DE2243385B2

DE2243385B2 - Fluoreszenzauflicht-Mikroskop

Info

Publication number: DE2243385B2
Application number: DE2243385A
Authority: DE
Inventors: Toshifumi Hachioji Tokio Uetake (Japan)
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1972-07-23
Filing date: 1972-09-04
Publication date: 1975-07-24
Also published as: JPS4933643A; DE7232618U; DE2243385A1; JPS523585B2; US3973827A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenzauflicht-Mikroskop, bestehend aus einem Erregungsfilter, einem diesem nachgeordneten ersten Umlenkspiegel und einem zwischen dem Umlenkspiegel und einem Objektiv angeordneten dichroitischen Spiegel.

Bei dem aus der DT-AS 20 21 654 bekannten Fiuoreszenzauflicht-llluminator dient ein ebener diehromatischer Telierspiegel zur Reflexion der Erregerlichtstrahlung und zum Durchlaß der Emissionsstrahlung. Da bei vielen Fluoreszenzfarbstoffen die Wellenlängenmaxima der Erregerlichtstrahlung und der Emis sionsstrahlung dicht beieinanderliegen, während die Teilung im dichroitischen Spiegel von maximaler bis zu minimaler Durchlässigkeit sich über einen bestimmten Wellenlängenbereich erstreckt, ist bei den bekannten Anordnungen im Beobachtungsstrahl noch cn den Bildkontrast vermindernder Anteil an Erregerlicht strahlung enthalten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Auflicht-Fluoreszenzmikroskop anzugeben bei dem mittels des dichroitischen Spiegels eine besonders scharfe Trennung der Strahlungen und damit ein kontrastreiches Bild erzielbar ist.

Diese Aufgabe wird bei einem Fluoreszenzauflicht-Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß es die im Kennzeichen des Anspruchs 1 aufgeführten Merkmale aufweist.

Weiter vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Durch die erfindungsgemäße Ausbildung des dichroitischen Spiegels als Konkavspiegel und den nahe der optischen Achse des Mikroskops vorgesehenen Umlenkspiegel ist es nicht nur möglich, die reflektierende Fläche des Umlenkspiegels in die Austrittspupille des Objektivs abzubilden, sondern auch diesen klein auszubilden und in unmittelbarer Nähe der optischen Achse anzuordnen, wodurch sich Auftreffwinkel in der Größenordnung von 6° auf den dichroitischen Spiegel er geben, die, wie die Kurve b in F i g. 1 zeigt, eine sehr viel stärkere Trennung der Strahlungen durch den dichroitischen Spiegel ermöglichen, als es beim Auftreffer unter einem Winkel von 45° der Fall ist, bei dem sich der durch die Kurve a gegebene sehr viel flachere Verlauf ergibt.

Die Erfindung wird nun an Hand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen ist

F i g. I ein Diagramm, das die spektralen Durchlaß faktoren dichroitischer Spiegel, wie sie in Auflichtfluo reszenzmikroskopen verwendet werden, zeigt,

F i g. 2 und 3 schematische Darstellungen der opti sehen Systeme einiger Ausführungsbeispiele des Erfin

dungsgegenstandes,

F i g- 4A, 4B, 4C DarstelJungen verschiedener konkaver dichroitischer Spiegel, die bei den erfindungsgemäleii Fluoreszenzauflicht-Mikroskopen Verwendung finden können. _s

In dem in F i g. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel durchläuft die von einer Lichtquelle kommende Lichtstrahlung 1 einen Eiregungsfilter 2, wird von einem eriten Umlenkspiegel 9 reflektiert und von der Hilfslinie 10 in die Nähe des kleinen zweiten Umlenkspiegels 8 reflektiert Die von dem zweiten Umlenkspiegel 8 reflektierte Strahlung wird weiter von dem konkaven dichroitischen Spiegel 3a aufgenommen und reflektiert und als vergrößertes Bild zum Punkt 4 der Austrittspupille des Objektivs oder zum rückwärtigen Brennpunkt der Objektivlinse fokussiert, wodurch eine perfekte Köhlerbeleuchtung mit der Objektivlinse erreicht wird. Zu diesem Zweck ist der konkave dichroitische Spiegel 3a mit einer leichten Neigung relativ zur optischen Achse des Mikroskops angeordnet. Die aus dieser An-Ordnung resultierende Knickung der optischen Achse kann durch Anordnung des Sperrfilters 7 mit einer Neigung relativ zur optischen Achse korrigiert werden. Es sei darauf hingewiesen, daß bei diesem Ausführungsbeispiel der zweite Umlenkspiegel 8 an der Lichtquellenseite des konkaven dichroitischen Spiegels 3a einen wirksamen Diirchmesser hat, der kleiner sein kann als der des dichroitischen Spiegels 3a. Daher kann der kleine zweite Umlenkspiegel 8 in der Nachbarschaft der optischen Achse des optischen Systems des Mikr >-skops angeordnet werden. Dadurch kann der Auftreffwinkel des Beleuchtungslichtstroms auf den konkaven dichroitischen Spiegel 3a außerordentlich klein gehalten werden. Bei einem tatsächlichen Ausführungsbeispiel war es möglich, den Beleuchtungslichtstrom auf den konkaven dichroitischen Spiegel 3a unter einem Auftreffwinkel von ungefähr 6° auftreffen zu lassen. Selbstverständlich kann auch der erste Umlenkspiegel 9 ein Konkavspiegel sein, wie in einem weiteren Ausführungsbeispiel später beschrieben wird. Es sei jedoch erwähnt, daß, wenn kein erster Umlenkspiegel 9 verwendet wird, die Lichtquelle schräg angeordnet sein mu'' Daher wird es aus verschiedenen Gründen, wie der .ebensdauer der Lichtquelle, be voran·¹ daß ein solcher erster Umlenkspiegel 9 verwendet *ird. Auch bei diesem Ausführungsbeispiel ist schon aus der Zeichnung ersichtlich, daß die Spiegelfläche des zweiten Umlenkspiegels 8 auf der planen Seite einer plankonkaven Linse ausgebildet ist und so angeordnet ist. daß deren konvexe Seite nach oben gerichtet ist. Selbstverständlieh kann eine genau gleiche Funktion, wie ^uei dieser Anordnung, bei der folgenden Anordnung erreicht werden, bei der eine Spiegelfläche an der konkaven Seite einer plankonvexen Linse angeordnet ist, wobei die konkave Fläche nach oben gerichtet ist. Dadurch, daß der konkave dichroitische Spiegel 3a eine leichte Krümmung hat, trägt ein Teil seiner Konvergenz dazu bei, daß Lichtstrahlen, die von dem kleinen zweiten Umlenkspiegel 8 ausgehen, den schädlichen Effekt auf das Bild verringern, der durch die Neigung dieses dichroitischen Spiegels 3a relativ zur optischen Achse des Mikroskops bedingt ist.

Die Kurve b in F i g. 1 zeigt die Speklraldurchlässigkeit, in dem Fall, in dem die Lichtstrahlen auf den dichroitischen Spiegel unter einem Auftreffwinkel von 6° auftreffen, während die Kurve a sich bei einem Auftreffwinkel von 45" ergibt. Wie man aus der Kurve b entnehmen kann, ist die spektrale Durchlässigkeit im wesentlichen die gleiche wie bei vertikalem Auftreffen. Insbesondere ergibt sich eine extrem kleine Durchlässigkeit bei der Wellenlänge 490 mu, während eine extrem groüe Durchlässigkeit bei 520 πιμ beobachtet wird. Daher werden bei Anwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Auflichtfluoreszenz-Mikroskop die Lichtstrahlen so geführt, daß sie auf den dichroitischen Spiegel mit einem Einfallswinkel von ungefähr 6° auftreffen, so daß ein helles, wolkenfreies und klares Bild beobachtet werden kann durch das Okular 13 mit der Austriitspupille 14. Das Okular 13 ist geneigt zur optischen Achse 17 des Auflichtfluoreszent-Mikroskops angeordnet und daher ist im Gehäuseteil 16 mit dem geneigten Tubus für das Okular ein Prisma 15 angeordnet. An den Tubusabschnitt 12 für Lichtprojektion des Mikroskopgehäuses schließt sich nach unten der Objektivteil mit dem auf einem Revolver 11 angeordneten Objektiv 5 an.

In F i g. 3 ist ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung dargestellt. Wie sich aus dieser Figur ergibt, sind sowohl die Lichtquelle als auch das Erregungsfilter 2 in bezug auf die optische Achse des Mikroskops gegenüber dem kleinen zweiten Umlenkspiegel 8 und dem ersten Umlenkspiegel 9a angeordnet, der in der Form eines konkaven Spiegels ausgebildet ist, um in gleicher Weise wie die bei dem ersten Ausführungsbeispiel von F i g. 2 verwendete Hilfslinse 10 zu wirken Selbstverständlich kann die vorliegende Erfindung sowohl in dem Fall verwirklicht werden, daß bei dem ersten Ausführungsbeispiel keine Hilfslinse 10 verwendet wird, als auch in dem Fall, daß im zweiten Ausführungsbeispiel der crsic Umlenkspiegel als Planspiegel ausgebildet ist. Die in den Zeichnungen dargestellte Ausführung wird jedoch bevorzugt, weil sie einen besseren Effekt liefert.

Weiterhin ist zu beachten, daß bei einem Fluoreszenzfarbstoff, wie F.l.T.C der blaues Licht als Erregungsstrahlung verwendet (andere Farbstoffe ähnlicher Natur, wie F.l.T.C, enthalten Quinacrin Mustard, Fluorszenznatrium usw.), wie die Kurbe ft in F i g. 2 zeigt, die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal ist, der als Mehrschichtinterferenzfilter ausgebildet ist, welches diejenigen Lichtstrahlen abschneidet, die an der kurzwelligen Seite liegen und der eine Spektralcharakteristik hat, bei der die Wellenlänge der durchgelassenen Lichtstrahlung mit dem Durchlaßfaktor 50% bei 505 Γημ liegt. Für ein mit Tetraäthylrhodaminmischung, Tetraäthylrhodaminisothiocynat usw., d. h. mit Fluoreszenzfarben, die grünes Licht als Erregungsstrahlung verwenden, gefärbtes Objekt ist die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal, der aus einem Mehrschichtinterferenzfilter besteht, welches diejenige Wellenstrahlung abschneidet, die an der kurzwelligen Seite liegt und der eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 605 ηιμ oder 590 ηιμ beträgt. Für ein Objekt, das mit Serotonin oder einem anderen fluoreszierenden Farbstoff, der violettes Licht als Erregungsstrahlung verwrndet, gefärbt ist, ist die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal, der aus einem Mehrschichtinterferenzfilter besteht, welches die auf der kurzwelligen Seite liegende Strahlung wegschneidet und eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 473 ηιμ beträgt. Schließlich ist für ein mit Catecholamin od. dgl. fluoreszierendem Farbstoff, der ultraviolettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet,

die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal, der aus einem Mehrsehichtinterferenzfilter besteht, welches die an der kurzwelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und eine Spektralcharakteristik besitzt, bei welcher die mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassene Strahlung bei 410 πιμ liegt.

In F i g. 2 und 3 sind konkave dichroitische Spiegel dargestellt, die eine Anordnung eines dichroitischen Spiegels darstellen, der an der Verbindungsfläche zwischen einer plankonkaven Linse und einer plankonvexen Linse angeordnet ist. In anderer Ausführung kann der dichroitische Spiegel von der konkaven Fläche einer plankonkaven Linse, deren konkave Fläche nach unten gerichtet ist, gebildet werden, wie der Spiegel 3b in Fig.4A zeigt. Ferner kann der konkave dichroitisehe Spiegel auf der konvexen Fläche einer plankonvexen Linse angeordnet werden, deren plane Fläche nach unten gerichtet ist, wie der Spiegel 3c in F i g. 4B Schließlich kann der konkave dichroitische Spiegel aul der konkaven Seite einer konkav-konvexen Linse an-

ίο geordnet werden, deren konkave Seite nach unten gerichtet ist, wie der Spiegel 3t/in F i g. 4C zeigt.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: *~

1. FIuoreszenzauflicht-Mikroskcp, bestehend aus einem Erregungsfilter, einem diesem nachgeordneten ersten Umlenkspiegel und einem zwischen dem Umlenkspiegel und einem Objektiv angeordneten dichroitischen Spiegel, dadurch gekennzeichnet, daß der dichroitische Spiegel 3a, 3b. 3c. 3d) ein Konkavspiegel ist und daß zwischen dem ersten Umlenkspiegel (9,9a) und dem dichroitischen Spiegel (3,3b. 3c, 3d) ein zweiter Umlenkspiegel (8) nahe der optischen Achse des Mikroskops vorgesehen ist

2. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß der dichroitische Spiegel aus einer plankonkaven und einer plarkonvexen Linse besteht.

3. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach Anspruch

I. dadurch gekennzeichnet, daß der dichroitische Spiegel (3b) eine plankonkave Linse ist.

4. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß der dichroitische Spiegel (3c) von einer plankonvexen Linse gebildet ist.

5. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Umlenkspiegel (8) als Spiegelfläche auf der planen Seite einer plankonvexen Linse, deren konvexe Fläche nach oben gerichtet ist, ausgebildet ist.

6. Fluoreszenzauflichi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Umlenkspiegel (8) als Spiegelfläche .uif der konkaven Seite einer plankonkaven Linse ausgebildet ist, deren konkave Fläche nach oben gerichtet ist.

7. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Umlenkspiegel (9a) als, Konkavspiegel ausgebildet ist.

8. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Erregungsfilter (2) und dem zweiten Umlenkspiegel (8) eine Hilfslinse (10) vorgesehen ist.

9. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Fluoreszenz anzuregende Objekt (6) mit einem grünes Licht als Erregerstrahlung enthaltenden Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist, daß der dichroitische Spiegel (3a, 36, 3c, 3d) als Mehrschicht-Interferenzfilter ausgebildet ist, wobei der dichroitische Spiegel kurzwelliges Licht wegschneidet und daß die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 605 mn ± 5 πιμ oder 590 ιημ ± 5 ιημ beträgt.

10. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Fluoreszenz anzuregende Objekt (6) mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist, der blaues Licht als Erregungsstrahlung verwendet und daß die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 505 πιμ ± 5 ιτιμ beträgt.

11. Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Fluoreszenz anzuregende Objekt (6) mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist, welcher violettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet und daß die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 473 πιμ ± 5 πιμ beträgt

IZ Fluoreszenzauflicht-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Fluoreszenz anzuregende Objekt (6) mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist, welcher ultraviolettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet und daß die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 4!0πιμ± 5 πιμ beträgt.