DE2301766A1

DE2301766A1 - 3-substituierte rifamycine und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2301766A1
Application number: DE2301766A
Authority: DE
Inventors: Renato Cricchio; Nicola Maggi
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1972-01-19
Filing date: 1973-01-15
Publication date: 1973-07-26
Also published as: CH564554A5; CA991636A; AU466810B2; SE383152B; BE794298A; NL7300610A; IE36939B1; RO62774A; AU5109973A; FR2181676B1; FR2181676A1; HU165387B; DD103236A5; LU66851A1; DK135995B; DE2301766C3; SU444372A3; AT320855B; NL159388B; GB1388880A

Description

Gruppo Lepetit S.p.A, lsi 1 and/I talien

3-substituicrte Rifamycine und Verfahren zu ihrer

Herstellung

Gegenstand der 3rfinduriR· sind 3-substituierte Rifamycine der allgemeinen Formel I und ihre 25-Desacetyl- und 16, 17, 1d, 19, 2ü, 29-Hexahydroderivate

:.le ..le

HO

Me

,vieO

in der R ein Vasserstoffatom, ein niederer Alkyl-, ihen,yl- oder Phenyl-nieder-alkylrest ist und R und

2
R zug?, QTien eine carbocyclische Kette darstellen, die mit der Doppelbindung des angrenzenden Tnidazolrings einen 3e.izolring oder einen mono-oder poly-

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substituierten Benzolrin& bildet, in dem die Substituenten unabhängig voneinander Halogenatoms, niedere Alkyl-, niedere ulkoxy-, Carboxy-, Oarbalkoxy-, SuIfo-, SuIfamoyl-, Hitro-, Trifluormethyl-, Carbamyl- oder»Mono- oder Di- nieder-alkylcarbamylreste oder den iviethylendio:cyrest darstellen, oder einen substituierten oder unsubstituierten ankondensierten inehrkernigen aromatischen Rest mit 2-3 ankandensierten Ringen, von denen jeder 5-6 Kohlenstoffatome enthält.

Die vorliegend verwendeten Ausdrücke "niederer Alkylrest" und "niederer Alkoxyrest" stellen gewöhnlich geradkettige oder verzweigte aliphatisch^ Eetten ;aiit 1-6 Kohlenstoffatomen dar. In den Rifamycinverbindungen der allgemeinen Formel I, in denen gemäß der

Λ 2
obigen Definition R und R zusammen carbocyclische Ketten derstellen, die "ankondensierte mehrkernige aromatische Reste" bilden, ist der Substituent'mJ-Stellung gewöbiLich ein Imidazolring, der mit einem naphthalin-, Acenaphthen-, ffluoren-, Anthracen- oder Phenanthrene ing kondensiert ist.

Diese aromatischen Ringe können auch Substituenten, wie Oxo-, Hydroxy- und Sulfogruppen enthalten.

Die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung werden durch Umsetzung von J-Formylrifamycin SV oder seinem 25-Desacetyl- oder Hexahydroderivat mit einem aromatischen ortho-Diamin der allgemeinen Formel

HiT

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hergestellt, in der R, R_x. und Bedeutung haben.

die oben angegebene

Die erhaltene Schiffsche Base III oder ihre isomere Imidazölinform wird dann nach dem folgenden Schema zu einem Imidazolderivat oxydiert. Dieses Schema erläutert den Fall, bei dem als Ausgangsstoff 3-Formylrifamycin SV verwendet wird. Menu der Rifamycinanteil während der Oxydationsstufe in das Chinon umgewandelt wurde, wird das Ghinon durch «Väschen mit Ascorbinsäurelösung oder anderen äquivalenten Reaktionsmitteln •zum entsprechenden Hydrochinon reduziert.

Me

2) Ascorbinsäure

Luft, Kupfer- II-salze, !^uecksilber-II-oxid, Mangandioxid, Isoaaiylnitrit, Kai iumf err icy anid und Bleitetraacetat sind die geeignetsten Oxydationsmittel.

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In einigen Fällen kann ö.ie Isolierung der Schiff'sehen Base oder des entsprechenden isomeren I.iiidi.zolins nicht erforderlich sein, da bei Durchführung der UJi-. setzung zwischen dein aromatischen Diarnin und dem 3-Formy!rifamycin SV Derivat in Ge_cea;art von Luft oder anderen viasserstoffakzeptoren c.ie endgültige Imidazolverbindung direkt gewonnen werden kann.

Nach einer bevorzugten Ausführungsfona des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine äniiiiiolekulare Menge eines ausgewählten ortho--"'Jiamins der allgemeinen Formel II bei 3aumtemperatur zu einer Lösung von 3-Formylrifamycin SV oder seinem 25-Desacetyl- oder Hexahydro-derivat gegeben. Das Gemisch wird bei einer Temperatur gehalten, die von Raumtemperatur bis zum Siedepunkt "· des Lösungsmittels betragen kann, bis die Umsetzung beendet ist, d.h. für 20 Minuten bis 5 Stunden. Die gewünschte Verbindung .vird durch Entfernung des Lösungsmittels gewonnen.

Das bevorzugte Lösungsmittel ist im allgemeinen ietrahydrofuran, jedoch können mit Vorteil auch andere organische Lösungsmittel verwendet werden, wie z.2. Dioxan oder niedere Alkanole. Das rohe Produkt kann durch Kristallisation oder Chromatographie gereinigt 7iTerden oder, wenn die Verbindung nicht als Imidazol erhalten wird, kann - «*$ als solches eier Gxydat ions stufe zugeführt werden.

Die Oxydation-wird vorzugsweise in einer Mischung aus Essigsäure und einem chlorierten niederen Kohlen Tasserstoff untex· Verwendung der -etwa äcui molekül ar en Menge Bleitetraacetat als Oxydationsmittel durchgeführt. Die Umsetzung wird bei einer Temepratur von - 5 bis 10 C-bewirkt und das iSndprodukt wird nach et.ν a 1-3

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gewonnen. Dia L"5sun^ »;ird nach dem. .feschen der or- £,heischen Schicht mit IC /s-iger wässriger Ascorbinsäure lösung, u.a die Ohinonf or:» des Hifaaycins in dii. entsprechende Hydrochinon zu überführen, zur ii'ocJrene eingeangt.

./ami die ICoxiö.sns ation ζ /iecneii de j. aromatischen Diajiin und den J-iOzca'/lrifaaycinderivat oder die Auf arbeitung cla j? JiS actions [produkte in Ge£;en:/art von Luft bei

atur durch;-efahrt v/ird, um-"-, die erhaltane s kainer oj.Mdativen Cyclisierung und eineia ./aschan uiit iLSCorbinsiure unterzogen werden, da sie bereits in der endgiltigen Luidazolform wie in der IJoriel I vorliegt.

Die erfindmi^.sgefaäioen Verbindungen stellen gefärbte Fettstoffe der, die aus !.!ethanol, Aceton, ilthylacetat, xetrsJiydrofuran, Dioxan oder ö.eren Gemischen kristallisiert werden können.

Je nach der Bedeutung der Substituenten R. und E₀ sind tie in den meisten organischen Lösungsmitteln mehr oder weniger loslich. ;/enn z.B. R^ und Ep einen Benzolring darstellen, sind dia erfindungsgemäßen Verbindungen in Ilthylacetat sehr gut löslich, v/'dhrend, -.renn die beiden Symbole umfangreichere aromatische Haste bedeuten, ein stärkeres Lösungsmittel, «vie z.B. Chloroform oder Dimethylforinamid erforderlich ist.

Die erfindungSöeia-r.i^xi Verbindungen haben gute antioakterielle Jir]rsa:akeit gegen Graai-positive und G-ramiie~ative 3akterien. Insbesondere zeigten repräsentative 3-liader dieser 7 ;rbindugen eine bemerkenswerte /irksankeit gec.en Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus heaiolyticus, Diplococcus

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pneumoniae und x^/cobactarium tuberculosis JEU₁-^a

In diesen Fällen beträgt die Hincect^he tion etv/a O,CO1 bis etwa' O₁Lp /cg/al. Die keit wurde auch in-Ge_oen;rart biologischer Flüssigkeiten, v?ie von Jäiaderseren bestätigt. Die erfini Verbindungen seifen auch eine gute gegenüber Staphylococcus aureus Stauen, dig gegenüber Rifa-npicin resistent siad. Ia repräsentativen inviitro Versuchen .vurde esc ,/achstua von Staphylococcus aureus ¹Iour, der gegen .Rifajipicin resistent ist, geherudt, ./enn nan die Verbindungen c.cr Beispiele 4, 5, b und 8 In einer Konzentration von 1-5 itg/ftl anwendete. Die Tozizit^'t diesor Verbindungen ist sehr gering.

line andere sehr wichtige Eigenschaft der erfindun^sgemäßen Verbindungen ist ihre Eennawirkung auf DlTS-Polycaerasen, die für Lymphoblasten aus .menschliche;a leukämisehen Blut charakteristisch sind, und gegen typische Hucleotidyl-Transferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verv/endet -.7erden. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist bekannt, da£ sie als v/esentlichen Teil ihrer P_Leproduiction in die Jirtszellen Polyaerasen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, ;rie z.B. Picornaviren oder Polioviren, die HilS-abhän^ige. EHS-Po lytaer as e erzeugen, während andere Gruppen, wie Leukämie-Sarkom Viren eine iöFS-abhängige Dx\8-Polyaerase tragen. Die Gegenwart und die außerordentlich .'/ichtige Bolle der SI\i"S-abh;in,₅igen DHß-Polyaierase (Gegen-Transcriptaee) bei Tumor bildenden Ii^iS-Viren v/urde von D. Baltimore, Mature, Ld. 225, S. 12C9 (1970) und von E.Ii. Temin u. kitarb. , ;Jature, 3d. 22o, S- 12ΊΊ (1970) entdeckt. Die kürzliche Entdeckung von lirS-a

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DITü-Pclymerase Enzy.ii in HIT.S-Iumorviren von iierarteii „7urde auch voa -aideren Autoren "beetj^;ti_.t, v/ie a.!b. 5-U-s cen nachfolgend ruf^sflihrten Literaturstellen hervorgeht: Green u. jiitarb., "..Ia chani sia of e?rcino~aneses by 2178 tu-aor viruses, I. A:i Ή,ιΑΑ-dspendent D^Ä-polyiaerase in auriae sarcoaa viruses" (Px^oc.-Tc-.t.Aced.Sei. U£A, "3: . 6?, S. 3Ö3 - 393, 1??0).-Epia^el-ian u. :.^:its.rb., "jiisr-acterization of the products of 1Ϊ.ΪΑ directed DJA-polymerases in onco^enic 3Iik viruses" (.-■äture, London, Bd. 227, S- 3^3■> 1970)·- I-Iatana'va u. -iitaro., "Γ..ΤΑ poly.inerase activity astociatad .vith SiTA tu.ior viruses" (Proc. iTat. Acad. Sei. USA, lbd. 67, 3. 14-3* 1'97C).- Ecoliiick u. i/dtarb., "Γ.ΓΑ syntiiesis by itTA containing tuaor- viruses" (Proc. 2iaf. Acad. Sei. υϊΑ, Ed. Ö7, Ξ. 1C34-, 1970).

Das Yorliegen von i^TS-Virsn in einigen Tumoren .Tird auch. durch andere Fakten gestützt: Gegen-Transeriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen gefunden, in deren Familien Brustkrebs aufgetreten war und bei denen innerhalb der Familien geheiratet .vurde (Scholn u. lütaro., -Jature, 3d. 231, S. 97» 1971)? während x-riori u. Zitarb., (Mature Hew Biology, Ba. 232, 5. 16,-1971) ans Zellen der Pleuralflüssiv-ieit eines Kindes ^it Lyaphadenitis ein Ge^en-2r-3.nscriptase enthaltendes, ?.ls jioP-1 bezeichnetes Yirus isolierten und es erfolgreich auf Gev/ebekulturen züchteten.

Das Vorliegen von SITS-Eomologen bei riienschlichem Bi'ustkrebs zu Tui-aorvirus-?J.\i'3 bui der Ue-tiaa der iiaus vmrde von R. Axel u. ..litarb., (iviture, Bd. 2355 S. 32, 1972) durch .iolekularhybridiss.tion3ver£uche demonstriert. Die ...ö/vlichkeit eines Yirus beia tiiensciiliciisn Brustkrebs ".-;urö.3 auch durch "."Die^tronenrjiilr.r-GS-.Ojyie .-lonschlicher ;,:ilch gestützt (Ii. L-. o^rkar u. ^itarb., Js.ture, .ά. 23c, Z. 1C5, 1972). Auf 'JLiikj A'-iX'ichtste Dx7S-l-o Iy ne rase

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Wirksamkeit und Virus-ähnliche Teilchen wurden auch' aus menschlichen Rhabdomyosarkomzellen isoliert (LicAllister u. Mitarb., Nature,. New. Biol.,. Bd. 235, S. 3, 1972). Zur Zeit existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind. Der meistversprechende Weg zur Chemotherapie von Viruserkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer //eise mit Viruspolymer as en oder mit von Viren transformierten Zellpolymerasen vereinigen, aber nicht mit den Polymerasen der <Virtszellen ciie die genetische Information der Viren kontrollieren. Spezifische Inhibitoren für Virus- oder durch Viren transformierte Zellenzyme und insbesondere Inhibitoren für Polymerasen von HH3-Tumorviren können eine beduetende Rolle bei der Bereitstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Leukämie und anderer Krebserkrankungen spielen.

Die Hemmwirkung der erfindun^sgemäßen Verbindungen «vurde an RInTS-abhängiger DiTS-Polymerase des Muridae-Sarkom Virus (endogen) und an der DxTS-abhängigen DInTS-Po Iy aer as ewirksamkeit gereinigter Enzyme untersucht. Man wendete hierfür die von C. Gurgo u. Mitarb., Mature, 2Je w Biology, Bd. 229, S. 111, 1971) beschriebenen Methoden an.. Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die •%-dTTP (tritiertes Thymindesoxyribοsidtr!phosphat)Einverleibung in die unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachfolgend beschrieben.

1) Isolierung des Virus und Reinigung der Viruspolymerase

Das Virus wurde wie zuvor beschrieben (Green u. ^itarb., Froc. Hat. Acad. Sei. USA, Bd. S7, 3. 335-393,

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1970, Hokutanda u. i,ütarb., Hature, 3d. 227, S. 1C2o-1028, 1970) aus durch Liuridae-Sarkom-Virus („ioloney-Isolat)veränderten Hattenzellen (73A1 Zellen) und aus durch I-Iuridae-Sarkoia Virus (Iiarvey-Isolat) veränderten luäusezellen (-.-ES Zellen) isoliert und gereinigt. Die Viruspolynerase r/urde durch Inkubation des gereinigten Virus nit 0,5 % HP-40 (nonidet P-40) in 0,1 molarem '2TaOl₅ 0,01 nolareai 'Iris-Puffer (pZ 7,5), 0,001 molarem .&Di£ während 5 Minuten "bei Saumtemperatur und durch Zonens-äntrifuvation in von 1p auf 30 ^:,v ajisteieender Saadaerose in 10 -a^. liatriujiphospharpuffer (pH / ^) 5 2,5 -^d LiivGlp, 10 m.i Dithiothreit und 5 7ö Glyzerin .vährend 24 Stunden bei 38 000 Up-i in einem Spin-co öd 41 Hotor 20-4C-fach gereinigt. Die .Spitzenfraktionen der EnzyQY/irk-(13 - 17) der 22 tjesaauelten !Traktionen vvurden

vereinigt und bei - 70 0 in 30 % Glyzerin aufbewahrt.

ya^rase Bestimmung

Dia Enzyoiinl^ubation ..-urde eine Stunde bei 37 C in 100 ^iJL eines Gemisches durchgeführt, das 40 nid 'Iris-Puffer (pH 8,0), ρ ad Dithiothreit, 30 -ulä HaOl, 2,5 UgGl^, 0,1 mil dATP, dGTP, dOTP und 10/tCi ^H-dTTP (12 - 18 Ci/-.lillimol) enthielt, vergleiche Green u. litarb. in Proc. Hat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 3ö5 393, 1970. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 150 Al 1n Perchlorsäure beendet. Als Träger wurde Kalbthymus-DHS (100^) zugefügt. Das radioaktive DNS-Produkt wurde wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen beschrieben aufgearbeitet. Die endogene RNS-abhangioe DHS-Polymerasewirksamkeit wurde nach der Zugabe von 0,01 /i 1ΪΡ-40 zu den gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gauessen. Die DHS-Polymerasewirksauikeit der vereinigten Yiruspolynerase ^urde mit 2^g von Poly d ΓΑ-Ι^ν' als Platts, und ohne i'iP-4C gemessen.

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test zur Ermittlung der lieaa.wirkung, von HifaaycinDerivaten

Rifamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (D-ISC) in einer Konzentration "von 5 'ag/al gelöst und bei 4° C aufbewahrt. Die Hemüiung der endogenen HITS-abhängigen DInS-Polymerasewirksamkeit v/urde dadurch untersucht, da^ man 2 .la. des in DMoO exit sprechend verdünnten Derivats oder 2^.DiISO (Kontrolle) zu. dea Probengemisch ^.ab, bevor man dieses dem aufgebrochenen Virus zufügte, das Ip bis 30/ig Virusprotein enthielt. Die Bnzyminkubation ,^r;urde 60 Minuten bei 37° Q.durchgeführt. Die Hemmung des gereinigten Enzyms fmr de durch Yoriniaib ation von 2 ^u.]. des .Derivats oder von DkSO mit 30 ,,&&- -)nzy:a (1 bis 2./*% Protein) vTährend 10 Minuten bei 37° ^ untersucht. Dann wurden 7O_xAL Substrat^eaisch zugegeben and das Ge.uisch ;iurde T/eiter inkubiert und aufgearbeitet- ule oben beschrieben.

In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 - 10Qi«g/ml

oder weniger die Einverleibung von K -αϊΤΡ auf weniger als 10 %, als sie in den' Kontrollvarsuchen festgestellt wurde. Sie demonstrieren daait eine klare Eenim-■wirkung auf den liechanismus der Carcinogenese durch EHS-Tumorviren nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen.

Die Hemmwirkung von Gegen-Transcriptasen τ/urde auch durch Versuche, an Polyoaerase aus IIuridae-Leukäiiiie Viren bestätigt. Muridae-Leukäiaie Virus iSTS-abhängige DIfS-Polymerase wurde wie von G-allo u. Hitarb, in ITature, Few Biology, Bd. 232, S. 141, (1?71) beschrieben aus mit Triton X 100 auf^eorcchenen Viren hergestallt« Viren der beiden Arten lR^usc^er und ^oloney ^fmraen zu-

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vor durch Bindung" im 1,15 g/nl Bereich eines Saodaarose-Dichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur.Entfernung von Zellbruchstücken und Dämpfen auf 60 % Saatiarose über 20 >ό Saccharose gereinigt. Die Endkonzentration des Viruspräparates

11
betrug 10 Teilchen/oil. Als Platte wurde endogene

7Ö SR.jtf.S. verwendet. Es wurde festgestellt, daß Konzentrationen von 50 /tg/a-1 oder weniger das Enzym .virksam hemmen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von lumor-Zellpolyiaerasen menschlichen Ursprungs erhalten. In diesea Fall wurde die Hemmwirkung auch an FoIymerasen normaler Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative lüfamycinderivate der allgemeinen Formel I wurden auf ihre Wirkung auf 2 gereinigte DlTS-Fo lymer as en untersucht, die aus (I) menschlichen normalen (P£A-stimulierten) Blutlymphocyten, (II) LymphoDlastzellen (von einem normalen Spender) und (III) menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren. Es wurden synthetische und/oder native Platten verwendet. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachfolgend beschrieben:

Menschliche Blutlymphoblasten.

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphocytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrocyten durch hypotonieche Auflösung entfernt. Formale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Uylon-Säulenehromatographie erhalten. Sie vmrden wie zuvor beschrieben (G-allo u. l/Iitarb., ITature, 3d. 226, S. 927, 197C; Gallo u. Mitarb., Science, Bd. 1S5, S. 4-00, 1968) 72 Stunden mit

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Fhytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DiTS-Fclymerasewirksamkeit-so weit Nie möglich zu verstärken. ,7e_e:i des 'Problems, ausreichende Wiengen dieser Zellen zu erhalten, ■wurde jedoch zur Gewinnung weniger gereinigter DM^-S-Po lyme- rasen für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebe-Zellkultur (1788) verwendet. Die interessierenden Verbindungen wurden dann genauer an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphocyten untersucht. Die Gewebe-Zellkulturen wurden von der Associated Biomedic Systems, Inc. erhalten.

DIfS-Po lymer as e Präparate

BFS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut (PHA-stimulierten.)-lymphocyten, leukämischen Blutlymphocyten und 1788 Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/oder starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. Uach der Differentialzentrifugation eurae,i die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über BAAA-Cellulose Fhösphocellulose und Sephadex G.200 weiter gereinigt .

untersuchung der DisfS-Polymerase.

Die Untersuchung der DHS-Polymerase vrarde in einem Bndvolumen von 100/λΧ durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 ml Tris-HCl Puffer von pH 8,3; 6,0 mM Magnesiumacetat; 8,0 mM Dithiothreit und öO FaCl. Die Einstellung des pH Wertes .rairc.e -.lach der Zugabe der zuvor in Dirnethylsulfoxid (DLiSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Sindkonzentration an DMSO betrug 0,p % und alle Kontrollproben enthielten

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diese ../lange an D^iSO. Im Versuch vrarde eins Enzymkonaentration vsr/endet, weiche die Einverleibung von et./a 1 ,C p"..ol/.3tunde katalysiert. Das ~3η.ζγ& --rar in den maiütsn Fällen mit de α Inhibitor 5 ivlinutea vorixzxubiert ./orden. Die Umsetzung wurde daxin durch die Zugabe von entv/ec^:-er synthetischer IMS (Poly d(AT) allies Lab.) und Du-E,.Z_>3 Hybrid (Oli^o dT.poly rA), 5/*g/'Jil, oder nativeii Ursprungs: aktivierte Salm Sperua-Diiö, 50yt^/'^l und endogene ?O£ Yirus-R,j.S; 1o/u0i (^H-MethyI)-TTP (i7e>/V Biigland iluclaar, 16.6 inCi/y^u/iol, lyophilisiert und erneut gelöst in C,01 a HCl unmittelbar vor der An./endunr) und dl'Ilr¹ (8 3c 10"^M, mit synthetischer Substanz) ode::· allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 10"^L nit ZJ3 oder D^'S) durchgeführt. In einigen !Fällen wurde da£ Snsya nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert. In diesen Fällen ivurden die Reaktionen durch die Zugabe von Enzym zu dea vollständigen Gemisch, einschließlich des Inhibitors eingeleitet. Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten ./urden Prooen entnommen, die Vorgänge in ihnen durch die Zugabe von 2 ml 0,08 M Fatriumpyrophosphat unterbrochen und in 12,5 #-ige kalte Trichloressigsäure (TCS) mit Hefe-EiTS (40Oy^) als Träger gefällt. Die Produkte wurden-auf einem Milliporenfilter gesammelt, gründlich mit 5 % Trichloressigsaure und 1 ml DjüSO-Äthano 1-0,1 molarem NaCl (Ο,5ί7Ο:29>5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml (Beckman) und 10 ml Liquifluor (New England

ITuclear) in einem Packard Flüssigkeit-Szintillationszaliler gezählt.

Es .rurde gefunden, dall Konzentrationen von 5 bis 20/<&/üil bei ,synthetischem DITS-Templat eine 50 %-ige Hsra-iiung; öer Leukiaie-Polyaierase be/rirken. Bei synthetischen HZ.3-Terap 1 at (Poly rA.rU) war die Sealcbio:-.i so_:ar empfindlicher.

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Repräsentative Untersuchungen, ;.ie mit nativein Templat an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen.

Andere biologische Eigenschaften der neuen liifaiiiycinderivate sind die Hemmung, der Foioisbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menschen durch den -.ioloney- und Kirsten-Stamm des Iviuridae-Sarkoai Virus; die selektive Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Haus- und menschliche Zellen; die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch ■ Muridae-Sarkom Viren veränderten nicht-produzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die Eydrazonverbindungen der Erfindung haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Hausen, Ratten und Menschen erwiesen, wenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden. ' ·

In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Lloloney-Sarkom-Virus bei BALB/3T3 Gewebekulturen zu hemmen, wird das folgende Verfahren angewandt. BAIB/3T3 Zellkulturen werden in 250 ml Kunststoffflaschen in einem Vachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem wesentlichen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht. Mit einem Coulter Zähler werden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-Versen und dem Verdünnen mit /iachstumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird Moloney-Sarkom-Virus verwendet» Man unterwirft es viermal in einem Mausembryo der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl einer Zellpassage und untersucht -die Fokus bildenden Einheiten in 3ALB/3T5 Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen jrird eine Modifizierung der von Hartley und Howe, Proc. Nat. Acad". Sei. Bd. 55₅

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S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt. Im vorliegenden !fall werden Flaschen mit 1-2 χ 10 Zellen in 25 ml Wachsturnsmedium geimpft und 24 Stunden bei 37° G inkubiert. Fach der Entfernung der Flüssigkeiten wird Viri^s mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus bildenden Einheiten in 0,5 elL viachstumsmedium eingeführt. Dann läßt man es 90 Minuten bei 37° C auf der Monoschicht der Zellen adsorbieren. Nach dieser Adsorbtionsperiode wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich etwa 5 "bis 10 yttg/ml eine Imidazol-Rifamyeinverbindung (zuvor in einer Konzentration von 1mg/ml in Dimethylsulfoxid gelöst) in 25 ml vifachstumsmedium zügefügt und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgegeben. Als Kontrolle wird Dimethylsulfoxid allein im V/achstumsmedium zu einer getrennten Kultur gegeben. iTach 3-"tägiger Inkubation sind die Kulturen flüssigverändert und die Foki veränderter Zellen werden am Tag 7 gezählt.

Auf die gleiche Weise wird Bläschenstomatitis Virus, New Jersey Serotyp untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett und Mitarb», in Virology, Bd. 31, S. 114 (1957) beschrieben. - ' [ Diese Eigenschaften zeigen an, daß die erfindungsge- ; mäßen Verbindungen Hemmwirkung auf durch Viren her- : vorgerufene Tumoren bei Tieren haben.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

3-(2-Benzimidazolyl)-rifamycin SV

Eine Lösung von 2,7 g 3-EOrmylrifämycin BY und 0,33 g o-Phenylendiamin in 30 ml Tetrahydrofuran vrird 30 _ Minuten unter Rühren auf 0-5 C gehalten. Each dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der erhaltene Feststoff als solcher für die nächste Stufe verwendet. Eine aus Methanol kristallisierte Probe der reinen Verbindung schmilzt bei 252 - 255 C. Ausbeute 30 %. 1 g der so erhaltenen Schiff'sehen Base wird in einer Mischung aus 10 ml Essigsäure und 20 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst und nach dem Kühlen in einem Eisbad werden 0,5 S Bleitetraacetat zugefügt. Fach 2 Stunden bei 0 - 5° C wird das Gemisch mit Tetrachlorkohlenstoff verdünnt und mit 10 %-igeir wässriger Ascorbinsäurelösung gewaschen.

Die organische Phase wird getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand wird aus Aceton oder Methanol kristallisiert. F = 189 - 193° C (Zersetzung); Ausbeute 40%.

max OMO 325 ' 460

E¹ °^/ö - 322,5 174,4

Beispiel 2

25-Pesacetyl—3-(2-benzimidazolyl)-rifamycin SV

Eine Lösung von 5 S 25-Desacetyl-3-formylrifamycin SV und 0,7 g ο-Phenylendiamin in 100 ml Tetrahydrofuran wird unter Rühren 2 Stunden in einem offenen Gefäß

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auf 3auiatemperatur gehalten. ITaeh.. dem Abdampfen, das Lösungsmittels 7/irö ein Rohprodukt erhalten, das nach der Kristallisation aus methanol "bei 195 196° G schmilzt. Ausbeute 2,5 w.

Λ max (mn ) 326 462

351 191

Beispiele 3-8

ITach dem Verfahren des vorstehenden Beispiels wurden untbr Verwendung der entspKchenden o-Diamine und von 3-3Or^-Irifamycin SV die folgenden ^-substituiert'-;*. Rifamycin 3V Derivate arhalten.

Bei- Amin Substituent i¹, C /Amax E

spiel in 3-Stellung aiu, 1 cm

von Rifamycin /

3V

3 3,4-Toluoldi- 5-Methyl-2- 136-7 464 165,5 3-min benzimidazolyl- 328 316,4

4 4,5-Dimethyl-o 5,6-Dimethyl-2- 465 14-9 -phenylen-dia- benzimidaaolyl- 180 332 296,3 min

5 4-, 5-Acenaphthen-4,5-Dihydro-7H diamin -acenaphth/4,5

-dj imidazol-δ- 220 485 140,4 yl- Zers. 360 246,1

6 4-Chlor-o-phe- 5-Chlor-2-ben~ 215-6 465 166,1 nylendiamin zimidazolyl- Zers. 328 326

7 2,3-Pluorendi- 1,9-Dihydro-

aain fluoreno/"2,3-d7 200 485 132,5

imidazol-2-yl- /jers. 356

8 1,2-Diaminoan- 6,11-Dioxo-an thrachincr tirra/Ί ,2-d/imi- 230

• dazol-2-yl- . ?,ovs - ' .??

309830/1222

Beispiel 9
3-(lH-9-oxo-f luoreno/2,3-d/ imidaaol-l-yl)-rif-j.,iyci

Sine Lösung von. 4-,2 g 2,3-Diaminofluoren-9-on und 14 J-Eormylrifamycin in 200 ml Tetrahydrofuran vfird 3 Stunden zum Sieden erhitzt. Nach dem Kühlen wird der ausgefallene Feststoff durch Filtrieren gewonnen. i¹ = -230° C (Zersetzung); Ausbeute 12,5 g.

max {sau, ) ' . 470 · 310 256

139,2 '357,1 388,3

Beispiel 10

3~(5~Qai't^>o3cy-2-'benzimidazolyl)-rifamycin tiV

Diese Verbindung wird nach dem Verfahren des Beispiels unter Verwendung von 3,4-Diaminobenzoesäure anstelle von 2,3-Diaminofluoren-9-on erhalten. Έ = 215° C (Zer

setzung).	■	328
A max (mit.)	462	310,1
1% E 1 cm	161

Die Mikroanalysenwerte der in den Beispielen beschriebenen Verbindungen stimmen mit den theoretischen Werten überein.

ITach. den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren wurden ferner dib folgenden 3-su:^tii:vierten

309830/12 2 2

Rifamycin SV Derivate bezw. ihre entsprechenden ·'[;

25-Desacetyl- und Hexahydroverbindungen hergestellt.

Ausgangsamin Substituent in 3-Stellung

von Rifamycin SV

A-- üitro-o-phenylendiaaiin 5-iiitro-2-benzimidazolyl

4—Dirnethylcarbamyl-o-phenylen- 5-Dimethylcarbamyl-2-benzim:Jdadiamin ζοIyI

4—Butyl-o-phenylendiamin 5-3utyl-2-benzimidazolyl

4—Pentyl-o-phenylendiamin 5-£eE-'t^;yl-2-benzi:üiidazolyl

3-iTitro-o-phenylendiamin 4—xTitro-2-benzimidazolyl

4—Brom-o-phenylendiamin 5-3rom-2-benzimidäzolyl

4-Fluor-o-phenylendiamin 5-5¹lu.or-2-benziiHidazolyl

4-, 5-Dichlor-o-phenylendiamin .5»6-Dichlor-2-benzimidazolyl 4-, 5-Dimethoxy-o-phenylendiamin 5»6-Dimethoxy-2-benzimidazolyl

4-, 5-Diäthoxy-o-pJtienylendiamin 5»6-Diäthoxy-2-benzimidazolyl

4,5-Methylendioxy-o-phenylen- 5»6-Methylendioxy-2-benzimidadiamin zolyl

4-,5-Dinitro-o-phenylendiamin 5»6-Dinitro-2-benzimidazolyl 4-Sulfamoyl-o-phenylendiamin 5-Sulfamoyl-2-benzimidazolyl n-Athyl-o-phenylendiamin 1-lthyl-2-benzimidazolyl

N¹-Methyl-4-trifluormethyl-o- l-Methyl-5-trifluormethyl-2-phenylendiamin benzimidazolyl

N¹-Methyl-4-,5-dimethoxy-o- 1-Methyl-5,6-dimethoxy-2-phenylendiamin benzimidazolyl

IT-Benzyl-o-phenylendiamin . 1-Benzyl-2-benzimidazolyl lf-Phenyl-o-plmylendiamin l-Phenyl-2-benzimidazolyl

3,4—Diaminobenzesäure- 5-Garbäthoxy-2-benzimidazolyl äthylester

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2—Ohlor-4, ^-diaminolDenz olsftlfonsäure

9,1O-Phenanthc endi amin

1,2-HaphthalirLdiaoiin

1,2-Diamino-4-naphthalinsulfonsäirre

Λ ,2-Diamino-4—^Jienanthcensulfonsäure

6-Ghlor-5-sulfo-2-benziiüi:'.azol3^rl

Phenanihco /9, 1C-d/ iaidazol-

2 1

-yl

,2-dJ i.aic.azol-2-yl

5-Suif 0-naDhtJb.o^l ,2-d/ imidazol -2-yl "

5-Sulf o-phenanihro [Λ ,2-dJ iruidasol-2-yl

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Claims

A ΐ

Λ ΐ

Si

^-substituierte Rifamycine der allgemeinen Formel

.ie COC

in der H ein ./asserstof fatom., ein niederer Alkyl-, ein Phenyl- oder Phenyl-nieder-alkylrest ist, R. und Rp zusarumen. eine carbocyclische Kette bedeuten, die mit der Doppelbindung des angrenzenden Imidazolrings einen Benzolring oder einen xaono-oder polysubstituierten Benzolring bildet, in dem die Substituenten unabhängig voneinander Halogenatome, niedere Al¹^yI-, niedere Alkoxy-. Carboxy-, Carbalk-O3CV-, SuIfο-, Sulfamoyl-, Hitro-, 'Trifluorüiethyl-, C&rbsmyl-, llono- oder Oi-nieder-alkyl-carbamylgruppen oder den Hethylendioxyrest bedeuten, oder einen substituierten oder unsubstituierten ankondensierten raehrkernigen aromatischen Rest mit 2-3 kondensierten Ringen, von denen jeder 5—6 Kohlenstoff atome enthält, und deren 25-Desacetyl-und 16, 17, 18, 19» 28, 29-Kexahydroderivate.
2. Verfahren zur Herstellung, der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daS nan 3-

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«a

IFormylrifamycin oder dessen 2>-Desacetyl- oder 1.6, 17, 18, 19, 28, 29-Hexatijdroderiva-te -ait o-Biamin der allgemeinen Formel

in der }ψ R₁ ^R₂ R umsetzt, und

die oben angegebene Bedeutung haben, die erhaltene Verbindung: mit eineai Wasserstoffakzeptor, nämlich luft, Eupfer-11-ss.lsen, ^uecksilber-II-oxid, 'xiajogandioxid, Isoaiiiijlnitrit, Ealiumferricyanid oder Bleitetraacetat behandelt, und, wenn die erhaltene Verbindung- in der Chinonform vorliegt, sie mit Ascorbinsäure zum entsprechenden Hydrochinon reduziert.
3. Therapeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1 sowie übliche Substanzen enthält.

lur

Gruppo Lepei^it S.p.A. Mailand/Italien

/■

Dr-HVJ. Wolff

Ee cht s anwalt

309830/1222 r