DE2264727C2

DE2264727C2 - 6-Amino-9-benzylpurinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltendes Geflügelfutter

Info

Publication number: DE2264727C2
Application number: DE2264727A
Authority: DE
Inventors: Walter Marlin Mundelein Ill. Barker; Emil Patrick Des Plaines Ill. Lira; Robert Charles Lake Zurich Ill. McCrea
Original assignee: International Minerals and Chemical Corp
Current assignee: International Minerals and Chemical Corp
Priority date: 1971-03-03
Filing date: 1972-03-02
Publication date: 1982-11-11
Also published as: DK127119B; US3846426A; NL159984B; IT1008524B; AU3915672A; DE2210537A1; FR2128600A1; ES400334A1; AR197466A1; FR2128600B1; JPS5420519B2; CA1011335A; JPS52144694A; NL159984C; AU444105B2; JPS5416571B1; DE2264727A1; NL7202893A; BE780082A; DE2210537C2

Description

worin Ri Chlor oder Fluor ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Adenin und ein 2,6-Dichlorbenzyl- bzw. ein 2-Chlor-6-fluorbenzylhaIogenid in Gegenwart einer Base in einem inerten Reaktionsmedium umsetzt.

3. Geflügelfutter, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1.

Die Coccidiose ist eine weit verbreitete Geflügelkrankheit, die durch Infektionen mit Protozoen der Gattung Eimeria, die schwere Erkrankungen der Eingeweide und Cöcalwege des Geflügels hervorrufen, verursacht wird. Einige der wichtigsten Arten sind E. lenella, E acervulina, E. necatris, E. brunetti und E. maxima. Die Krankheit wird im allgemeinen durch die Vögel, welche die in dem Kot, in verseuchtem Dung oder in verseuchtem Boden vorhandenen infizierenden Organismen aufpicken, oder mit dem Futter oder dem Trinkwasser übertragen. Die Erkrankung äußert sich in schweren Blutungen, in der Ansammlung von Blut in den Cöca, durch im Kot vorhandenes Blut, durch Schwäche und durch Verdauungsstörungen. Die Erkrankung führt oft zum Tode der Tiere bzw. der Wert der Tiere, welche die schweren Infektionen überlebt haben, ist als Folge dieser Erkrankung stark gemindert Daher ist die Bekämpfung der Coccidiose von großer wirtschaftlicher Bedeutung; ausgedehnte Untersuchungen sind unternommen worden, um neue und verbesserte Methoden zur Bekämpfung und Behandlung der coccidialen Infektionen beim Geflügel aufzufinden.

Es wurde gefunden, daß bestimmte 6-Amino-9-benzylpurine überraschenderweise einen unerwartet hohen Grad an Aktivität gegenüber Coccidiose beim Geflügel zeigen. Bei Verabreichung einer kleinen Menge mindestens einer dieser Verbindungen, vorzugsweise in Kombination mit Geflügelfutter, wird das Auftreten der Coccidiose wirksam verhindert bzw. stark gemindert. Die Verbindungen sind sowohl gegen die cöcale Form (durch E. tenella verursacht) als auch die intestinalen Formen (hauptsächlich verursacht durch E. aeervulina, E. brunetti, E. maxima und E. necatris) wirksam. Die Coccidiostatika dieser Erfindung sind besonders gegen die Darmerkrankungen hervorrufenden Arten wirksam. Diese Verbindungen beseitigen nicht nur die durch die Coccidien verursachten Krankheitssymptome, sie üben auch eine Hemmwirkung auf die Oozysten aus, indem NHj

ι ^

vor, worin Ri ein Chlor- oder Fluoratom bedeutet.

Die Erfindung schlägt ferner ein eine der obigen Verbindungen enthaltendes Geflügelfutter :ίιγ Bekämp fung der Coccidiose vor.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, welches darin besteht. Adenin und ein 2,6-Dichlorbenzyl- bzw. ein 2-Chlor-6-fluorbenzylhalogenid in Gegen- wart einer Base in einem inerten Reaktionsmedium umzusetzen.

Zu geeigneten Reaktionsmedien gehören sowohl protische als auch aprotische inerte Lösungsmittel, welche mit den Komponenten des Reaktionsgemisches unter den angewandten Reaktionsbedingungen nicht reagieren. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Alkansäuredialkylamide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, Alkohole, wie Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Amylalkohol, Cyclohexanol und Benzylalkohol, einschließlich die wäßrigen Systeme, die bis zu 50% dieser Alkohole enthalten, Dimethylsulfoxid, Äthylenglykol und Diäthylenglykol.

Die zur katalytischer! Beschleunigung der Reaktion zwischen dem substituierten Benzylhalogenid und Adenin geeigneten Basen sind die aus der Technik bekannten, für die Katalysierung der Alkylierung von Adenin geeigneten Basen. Allgemein gehören hierzu alle jene Basen, die in dem verwendeten Lösungsmittelsystem eine zur Erzeugung des Adeninanions ausrei- chende Basizität aufweisen. Zu geeigneten Basen gehören beispielsweise Carbonate, z. B. Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat, Hydroxide, z. B. Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Lithiumhydroxid, tertiäre Amine, z. B. Trimethylamin, Triethylamin, Tripropylamin und Dimethylanilin, und Alkoholate, z. B. Kaliumäthylat, Natriumäthylat und Kalium-tert.-butylat. Bevorzugte Basen sind solche mit einem pKb-Wert über 10A durch welche das Adenin vollständig in das Anion überführt wird.

Die Mengenverhältnisse der Bestandteile der Reaktionsmischung können über einen relativ weiten Bereich variieren. Die Reaktionsteilnehmer können in stöchiometrischen Mengen, d. h. in gleichen molaren Mengen

M) der beiden Reaktionsteilnehmer, eingesetzt werden; es kann jedoch auch ein Überschuß, z. B. ein lOprozentiger molarer Überschuß oder größerer molarer Überschuß eines der beiden Reaktionsteilnehmer verwendet werden. Die Menge der eingesetzten Base kann gleichermaßen in weiten Grenzen variieren, wird jedoch vorzugsweise in mindestens stöchiometrischer Menge, vorzugsweise mit einem geringen Überschuß, verwendet. Auch die Menge des eingesetzten Lösungs-

3 4

mittels kann in weiten Grenzen variieren. Die 0,05 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,0025 bis 0,01

Lösungsmittelmenge wird so gewählt, daß die Reaktion Gew,-%, eines der erfindungsgemäBen Coccidiostatika.

mit einer vernünftigen Geschwindigkeit abläuft und die Die Verbindungen der Erfindung reduzieren die

Isolierung des Reaktionsproduktes erleichtert wird. Anzahl der Oozysten, die in den Kot von infizierten Die Reaktanten und der Basenkatalysator werden im s Hühnern gelangen, und/oder inhibieren die nachfolgen- Reaktionsmedium in üblicher Weise und in beliebiger de Teilung und Reifung bis zur Infektiosität, die Reihenfolge vereinigt Die Reaktionsteilnehmer und der wissenschaftlich als Sporulation bezeichnet wird. Die Katalysator werden vorzugsweise in einer solchen Kombination einer Verhütung des Kfankheitsbildes, Reihenfolge miteinander vereinigt, daß sich das gekoppelt mit der Hemmwirkung auf die Vermehrungs- Adeninanion bildet oder bereits vorliegt, wenn das io form dieser Organismen, die Oozysten, stellt eine Benzylhalogenid zugegeben wird, d. h. das Benzylhalo- einzigartige, zweifach wirkende Methode zur Bekkflip-

genid wird vorzugsweise zuletzt zugegeben. fung der Geflügelcoccidiose dar.

Die Reaktion wird am zweckmäßigsten bei einer Die neuen Coccidiostatika können schnell durch Temperatur im Bereich von 50° und 100⁰C durchge- mechanisches Mischen derselben in feingemahlener

führt, es können jedoch auch wesentlich niedrigere 15 Form mit dem Geflügeifutterstoff gemischt werden, der

Temperaturen verwendet werden, solange das Reak- nachfolgend mit anderen Bestandteilen unter Herstel-

tionsgemisch im flüssigen Zustand zu halten ist. Die lunr* der fertigen Geflügelfutternahrung gemischt wird,

Reaktion kann auch bei wesentlich über 100⁰C die an das Geflügel verfüttert wird. Typische Bestandtei-

liegenden Temperaturen durchgeführt werden, voraus- Ie von Geflügelfutternahrung sind beispielsweise Melas-

gesetzt, die Temperatur wird bei einem Wert gehalten, 20 sen, Fermentationsrückstände, Getreideschrot, Hafer-

unterhalb welchem sich die Komponenten des Reak- mehl oder Haferflocken, Weizenkleie oder grobes

tionsgemisches nicVu zersetzen. Weizenmehl, Luzerne, Klee und Fleischstücke, zusam-

Das Reaktionsprodukt. das entweder als reine men mit mineralischen Ergänzungsstoffen, wie Kno- Verbindung oder zusammen mit anderen sich bildenden chenmehl, Calciumcarbonat und Vitaminen.

Isomeren, z. B. den 1-, 3- und 7-lsomeren, anfällt, bleibt 25 VersuchsbeisDiel 1 entweder ganz in Lösung oder fällt nach einiger Zeit

aus, was von der Menge des verwendeten Lösungsmit- a) Die anticoccidiale Aktivität des erfindungsgemä-

tels, wie dargestellt, abhängt. Nach Beendigung der ßen 6-Amino-9-(2,6-dichlorbenzyl)purins wurde mit im

Reaktion kann das Reaktionsgemisch abgekühlt wer- Handel erhältlichen Coccidiostatika, welche in den

den, z. B. auf eine Temperatur von etwa 0°C, um ein 30 Tabellen I und Il als Verbindungen A [l-(4-Amino-2-N-

festes Produkt oder eine weitere Menge dieses propyl-5-pyridinyI-methyl)-2-picoliniumchlorid-hy-

Produktes zu fällen. Das Produkt wird dann in üblicher drochlorid plus MethyI-4-acetamido-2-äthoxybenzoat] Weise, wie durch F^!ltration, isoliert und gegebenenfalls und B (3^-Dichlor-2,6-dimethyl-4-pyridinol) bezeichnet

mittels herkömmlicher Methoden gereinigt, wie durch sind, verglichen.

Waschen mit Äthanol oder Wasser und Umkristallisie- 35 Bei den Tests auf Aktivität gegen E. tenella wurden

ren aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Essigsäure, von einer kommerziellen Brutanstalt als Eintagsküken

wäßriger Essigsäure, Dimethylformamid oder Di- bezogene White-Rock-Hähnchen so aufgezogen, daß

methylsulfoxid. sie auf keinen Fall einer unbeabsichtigten Infektion mit

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung Coccidien ausgesetzt wurden, bis sie 14 Tage alt waren.

der Erfindung. 40 Als die Küken 14 Tage alt waren, wurden sie einzeln

. . . gewogen und in Gruppen von je 10 aufgeteilt, so daß

° ^e'^{s p}'^e sich die Gruppen hinsichtlich Kükengrölie und durch-

6-Amino-9-(2,6-dichlorbenzyl)purin wurde hergestellt schnittlichem Körpergewicht im wesentlichen entspra-

durch langsames Zugeben von etwa 67,5 g (0,5 MoI) chen. Die Testverbindung, 6-Amino-9-(2,6-dichlorben-

trockenem Adenin zu einer Lösung von etwa 57 g (0,6 45 zyl)purin und das handelsgängige Coccidiostatikum, mit

Mol) Kalium-tert.-butylat in einem Liter absolutem welchem erstere zu vergleichen ist, wurden sorgfältig in Äthanol. Dieses Gemisch wurde etwa 2 Stunden gerührt getrennten Mengen eines Vitamin-K-armen Futterbreis

und dann mit etwa 97,5 g (0,5 Mol) 2,6-DichlorbenzyI- in bekannten Konzentrationen vermischt Jede dieser

chlorid innerhalb von etwa 4 Stunden versetzt. Die Futtermassen wurde ad libitium einer Gruppe von

erhaltene Mischung wurde unter Rühren zum Sieden 50 Küken angeboten. Anderen Gruppen von Küken wurde

erhitzt, etwa 42 Stunden reagieren gelassen, anschlie- der gleiche Futterbrei ohne Zusatz der Testverbindung

Bend auf etwa - 1O⁰C abgekühlt. Das so gebildete rohe verfüttert. Zwei Tage nach Beginn der Versuchsfütte-

6-Amino-9-(2,6-dichlorbenzyl)purin wurde durch Filtra- rung wurden allen Kükengruppen mit Ausnahme von

tion isoliert, dann mit eiskaltem Äthanol und eiskaltem drei Gruppen (30 Küken), die als nichtinfizierte oder

Wasser gewaschen. Es wurden 118 g Rohprodukt 55 negative Kontrollgruppen (NK) bezeichnet wurden, auf

erhalten. oralem Wege durch Gaben von 200 000 sponserten

Die neuen Verbindungen dieser Erfindung werden Oozysten von E. tenella in den Kropf inokuliert. Zwei

dem Geflügel zur Bekämpfung und Verhinderung der der auf diese Weise inokulierten Gruppen (20 Küken)

Coccidiose oral verabreicht. Eine Reihe herkömmlicher wurde der Futterbrei ohne Testverbindung verfüttert; Methoden ist zur Verabreichung der erfindungsgemä- 60 sie dienten als infizierte oder positive Kontrollgruppe

ßen Coccidiostatika an Geflügel geeignet, z. B. können (IK). Der Versuch wurde 5 Tage nach Inokulation der

sie dem Geflügelfutter beigegeben werden. Die Küken abgebrochen.

eigentliche Menge der dem Geflügel erfindüngsgemäß Die Sterblichkeitsrate wurde während des gesamten

verabreichten Coccidiostatika variiert über einen Versuchs aufgezeichnet. Am Ende des Tests wurden die

weiten Bereich und kann auf die einzelnen Bedürfnisse 65 Gewichtszunahmen ermittelt und Mikroblutsenkungen

je nach Art der betroffenen Coccidiose und der Schwere durchgeführt. Bei Durchführung der Blutsenkungen

der Infektion abgestellt werden. wurde jedem Tier eine Blutprobe mit einem heparini-

Eine Nahrung enthält typischerweise etwa 0,0005 bis sierten Mikrokapillarröhrchen entnommen, welches

dann zentrifugiert wurde, um den prozentualen Volumenanteil der sedimentierten Blutkörperchen zu bestimmen.

Die Ergebnisse dieses Versuchs werden in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I
E. tenella

Medikation	Medikation	Zahl der	Mittlere	Gew.-%	Zunahme	Blut	Sterb
des Futters	Gew.-% des	Küken	Gesamt	bezogen auf	gegenüber	senkung	lichkeil
	Futters		gewichts-	NK	IK	(%)	(%)
			zunahme (g)

keine, NK - 5

keine, IK. - 5

Verbindung B 0,0125 5

erfindungsgemäße

Verbindung 0,0045 10

198 112 203

197 100
56,5
102,5

99,5

176,8

100

181,2

175,9

33
14
33

32

60
0

b) Der Test auf Aktivität gegen E. ac- rvulina wurde im wesentlichen wie oben erläutert durchgeführt mit der Ausnahme, daß den Küken 5 300 000 sporulierte Oozysten von E. acervulina inokuliert wurden. Die Beobachtungen wurden auf die Gewichtszunahme und Kotbewertungen beschränkt. Die Kotbewertungen wurden während des gesamten Versuchs auf Grundlage der Menge des Schleims und der Konsistenz unter Benutzung der folgenden Bewertungsskala registriert:

0
1

2
3

kein

weniger als 10%
10% bis 50%
über 50%

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II
E. acervulina

η •ä	Medikation	Medikation	Anzahl	Gesamt	Gew.-% Zunahme	Kot
Ψ	im Futter	Gew.- % des	der Küken	mittel der	bezoacn auf	bewertung
M		Futters		Zunahme
W				(g)	NK IK

kein, NK
kein, IK
Verbindung A
erfindungsgem.
Verbindung

0.0125 5

0,0035 5

Versuchsbeispiel Il

Um die Wirkung des 6-Amino-9-(2,6-dichlorbenzyl)-purins auf Oozysten zu zeigen, wurden die folgenden Methoden benutzt.

Zwei Gruppen von 5 Küken (gleiche Art wie in Versuchsbeispiel I) wurden jeweils für 6 Versuche eingesetzt. Verschiedene Konzentrationen des Testverbindungen enthaltenden Futters wurden an die Vögel 24 Stunden vor ihrer Infektion mit E. acervulina verfüttert. 4 Gruppen von Kontrollküken wurde für den gleichen Zeitraum nichtmedikamentiertes Futter gegeben. Alle Küken wurden in den Kropf mit 500 000 sponserten Oozysten inokuliert. Am fünften Tag nach Inokulation wurde begonnen, den gesamten täglichen Kot zu sammeln. Der Kot jeder Gruppe wurde gesammelt, mit einer 2,5prozentigen wäßrigen Lösung von Kaliurr.di-

218 151

221

223 100
68,,8

ioi.4

102,3

144.4

100

146.4

147,7

chromat gemischt und homogenisiert, wovon ein Aliquot von 200 g entnommen wurde. Die irr· Kot enthaltenen Oozysten wurden fünf aufeinanderfolgende 1 age gesammelt, und die gesamte Oozystenerzeugung für jede Gruppe dann durch mikroskopische Auszähltechniken bestimmt. Die täglichen Proben aus den zwei Gruppen bei jedem Versuch wurden zusammengefaßt, gemischt und in einer weiteren Menge von 2,5prozentiger Kaliumdif 'lromatlösung durch Hindurchleiten von Luft di'rch jede Suspension für 48 Stunden bei 28°C sporuüert. Zwei Serien unterschiedlicher Öozystenzählungen, d. h. sporulierte verglichen mit nichtsporulierten, erfolgten bei jedem Test mikroskopisch. Die in Tabelle III gezeigten Ergebnisse zeigen die außerordentliche Hemmwirkung, «iie diese Verbindungen auf coccidiale Oozysten von Geflügel ausüben.

Tabelle III	Mini, /ahI	% OnAstcn-	".. Anteil	"n Sporuhition	(iesiinitretluklion*
Medikation	d. Oo/yslen	hililnng	il. sponserten	gegenüber	der sponserten
und % im	χ ΙΟ¹', Küken	gegenüber	Probe	kontrolle	Oo/vsten ( %l
Futter	Tag	Kontnillcn
	35.728	100.00	36.71	100.00
kein	0.051	0.14	0	0	HM)₁IiO
0,0045	1.200	3.36	0	0	KX).(K)
0.0035	9.589	26.84	2,90	7.90	97.8«
0.0025	16.858	47.84	5,36	11.24	94.62
0,0015	14,151	39.61	6.67	I6.S4	91 η
0.001

* 1(X) minus (% Oo/ystcncr/cugiing gegenüber Kontrolle χ % Spnrulalion gegenüber konlrollenl HMl prozentuale (ies.imtreduktion der sporiilierten Oozysien

Versuchsbeispiel III

Die andere ernndiingsgemäße Verbindung, nämlich 6-Amino-9-(2-chlor-6-fluorbenzyl)punn isl bei der Bekämpfung und VerhindernnB der (occidiosc etwa ehenso wirksam wie die in obieen Heispielen untersuchte, wie nachfolgende Tabelle IV zeigt."

Tabelle IV

Biologische Aktivität der errmdiingsgemäßen 6-Amino-9-Benzylpurine

fümeria % (im I utter)') liimeria 'Ό lim I nttcr)

lenella acerwilinu

Aktivität Aktivität

1. 6-Amino-9-(2.6-dichlorbenzyl)purin 5 0,0045 0.005 5 0.0025 0.0035

2. 6-Amino-9-(2-chlor-6-niiorbcnzyl)purin 5 0.006 5 0.006

') Mindestkonzentration mil gröliter Aktivität ohne Toxi/itäl.

Der Wirkungsparameter für die biologische Aktivität )ϊ medikamentös behandelte Küken und (b) infizierte, aber

wurde nach einer von I bis 5 reichenden Skala ermittelt. mit einem bekannten Coccidiostatikum behandelte

Die Testbedingungen entsprechen dem Versuchsbei- Küken Die Aktivität wurde wie folgt bewertet:
spiel I a) (E. tenella) bzw. b) (E. acervulina). Mindestens

zwei der folgenden Kriterien wurden für eine 5 = ^r.ehr aktiv, kein Unterschied zu der obigen

Bewertung herangezogen: (1) Sterblichkeit, °/o. (2) 4ο a-Gruppe.

Blutsenkung, (3) post-lnokulations-Gewichtszunahme 3 = aktiv,

oder (4) Kotbewertung (vgl. Beispiel I b). Diese Werte I = Anzeichen von Aktivität,

wurden dann mit den Werten von zwei Arten von 0 = inaktiv.

Kontrollküken verglichen: (a) Nicht infizierte und nicht

Claims

Patentansprüche:

I. 6-Amino-9-benzylpurinderivate der allgemeinen Formel

NH₂

sie die Zahl und/oder die Spoliation jener gebildeten Oozysten verringern.

Die Erfindung schlägt daher eine Verbindung der Strukturformel