DE2261551A1

DE2261551A1 - Verfahren zur herstellung von hydroxocobalamin

Info

Publication number: DE2261551A1
Application number: DE19722261551
Authority: DE
Inventors: Leonard Mervyn
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1971-12-17
Filing date: 1972-12-15
Publication date: 1973-06-20
Also published as: JPS4875600A; NL7217072A; GB1409529A; BE792804A; US3879378A; FR2163664A1; FR2163664B1

Description

GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex/Großbritannien Verfahren zur Herstellung von Hydroxocobalamin

Die Erfindung betrifft verbesserte Verfahren für die Herstellung von Hydroxocobalamin (Vitamin B-ipb^ ^{unci ancieren} Hydroxocobalticorrinoiden.

Bei der Herstellung von Cobalaminen durch Fermentation ist die Verbindung, die man üblicherweise isoliert, Cyanocobalamin. Es erscheint seit kurzem jedoch so, daß Hydroxocobalamin gegenüber Cyanocobalamin für die medizinische Anwendung, bedingt durch die überlegene Retention im Körper, was durch höhere Plasmawerte angezeigt wird, bevorzugt ist. Weiterhin ist bei der Cyanidentgiftung die Hydroxoverbindung weit überlegen. In ähnlicher Weise sind die Hydroxoanalogen von anderen Cyanocobalticorrinoiden bei bestimmten medizinischen Anwendungen von Interesse. Bei der direkten Herstellung von Hydroxocobalamin durch Fermentation treten jedoch Schwierigkeiten auf, insbesondere bei der Isolierung der Verbindung aus- dem Fermentationsmedium, so daß es bevorzugt ist, zuerst Cyanocobalamin herzustellen und dieses danach in Hydroxocobalamin zu überführen. Andere Hydroxocobalticorrxnoiden können auf ähnliche Weise über ihre Zwischenprodukte, die Cyanoanalogen, hergestellt werden.

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Kürzlich wurde vorgeschlagen, Cyanocobalamin in Hydroxocobalamin durch Reduktion, entweder durch Hydrierung oder durch chemische Reduktion, und anschließende Reoxydation zu überführen. Diese Verfahren ergeben jedoch entweder relativ schlechte Ausbeuten oder unreine Produkte, da die Oxydation von unerwünschtem Abbau begleitet wird. Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, die gewünschte Umwandlung zu bewirken, indem man Cyanocobalamin sichtbarem Licht unter mäßig sauren Bedingungen aussetzt und gleichzeitig belüftet. Diese Umwandlung ist jedoch langsam und für die Anwendung in technischem Maßstab nicht geeignet. Außerdem tritt unerwünschter Abbau auf. Ein weiteres Verfahren, das in der britischen Patentschrift 974 284 beschrieben ist, ergibt sehr hohe Ausbeuten an Hydroxocobalamin. Bei diesem Verfahren werden jedoch mehrere Verfahrensstufen verwendet, und es verläuft relativ langsam.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Umwandlung von Cyanocobalticorrinoiden in Hydroxocobalticorrinoide und insbesondere von Cyanocobalamin in Hydroxocobalamin, das zweckdienlich in technischem Maßstab durchgeführt werden kann und das das Riskiko des Zerfalls vermindert.

Bei der Umwandlung von Cyanocobalticorrinoiden in die Hydroxoanalogen besteht ein Problem in der Entfernung der freigesetzten Cyanidionen, um eine teilweise Wiederbildung von Cyanocobalticorrinoid zu vermeiden. Bei saurem p_H-Wert kann der Cyanwasserstoff durch Sprühenmit einem Gas entfernt werden, und diese Methode wird bei dem Verfahren entsprechend der britischen Patentschrift 974 284 verwendet. Die Cyanogruppe wird •benfalls leicht aus dem Cyanocobalticorrinoid durch Reduktion ues Kobalts zu dem Kobalt-(I)-oder Kobalt-(II)-Zustand und Maskieren der Cyanidionen als inertem Komplex entfernt. Ein Verfahren dieser Art ist in der belgischen Patentschrift 759 beschrieben.

Aus Zweckdienlichkeit wurde Vitamin B₁-, wie auch bestimmte analoge Verbindungen, in denen das Molekül modifiziert worden war, manchmal mit dem Gattungsnamen "Cobamide" bezeichnet.

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Jedoch wird die Bezeichnung "Cobamid" besser nur im Zusammenhang mit dem besonderen Kern, der im Vitamin B^₂ (Cyanocobalamin) auftritt, verwendet, und es ist bevorzugt, eine Terminologie, die auf Corrin bezogen ist, zu verwenden. Verbindungen, die diesen Kern enthalten, sind als Corrinoide bekannt, und der Ausdruck "Cobalticorrinoide" wird für Corrinoide verwendet, die ein Kobalt-(III)-atom enthalten ["Biochim.Biophys. Acta", 117 (1966) 285-288].

Der Ausdruck "Kobalt-(I)-corrinoid wird hierin für die entsprechenden Verbindungen verwendet, die hergestellt werden, wenn Cobalticorrinoide zu dem einwertigen Co-(D-Oxydationszustand reduziert werden.

In der belgischen Patentschrift 759 614 wird ein Verfahren zur Entfernung von freien Cyanidionen beschrieben, die in alkalischer Lösung eines Kobalt-(I)-corrinoids auftreten und die durch Reduktion des entsprechenden Cyanocobalticorrinoids gebildet werden, wobei ein Cyanid-Komplexierungsmittel in der alkalischen Lösung verwendet wird, so daß die Cyanidionen in einen Komplex eingearbeitet werden und nicht langer bei anschließenden Reaktionen des Kobalt-(I)-corrinöids mit anderen Reagentien stören.

Verwendet man dieses Verfahren, so ist es möglich, Vitamin B^₂-Coenzym und andere Cobalticorrinoid-Analogen davon herzustellen, indem man reduziertes Kobalt-(I)-corrinoid mit einem Alkylierungs-, Aralkylierungs-, Acylierungs- oder Sulfonylierungs-Mittel umsetzt. Es wurde nun gefunden, daß Hydrcxocobalamin durch Oxydation dieser Analogen hergestellt werden kann.

Ein Problem bei solcher Herstellung von Hydroxocobalticorrinoiden besteht darin, daß die Luftoxydation der obigen Analogen eine beachtliche Zersetzung des Corrinkerns bewirkt. Um eine solche Zersetzung des Corrinkerns durch Oxydation zu vermeiden, wurde verschiedene Derivate der Vitamin B.p-Coenzym—Art

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untersucht, indem man Kobalt-(I)-corrinoId mit einem Alkylierungs- oder Aralkylierungs-Mittel umsetzte und dann das Co-(III)-alkyl- oder -aralkylderivat oxydierte. Es wurde gefunden, daß viele Co-(III)-hydrocarbyl-Verbindungen, beispielsweise Methylcobalamin, bei der Oxydation ein Hydroxocobalticorrinoid ergeben, daß es aber bei der Umsetzung erforderlich ist, zu bestrahlen, um eine gute Ausbeute in annehmbarer Zeit zu erzielen. Diese Umsetzung ergibt jedoch keine technisch zufriedenstellenden Ergebnisse, da zuviel Abbau stattfindet. Solche Derivate sind in der Tat zu stabil, um leicht zu den Hydroxoanalogen in Abwesenheit von Licht oder anderer Bestrahlung oxydiert zu werden. Andererseits können stark verzweigte Alkylgruppen, wie tert.-Butylgruppen, nicht eingeführt werden, bedingt durch die sterische Hinderung des Kobaltatoms durch den Corrinkern. Es ist jedoch möglich,- eine sehr wirksame Oxydation zu Hydroxocobalticorrinoid durchzuführen, indem man ein instabiles Corrinoidderivat wählt, das gegenüber der Oxydation mit molekularem Sauerstoff in Abwesenheit von Bestrahlung empfindlich ist. Damit ein solches Derivat existiert, ist es erforderlich, daß die Gruppe, die an das Co anstelle des CN gebunden ist, eine besondere Molekül-"Form" besitzt, d.h., sie muß an der Stelle, an der sie an das Kobaltatom gebunden ist, klein sein, aber von dem Kobaltatom entfernt muß sie größer sein, damit die Instabilität vergrößert wird. Versuche haben gezeigt, daß bestimmte substituierte Alkylgruppen die korrekte sterische Konfiguration besitzen, um Derivate zu ergeben, die stabil genug sind, damit sie in Lösung gehandhabt werden können, aber ausreichend instabil, damit sie leicht zu den Hydroxoanalogen oxydiert werden können und daß keine ernste Zersetzung des Moleküls stattfindet, bevor die Oxydtion vollständig ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von einem Hydroxycobalticorrinoid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man unter nicht-oxydierenden und lichtfreien Bedingungen ein Kobalt-(I)-corrinoid mit einem Alkylierungsmittel umsetzt, um an das Kobaltatom des Corrinoids eine geradkettige

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aliphatische Kette mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, die eine endständige cyclische Gruppe trägt, einzuführen, und man an-

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schließend das so gebildete Zwischenprodukt zu dem entspre- , chenden Hydroxocobalticorrinoid oxydiert.

Die endständige cyclische Gruppe in der Gruppe, die durch das Alkylierungsmittel eingeführt wird, ist wünschenswerterweise eine mono- oder polycyclische Aryl- oder Cycloalkyl-Gruppe, die gegebenenfalls substituiert sein kann, vorzugsweise an Stellen, die zur aliphatischen Kette nicht benachbart sind, beispielsweise an m- und p-Stellungen einer Phenylgruppe. Die endständige cyclische Gruppe kann so beispielsweise sein .eine Phenyl-, Naphthyl- oder Cyclohexyl-Gruppe. Solche cyclischen Gruppen können, wie oben angegeben, unsubstituiert sein oder sie können Substituenten enthalten, beispielsweise eine oder mehrere Alkyl-, Acylamido-, Acyloxy-, Äther-, Carboxyl-, veresterte Carboxyl- oder Nitro-Gruppen oder Halogenatome· Im allgemeinen sind o-Substituenten nicht wünschenswert, insbesondere dann, wenn die aliphatische Kette kurz ist, beispielsweise Methylen, da die sterische Beziehung zu dem Corrinkern nachteilig beeinflußt wird. '

Die aliphatische Kette selbst wird vorzugsweise so kurz wie möglich gehalten. Sie kann unsubstituiert sein oder sie kann gegebenenfalls eine Ketogruppe enthalten. Die aliphatische Kette kann beispielsweise eine Methylen-, Äthylen-, 2-Ketoäthylen- oder Carbonyl-Gruppe sein.

Besonders nützliche endständig.substituierte aliphatische Gruppen, die bei dem Verfahren verwendet werden können, sind Benzyl-, Phenäthyl-, Benzoylmethyl-, 4-Nitro'benzyl-, 4-Nitrobenzoyl- und Naphth-2-oylmethyl-Gruppen, und daher sollte das Alkylierungsmittel wünschenswerterweise ein solches sein, das eine dieser Gruppen einführt.

Somit kann ein Kobalt-(I)-corrinoid, wie ein vollständig reduziertes Cobalamin, mit einem Reagens umgesetzt werden, das

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eine solche substituierte Alkylgruppe einführt, und das gebildete Zwischenprodukt kann oxydiert werden, wobei ein Hydroxocobalticorrinoid in ausgezeichneter Ausbeute und Reinheit erhalten wird. Insbesondere kann ein Cyanocobalticorrinoid, wie Cyanocobalamin, in Anwesenheit eines Cyanid-Komplexierungsmittels vollständig reduziert werden, wobei freies Cyanid, das entsteht, reagiert und einen inerten Komplex bildet, und das reduzierte Kobalt-(I)-corrinoid wird mit dem Alkylierungsmittel umgesetzt, wobei ein substituiertes Alkyl-

cobalticorrinoid entsteht, das dann oxydiert wird, beispielsweise mit einer Quelle von gasförmigem Sauerstoff, wie Luft, wobei das gewünschte Hydroxocobalticorrinoid, beispielsweise Hydroxocobalamin, gebildet wird.

Es soll bemerkt werden, daß die Umsetzung des Komplexierungsmittels mit den Cyanidionen unter alkalischen Bedingungen stattfinden sollte, um eine Zersetzung des Cyanidkomplexes zu vermeiden und ebenfalls die Stabilität des Kobalt-(I)-corrinoids zu erhöhen. Die Reduktion des Cyanocobalticorrinoids wird daher vorzugsweise unter alkalischen Bedingungen durchgeführt, es ist jedoch ebenfalls möglich, das Cyanocobalticorrinoid unter sauren Bedingungen zu reduzieren und dann die Lösung alkalisch zu machen, so daß das Komplexierungsmittel seine Wirkung entfalten kann.

Das Cyanid-Komplexierungsmittel enthält vorzugsweise ein Metall, das mit Cyanid einen Komplex bildet, wie Silber, Zink, Cadmium, Quecksilber, Chrom, Molybdän, Wolfram, Mangan, Nikkei, Kobalt, Eisen oder Kupfer, insbesondere Kupfer-(II) oder Eisen-(II), und es ist vorzugsweise ein Salz des Metalls, beispielsweise ein Sulfat, Nitrat oder Halogenid. Unter alkalischen Bedingungen wird das Komplexierungsmittel üblicherweise ein Hydroxyd des Metalls sein, das im Gleichgewicht mit den Ionen des Metalls steht. Selbstverständlich darf das Komplexierungsmittel durch das Reduktionsmittel seine Wirkung nicht verlieren oder dieses stören, wenn das Komplexierungsmittel in der Lösung verwendet wird, vor dem Reduktionsmittel oder gleichzeitig mit dem Reduktionsmittel. Weiterhin sollte das

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Salz vorzugsweise keine Anionen enthalten, die stabile Cobalticorrinoid-Derivate bilden, beispielsweise Nitrit- oder Sulfit-Ionen, da diese mit den Cyanidionen im Wettbewerb stehen.

Als Reduktionsmittel wählt man ein komplexes MetalIhydrid-Reduktionsmittel und insbesondere ein Borhydrid, beispielsweise ein Alkalimetallborhydrid, z.B. Natrium-, Kalium- oder Lithiumborhydrid. Alternativ können Metallionen mit niedriger Wertigkeit als Reduktionsmittel verwendet werden, beispielsweise Chrom-(II)-salze, wie Chrom-(IIJ-acetat, oder andere Reduktionsmittel, beispielsweise Zink und Essigsäure oder Wasserstoff, in Anwesenheit eines Katalysators, beispielsweise Platin.

Bevorzugte Komplexierungsmittel sind Kupfer-(II)-salze, wie Kupfer-(II)-chlorid, und Eisen-(II)-salze, beispielsweise Eisen-(II)-sulfat. Es ist bevorzugt, mindestens die stöchiometrische Menge an Komplexierungsmittel zu verwenden, und ein Überschuß kann oft vorteilhaft sein. Kupfer-(II)-ionen katalysieren die Reduktion von Cobalticorrinoiden durch Borhydride und andere Reduktionsmittel und sind daher besonders nützlich und können vorteilhafterweise im Überschuß der stöchiometrischen. Menge, die erforderlich ist, um das Cyanid komplex zu bilden, zugefügt werden. Die Reduktion wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel für die Reaktionsteilnehmer, vorteilhafterweise in einem polaren Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, einem Alkanol, wie Methanol oder Äthanol, oder einem substituierten Amid-Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, durchgeführt. Das Metallsalz, das als Komplexierungsmittel verwendet wird, ist daher vorzugsweise ein solches, das in den obigen Arten von Lösungsmitteln löslich ist.

Das Cyanidion, das freigesetzt wird, steht mit dem Alkylierung sr eag ens im Wettbewerb, und es ist daher notwendig, das Komplexierungsmittel zur gleichen Zeit oder bevor das Alky-

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lierungsmittel zugefügt wird, zuzugeben. Es ist im allgemeinen zweckdienlicher, das Komplexaerungsmittel vor oder gleichzeitig mit dem Reduktionsmittel zuzufügen, so daß die Cyanidionen aus der Lösung entfernt werden, ehe sie freigesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Natriumborhydrid zu einer wäßrigen Lösung eines Cyanocobalticorrinoids zugefügt, die Kupfer-(II)-chlorid oder Eisen-(II)-sulfat enthält, und das Alkylierungsmittel wird anschließend nach Beendigung der Reduktion zugegeben.

Als Alkylierungsmittel kann man beispielsweise jene verwenden, die in der britischen Patentschrift 963 373 beschrieben sind. Das Reagens kann beispielsweise durch die allgemeine Formel RX dargestellt werden, worin X ein Substituent ist, der ein Anion bildet, und R die endständig substituierte aliphatische Gruppe der zuvor erwähnten Art bedeutet, wie eine unsubstituierte Benzylgruppe, eine Phenäthylgruppe, eine Naphthylgruppe, eine Benzoylgruppe oder eine Naphthoylgruppe. Das Alkylierungsrea-

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gens kann ebenfalls beispielsweise ein Alken sein, das eine Doppelbindung in 1-Stellung enthält, beispieslweise Styrol, wodurch eine Phenäthylgruppe eingeführt wird.

Der Substituent X kann beispielsweise ein Halogenatom, z.B. ein Chlor-, Brom- oder Jod-Atom, sein oder eine Gruppe sein, . die sich von einer starken anorganischen oder organischen Säure ableitet, beispielsweise eine Sulfat- oder Phosphat-Gruppe, oder eine Alkyl-, Aralkyl- oder Arylsulfonat-Gruppe, z.B. eine Methylsulfonat- oder p-Tolylsulfonat-Gruppe, oder eine Oxalatgruppe.

Die endständig substituierte aliphatische Kette kann ebenfalls eine Alkenylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen sein. Diese Alkenylsubstituenten können eingeführt werden, indem man Reagentien verwendet, die analog sind zu denen, die man verwendet, um Alkylsubstituenten einzuführen. Somit kann eine Alkenylgruppe mit einer endständigen Doppelbindung (beispielsweise

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eine Styrylgruppe) eingeführt werden,. indem man das entsprechende Alkinylreagens (beispielsweise Phenylacetylen) verwendet. Eine Alkenylgruppe kann ebenfalls unter Verwendung des entsprechenden Alkenylhalogenids oder unter Verwendung der entsprechenden Enin- (enyne) oder Dien-Verbindung eingeführt werden. Die 4-Phenylbut-3-enyl-Gruppe kann unter Verwendung von l-Chlor-4-phenylbut-3-en und die 4-Phenylbuta-l,3-dienyl-Gruppe kann unter Verwendung von 4-Phenylbut-3—en-l-in einge-

i führt werden. ;·

Um sicherzustellen, daß das Ausgangsmaterial nicht reoxydiert wird, bevor es gewünscht wird, sollte die Reaktion unter nicht-oxydierenden Bedingungen und in Abwesenheit von Licht durchgeführt werden. Die Gesamtumsetzung verläuft am besten bei relativ hoher Konzentration, vorzugsweise verwendet man fast gesättigte Lösungen des als Ausgangsmaterial verwendeten Cyanocobalamins, beispielsweise etwa'3,3 g/lOO ml Wasser. Die mögliche Konzentration an Reduktionsmittel hängt von der Art des Reagens ab, aber beispielsweise wird Natriumborhydrid vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 0,05 g bis 1,00 g/lOO ml, am bevorzugtesten bei relativ hohen Konzentrationen, verwendet. Wird ein Komplexierungsmittel verwendet, so kann dieses in vergleichsweise geringen Mengen vorhanden sein, und beispielsweise sind sind 0,35 g/lOO ml Eisen-(II)- oder Kupfer-(II)-salz vorteilhaft.

Während des Verfahrens ist es erforderlich, die Corrinoide von den vorhandenen Salzen zu trennen, und obgleich dies bei jeder Stufe nach der Reduktion durchgeführt werden kann, erfolgt die Trennung wünschenswerterweise unmittelbar nach der Alkylierungsstufe. Irgendein zweckdienliches Entsalzungsverfahren kann verwendet werden, wie die Extraktion mit Phenol oder die Adsorption an ein Harz. Das Harzadsorptionsverfahren ist bevorzugt, und es ist besonders zweckdienlich, ein vernetztes Polystyrolharz, wie ein XAD-2-Harz, das von Röhm & Haas Co. of Philadelphia, USA, verkauft wird, zu verwenden.

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Alternativ kann ein Harz, das Carboxylgruppen enthält, beispielsweise die IR- oder IRC-Harze, die ebenfalls von Röhm & Haas verkauft werden, verwendet werden, aber neutrale Harze sind bevorzugt. Die Salze können mit Wasser ausgewaschen werden, und dann kann man die Corrinoide eluieren, beispielsweise mit einemnit Wasser vermischten wassermischbaren Lösungsmittel, z.B. einem Keton, wie Methyläth-ylketon, oder bevorzugter Aceton, oder einem Alkohol, wie Methanol oder Äthanol. 6O:4O-wäßriges Aceton ist bevorzugt. _;

Die Verwendung des XAD-2-Harzes zur Entsalzung der Reaktionsmischung kann zu Komplikationen führen, wenn ein Cyanidkomplex corhanden ist. Solche inhärente Acidität in dem Harz setzt Cyanid frei, das zur Re-Umwandlung von Hydroxocobalticorrinoid zu Cyanocobalticorrinoid führt. Dies kann vermieden werden, indem man das Harz zuerst mit einem Alkali wäscht.

Wenn eine phenolische Entsalzung erfolgt und man ein Phenol, beispielsweise Hydroxybenzol selbst verwendet, wird es bevorzugt mit einem nicht-polaren, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Kohlenstoff tetrachlorid oder Äther, vermischt, um die Löslichkeit des Cobalamins in dem Phenol zu vermindern, wenn das Phenol gewaschen wird, um das Cobalamin zu extrahieren. Das Wasser enthält für diese Extraktion vorzugsweise ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel für Cobalamine wie bei der Elution aus dem Harz, wie oben erwähnt.

Die Lösung der Cobalticorrinoide, die man nach dem Entsalzen erhält, wird dann der Oxydation, vorzugsweise durch Belüftung, unterworfen, bis die Umwandlung in Hydroxocobalticorrinoid vollständig ist. Diese Stufe muß nicht in der Dunkelheit durchgeführt werden, da eine Zersetzung nicht länger vermieden werden muß.

Die Abtrennung des Corrinoid-Produktes kann durch Ionenaustauschmedien erfolgen. So hält anionische (0H~)-DEAE-Cellulose Nebenprodukte zurück, solche, die als rote Säuren be-

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zeichnet werden und die mit verdünntem Alkali eluiert werden können. Die anschließende Behandlung mit kationischer (H )CM-Cellulose hält Hydroxocobalticorrinoide zurück, ermöglicht aber, daß unveränderte Cyanocobalticorrinoide mit Wasser eluiert werden können. Die Form des gewünschten Hydroxo-Produktes hängt natürlich vom p_H"-Wert des Systems ab. Bei einem p„-Wert über etwa 10 wird das Produkt als Hydroxocobalticorrinoid vorliegen. Bei einem p„-Wert unterhalb etwa 4 erhält man die basische aquocobalticorrinoide Form, während bei einem p_H-Wert zwischen 4 und 10 eine Mischung im Gleichgewicht vorliegt.

Die gewünschten Hydroxocobalticorrinoide können so mit verdünnter Säure, beispielsweise n/50-Chlorwasserstoffsäure oder n/25-Essigsäure, in Form der Aquocorrinoide eluiert werden und schließlich durch Kristallisation, gewünschtenfalls nach Verdampfen oder Zugabe eines Ausfällungsmittels, wie Aceton, isoliert werden.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es abläuft unter Verwendung der Zwischenprodukte, die in der BE-PS 759 614 (entspr. der britischen Anmeldung 58631/69 der gleichen Anmelderin) für die Herstellung von Vitanin ^B^₂~ Coenzym und verwandten Co-(III)-Derivaten beschrieben sind. Man kann so ein Cyanocobalticorrinoid, beispielsweise Cyanocobalamin, reduzieren und das Cyanid entfernen, und das Kobalt- (I)-corrinoid, das man erhält, bildet dann ein üblisches Zwischenprodukt sowohl für die Herstellung von Cobalticorrinoiden, beispielsweise Vitamin B^p-Coenzym und anderen analogen perivaten, und ebenfalls für Hydroxocobatlicorrinoiden, beispielsweise Hydroxocobalamin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

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Beispiel 1

Cyanocobalamin (9,4 g) wurde unter magnetischem Rühren in Wasser (300 ml) in einem 1 1-Dreihalsrundkolben gelöst· Kupfer-(D-chlorid (1,5 g) wurde mit dem Kobalamin gelöst. Ein Hals des Kolbens war über eine Falle mit einer Wasserpumpe verbunden. An den anderen waren ein Tropftrichter und ein Glasgaseinleitungsrohr, das mit einer Stickstoffbombe über eine Falle verbunden war, angebracht. Sauerstoff wurde aus der Lösung entfernt, indem man alternierend Vakuum mit der Wasserstrahlpumpe anlegte und dann die Lösung mit Stickstoff sättigte. Nach fünf solchen Zyklen wurde die Stickstoffquelle abgeschaltet und der Kolben bei negativem Druck gehalten. In der Zwischenzeit wurde Natriumborhydrid (2 g) in Wasser (20 ml) gelöst, und die Lösung wurde in den Tropftrichter gegeben. Stickstoff wurde durch die Lösung 5 Minuten zur Entfernung des Sauerstoffs geleitet. Die Lösung wurde langsam im Verlauf von 5 Minuten in den Reaktionskolben eingesaugt, bis 0,5 ml zurückblieben. Dann wurde die Falle geschlossen. Nach dieser Zugabe wurde Stickstoff wieder über die Sprühvorrichtung eingeleitet, und die Falle zur Wasserstrahlpumpe wurde geöffnet. Die Reduktion konnte innerhalb von 15 Minuten ablaufen. Danach hatte die Lösung eine grüne Färbung.

Bevor die nächste Zugabe erfolgte, wurde vom Reaktionskolben das Licht ausgeschlossen. Benzylchlorid (5 ml) in Methanol (10 ml) wurde in den Tropftrichter gegeben und im Verlauf von 5 Minuten zu dem reduzierten Cobalamin zugefügt. Die Reaktion konnte weitere 10 Minuten ablaufen, dann leitete man Luft in den Kolben ein. Die entstehende Lösung von Benzylcobalamin wurde im Dunkeln aufbewahrt und folgendermaßen verarbeitet.

Die Mischung wurde durch einen Büchner-Trichter filtriert, und der erhaltene Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und auf eine XAD-2-Sä'ule (500 ml Harz) gegeben, die zuvor mit Methanol/ Chlorwasserstoffsäure, Wasser und n/lO Natriumhydroxyd gewaschen worden war. Die Säule und das Beschickungsmaterial wur-

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den im Dunkeln, aufbewahrt, jedoch wurden bei den Eluaten keine solchen Vorsichtsmaßnahmen getroffen. Nachdem das Benzylcobalamin auf .der Säule adsorbiert war, wurde das Harz mit Wasser gewaschen, bis alle Salze eluiert waren. Wäßriges Aceton (60:40) wurde dann verwendet, um die Cobalamine vollständig zu eluieren. Dieses Eluat wurde in einen großen Büchner-Kolben gegeben, und Luft wurde während 8 Stunden hindurchgeleitet. Während dieser Zeit änderte sich die Färbung der Lösung von Kirschrot zu einem braunen Rot, charakteristisch für Hydrpxocobalamin. Nachdem die Lösung beim Ansäuern nicht langer gelb wurde, nahm man an, daß die Umwandlung von Benzylcobalamin zu Hydroxocobalamin vollständig war. Die Lösung wurde dann auf einem Rotationsverdampfer auf eine Konzentration von etwa 5 % eingedampft.

Die salzfreie Cobalamin-Lösung wurde durch eine DEAE-Cellulose-(OH~)-Säule (200 ml) geleitet, nachdem man sie auf einen P_H-Wert von 3,0 angesäuert hatte. Das aus dieser Säule abfließende Material wurde dann durch CM-CeIIuIoSe-(H⁺)-Säule (200 ml) geleitet, wo das Hydroxocobalamin zurückbehalten wurde, wo man jedoch unverändertes Cyanocobalamin mit Wasser eluieren konnte. Hydroxocobalamin wurde von der kationischen Cellulose mit n/50-Chlorwasserstoffsäure eluiert, wobei man eine Lösung von Aquocobalaminchlorid erhielt. Zu dieser Lösung fügte man Aceton zu, bis eine schwache Opaleszenz blieb, und dann konnte das Aquocobalaminchlorid kristallisieren. 8,3 g entsprechend einer Ausbeute von 88,2 % mit einer Reinheit von > 97 % wurden erhalten. 0,40 g Cyanocobalamin wurden wiedergewonnen.

Beispiel 2

Cyanocobalamin (10 g) wurde in Wasser (400 ml) zusammen mit Kupfer-(I)-sulfat (2,0 g) gelöst. Die Reduktion wurde dann genau wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, und Benzylcobalamin wurde auf gleiche Weise hergestellt. Die Reaktionsmischung, die Benzylcobalamin enthielt, wurde durch einen Büchner-Trichter filtriert, und die Waschlösungen wurden mit dem Filtrat

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-livereinigt, wobei man ein Volumen von 500 ml erhielt· Die Lösung wurde, noch in Abwesenheit von Licht, in einen Scheidetrichter überführt und dreimal mit einer 3:1-Mischung aus Phenol und Chloroform (100 ml) extrahiert. Die vereinigten Phenoj/Chloroform-Extrakte (300 ml) wurden mit Wasser (100 ml) gewaschen, bis der p„-Wert der Waschlösungen neutral war. Aceton (300 ml), Wasser (150 ml) und Diäthyläther (600 ml) wurden zu dem Extrakt gegeben, und dann schüttelte man, wobei die Cobalamine in das Wasser extrahiert wurden. Zwei weitere Extraktionen mit Wasser (jeweils 100 ml) wurden durchgeführt, und die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden zweimal mit der Hälfte ihres Volumens an Diäthyläther gewaschen.

Die salzfreie wäßrige Lösung von Benzylcobalamin wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, belüftet. Die Behandlung des entstehenden Hydroxocobalamxns wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, und es wurde an CM-Cellulose, wie beschrieben, adsorbiert.

Die Elution aus der CM-Cellulose wurde mit n/25 Essigsäure durchgeführt, wobei man Aquocobalaminacetat erhielt, das durch Zugabe von Aceton kristallisierte. Gewichts des kristallinen Aquocobalaminacetats = 9,2 g. Restliches Cyanocobalamin = 0,38 g.

In den Beispielen 3 bis 7 wurden andere Zwischenprodukte als Benzylcobalamin hergestellt. Die Reduktion, die Umsetzung, die Entsalzung, die Belüftung und die Isolierung des Hydroxocobalamins erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das Benzylchlorid durch andere Reagentien ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, worin CNB^₂ Cyanocobalamin und OHB..- Hydroxocobalamin bedeuten. Die Menge an Reagens, die verwendet wurde, ist in der Tabelle angegeben.

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Bei spiel	Reagentien	Reakti onszeit (Min.)	Belüftung zeit (Stunden)	Wiederge wonnenes CNB₁,	Gewicht des 0HB>,_o (g) ¹²	Aus beute (%)	Rein heit (%)
3	4-Nitrob'enzylbromid ^a	20	16	0,08	8,22	82,2	' 97
4	a) " 4-Nitrobenzoylchlorid	20	16.	0,50	6,96	69,6	97
5	Styrol ^b)	240	8	0,45	5,67	56,7	94
6	2-Bromacetophenon ^a	30	16	0,20	8,30	83,0	98
7	2-Brom-2'-acetonaphthon ^a	60 ·	16	0,22	7,55	75,5	98

In jedem Fall wurden 10 g Cyanocobalamin verwendet.

a) = 5 g Reagens wurden in 10 ml Methanol verwendet.

b) = 5 ml Reagens wurden in 10 ml Methanol verwendet.

.cn cn

Claims

Paten tan Sprüche

/lJ) Verfahren zur Herstellung eines Hydroxycobälticorrihoids, dadurch gekennzeichnet, daß man unter nicht-oxyciierehden und .lichtfreien Bedingungen ein Kobalt-(I)-corrinoid mit einem Alkylierungsmittel umsetzt, um an dem Kobaltafcom des Corrinoids eine geradkettige äiiphatiische kette mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen und einer endständigen cyclischen Gruppe einzuführen, und anschließend das so gebildete Zwischenprodukt zu dem entsprechenden Hydroxocobalticorrinoid oxydiert.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die endständige cyclische Gruppe eine mono- oder polycyclische Aryl- oder Cycloalkyl-Gruppe ist, die gegebenenfalls an nicht benachbarten Stellen zu der aliphatischen Kette Substituenten tragen kann.
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die endständige cyclische Gruppe eine Phenyl-, Naphthyl- oder Cyclohexyl-Gruppe ist.
4.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichet, daß die endständige cyclische-Gruppe eine oder mehrere Alkyl-, Acyl-, Amido-, Acyloxy-, Äther-, Carboxyl-, veresterte Carboxyl- oder Nitro-Gruppon oder Halogenatome enthält.
5.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatische Kette eine Ketogruppe enthält.
6.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatische Kette eine Methylen-, Äthylen-, 2-Ketoäthylen- oder Carbonyl-Gruppe ist.
7.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aliphatische Kette, die eine endständige cyclische Gruppe enthält, eine Benzyl-, Phenäthyl-, Benzoylmethyl-, 4-Nitro-

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benzyl-, 4-Nitrobenzoyl- oder Naphth-2-oylmethyl-Gruppe ist.
8.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß.das 'Alkylierungsmittel die Formel RX besitzt, worin R eine geradkettige aliphatische Kette mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und eine endständige cyclische Gruppe trägt und X einen anionbildenden Substituenten bedeutet.
9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Gruppe bedeutet, die sich von einer starken anorganischen oder organischen Säure ableitet.
10.) Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Chlor-, Brom- oder Jod-Atom, eine Sulfat- oder Phosphat-Gruppe, eine Alkyl-, Aralkyl- oder Arylsulfonat-Gruppe oder eine Oxalatgruppe bedeutet.
11.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungsmittel ein geradkettiges Alk-l-en ist, das eine endständige cyclische Gruppe enthält.
12.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kobalt-(I)-corrinoid durch Reduktion eines Cyanocobalticorrinoids erhalten wird.
13.) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyanccobalticorrinoid Cyanocobalamin ist,
14.) Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in einem alkalischen Medium durchgeführt wird-, wobei ein Cyanid-Komplexierungsmittel zugefügt wird.
15.) Verfahren nach ,einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxydation unter Verwendung einer Quelle für gasförmigen Sauerstoff durchgeführt wird.

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16.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Corrinoidmaterial von den in dem Reaktionsmedium vorhandenen Salzen nach der Umsetzung mit dem Alkylierungsmittel abgetrennt wird.
17.) Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung durch Adsorption an einem Harz oder durch Phenolextraktion erfolgt.
18.) Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß Natriumborhydrid zu einer Lösung des Cyanocobalticorrinoids, die Kupfer-(II)-chlorid oder Eisen-(II)-sulfat enthält, zugefügt wird und daß dann anschließend das Alkylierungsmittel nach Beendigung der Reduktion zugefügt wird.
19.) Ein Hydroxocobalticorrinoid, hergestellt gemMß einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 18.

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