerden verursachen können.

Die bevorzugten Granulate sind derartige, die in Wasser leicht zerfallen oder zerbröckeln und die mit Hilfe automatischer Füllvorrichtungen leicht in feste Kapseln gefüllt werden können.

Ein hochgereinigtes Kieselsäureanhydrid, das durch thermische Hydrolyse von Siliziumtetrachlorid erhalten wurde (Aerosil Nr. 200 - hOO) wurde als Absorptionsmittel verwendet, um das antilipämische Mittel herzustellen, das in/den oben erwähnten Versuchen verabfolgt wurde.

Das hochreine Kieselsäureanhydrid wird zunächst der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl zugesetzt und mit ihr vendseht, wonach das Gemisch getrocknet wird. Das erhaltene Produkt wird dann zerpulvert. Mit dem Pulver kann ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, ChIorοthen, Methylenchlorid oder dergleichen verknetet werden, wobei das Pulver das Lösungsmittel absorbiert und ein Granulat liefert, das sich zur Füllung in Kapseln unter Verwendung einer automatischen Kapselfüllmaschine eignet.

Bei der beschriebenen Herstellung des Granulats wird vorzugsweise zusammen mit dem organischen Lösungsmittel in organischen Lösungsmittel lösliches Bindemittel_t wie Polyvinylpyrrolidon, ein Mischpolimerisat aus 2-Meth.yl-5-Vinylpyridinlnethacryl-

die säure, MethecryJat oder dergleichen,verwendet, um mechanische Festigkeit der erhaltenen Körner, ο wie die Qualität der daraus hergestellten Tabletten zu erhöhen«. Vm die Löslichkeit des Produktes in Kaiser weiter zu erhöhen, kann eine geringe Menge eines oberflächer.2ktiven Mittels, wie beispielsweise Natriuralaurylsulfal, PoJ 'oxyäthylenmonostetrat, Polysorbat oder ein Derivat von Rizinusöl oder Polyoxyäihylen oder ein Gemisch daraus den? Gemi sei; zugesetzt werden. Ilir die Tocopherole in der

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in der nichtverseifbaren Fraktion zu stabilisieren, kann ausserdem eine geringe Menge von Antioxidansien und Synergisten der Antioxiciaiisien, wie beispielsweise Vitamin C₁ Zitronensäure usw., zugesetrt werden.

Die so erzeugten Körner enthalten etwa 50 Gewichtsprozent der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl. Sie zerfallen leicht in Wasser und bieten den weiteren Vorteil, dass die Stabilität der in ihnen enthaltenen Tocopherole ausgezeichnet ist und sie keine Nierenbeschwerden hervorrufen.

Beispiel Π

470 g der nichtverseifbaren Fraktion von Sojabohnenöl, 20 g Vitamin C, 10 g Zitronensäure, JfOgCalciumcelluloseglykolat, 2O g Natriuralaurylsulfat, 10 g Polyoxyäthylenmonostearat und 600 ml eines halogenierten Kohlenwasserstoffs als Lösungsmittel wurden zu einer Suspension vermischt. Dieser wurden 390 g Aerosil 200 - 400 zugesetzt und mit ihr unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde dann bei etwa 5° bis 60 C zu einem festen Material getrocknet« Das feste Produkt wurde anschliessend pulverisiert. Dem Pulve^wurden 600 ml einer Lösung aus Chlorothen und Äthanol mit einem Gehalt von kO g Polyvinylpyrrolidon zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde verknetet und anschließend unter Verwendung eines ECK Pelletiergerätes granuliert. Die cirhalteiiPti Körner- wurden bei etwa 50 C zn eineip nichtkle-

'jn Produkt getrocknet. Der Gehalt an nichtverseifbarer Frak tion von SoJabohnen-'jl in dem Granulat betrug »7 Gewichtsprozent. Die Körner zerfieJen in Wasser leicht. ."-:&λ -rdem war die Stabilität der Tocoph'··! ■■ !*- in dem Granula⁴" '^j...;^~€ zeichnet.

.-in» gerit»; t- M^r^r f;j:>s Schmiermittels, - ie be:fepielsweise : 1 -ιgi.esiiuns t ea^T<,*) *.. . 1 a'ui _;r>-wünscht enl'ai 1 : — Granulat zu,;"3<>tst nerden, tun da? I ir ^f ;illt_;n in Kapseln mit i"·* Lfe einer herki rimi⁴ ch: automatischen Kapo-.Lfüllmaschine zu er'■■■>: c-'itern .

409885/11*. ς-

COPV BAD

Claims (6)

1. 2 3 3 A 6 5

   Patentansprüche

   (T]₁ Antilipamisch.es Mittel, enthaltend eine nichtverseifbare Fraktion von Sojabohnenöl in einer zur Unterdrückung des Lipidgehaltes des Blutserums wirksamen Menge. " -
2. 2. Mittel geniäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtverseifbare Fraktion Pflanzensterine und Tocopherole enthält.
3. 3. Mittel gemäsa Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzensterine etwa 4,5 Gewichteprozent der nichtverseifbaren Fraktion und die Tocopherole etwa 20 Gewichtsprozent der nichtverseifbaren Fraktion ausmachen.
4. 4. Mittel gtaäis Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, das· die Pflanzensterine Campesterin, Stigmasterin, ß-Sitosterin oder Gemische daraus darstellen«
5. der 5« Mittel geaäss einem vorgehenden Ansprüche, dadurch g · k e η η ζ «iclinet, das· sie einen oral verabreichbaren phazeutischen Träger enthalten.
6. 6. Mittel fealis Aatprueh 5. 4 a d η r ο h g m ic · m η " zeichnet, das· €mr pharmazeutisch« Ττϋςτ Ki«a«la«ur··» anhydrid

   ReWa/Schl

   40 98 85/T 1-4 6