DE102019109607A1

DE102019109607A1 - Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop

Info

Publication number: DE102019109607A1
Application number: DE102019109607.3A
Authority: DE
Inventors: Werner Knebel; Florian Fahrbach; Elena Remacha Motta
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2020-02-13
Also published as: WO2020030420A1

Abstract

Beschrieben ist eine Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop, insbesondere ein Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder ein Schiefeebenemikroskop, wie ein OPM- oder SCAPE-Mikroskop, zur Beleuchtung einer Probe, wobei die Beleuchtungsanordnung einen Beleuchtungseingang zur Einspeisung eines Beleuchtungsstrahlenbündels einer kohärenten Lichtquelle entlang einer optischen Achse der Beleuchtungsanordnung, ein Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels in mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel, ein fokussierendes optisches System zur Fokussierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel und einen einer Probenseite zugewandten Beleuchtungsausgang zur Ausgabe der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel zur Probenseite, aufweist. Das fokussierende optische System fokussiert die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel und bringt sie in einem Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang so zur Überlagerung, dass die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel ein Interferenzmuster ausbilden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Mikroskopie und betrifft eine Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop, insbesondere ein Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder ein Schiefeebenemikroskop, wie ein OPM- oder SCAPE-Mikroskop, zur Beleuchtung einer Probe. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein entsprechendes Verfahren.
Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere ein Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder ein Schiefeebenemikroskop, wie ein OPM- oder SCAPE-Mikroskop und ein Verfahren zur Beleuchtung eines Probenvolumens in einem Mikroskop, insbesondere in einem Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder in einem Schiefeebenemikroskop, wie einem OPM- oder SCAPE-Mikroskop.
Die oben genannten Mikroskope haben gemeinsam, dass die Beleuchtung einer Probe mit einem sogenannten Lichtblatt erfolgt, welches sich zweidimensional erstreckt und die geringste Ausdehnung entlang einer Dickenrichtung senkrecht zur zweidimensionalen Ausdehnung aufweist. Wird das Lichtblatt aus dem Beleuchtungslicht beispielsweise durch eine Zylinderlinse oder eine Spaltblende (Schlitzblende) erzeugt, spricht man von einem statischen Lichtblatt, wohingegen ein sogenanntes virtuelles Lichtblatt erst dadurch entsteht, dass das Beleuchtungslicht, beispielsweise ein Beleuchtungsstrahl mit beispielsweise rundem Strahlquerschnitt, entlang einer Richtung senkrecht zur Ausbreitungsrichtung und zur Dickenrichtung durch eine Scananordnung (Scanner) gescannt (hin- und herbewegt) wird, sodass bei ausreichend schneller Scanbewegung scheinbar ein Lichtblatt entsteht.
Aus dem Stand der Technik ist aus der Lichtblattmikroskopie bekannt, ein Axikon und/oder einen Doppelkeil und/oder Blenden einzusetzen, um ein Beleuchtungsstrahlenbündel aufzuspalten, wobei eine Fokussierung in die hintere Brennebene erfolgt. Die Strahlen werden kollimiert in den Bereich der Probe eingebracht. Typischerweise wird aus der ursprünglich ringförmigen Verteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels etwas ausgeschnitten, hierbei geht Licht verloren. Ein Beispiel für ein solches Vorgehen im Stand der Technik ist beispielsweise das sog. Lattice Light Sheet. Eine beispielhafte Konfiguration, bei der zur Lichtblatterzeugung zwei Lichtstrahlen in kollimierter, d.h. nicht fokussierter Form, in die Probe geleitet werden, ist in der Druckschrift DE 10 2007 063 274 A1 beschrieben.
Zum Stand der Technik wird ferner auf die Druckschrift WO 2017/220699 A1 verwiesen, die eine Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop zum Erzeugen einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung offenbart, bei der ein Primärbeleuchtungslichtbündel in zwei Teilbeleuchtungslichtbündel aufgeteilt und durch ein Beleuchtungsobjektiv zur interferierenden Überlagerung in die Probe geleitet wird. Dabei wird ein relativer Phasenversatz zwischen den beiden Teilbeleuchtungslichtbündeln generiert, um sicherzustellen, dass das im Bereich der Überlagerung entstehende Interferenzmuster entlang der optischen Beleuchtungsachse eine Nullstelle aufweist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Beleuchtungsanordnung, ein Mikroskop und ein Verfahren zu schaffen, welche eine höhere Auflösung bei der Bildaufnahme bei gleichzeitiger guter Ausnutzung des zur Verfügung stehenden Lichts des Beleuchtungsstrahlenbündels mit wenig Verlusten ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 1 gelöst, wobei die Beleuchtungsanordnung einen Beleuchtungseingang zur Einspeisung eines Beleuchtungsstrahlenbündels einer kohärenten Lichtquelle, beispielsweise einen Laser, entlang einer optischen Achse der Beleuchtungsanordnung, ein Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels in mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (im Folgenden auch kurz Teilstrahlen oder Teilstrahlenbündel), ein fokussierendes optisches System (im Folgenden auch Beleuchtungsoptik) zur Fokussierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel und einen einer Probenseite zugewandten Beleuchtungsausgang zur Ausgabe der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel zur Probenseite, aufweist, wobei das fokussierende optische System die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel fokussiert und in einem Bereich (einem Raumvolumen, im Folgenden auch als Interferenzbereich bezeichnet) am probenseitigen Beleuchtungsausgang so zur Überlagerung bringt, dass diese ein Interferenzmuster ausbilden. Obwohl im Folgenden vorwiegend der Spezialfall von zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündeln betrachtet wird, so sind auch mehr als zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel denkbar.
Das eingangs genannte erfindungsgemäße Mikroskop löst die obige Aufgabe dadurch, dass das Mikroskop ein Probenvolumen und eine erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung zur Beleuchtung des Probenvolumens umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Beleuchtung einer Probe, vorzugsweise unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung umfasst die folgenden Verfahrensschritte:

- Einspeisen eines kohärenten Beleuchtungsstrahlenbündels in einen Beleuchtungseingang der Beleuchtungsanordnung,
- Erzeugen mindestens zweier Teilbeleuchtungsstrahlenbündel mit einem Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels,
- Fokussierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel mittels eines fokussierenden optischen Systems,
- Überlagerung der beiden fokussierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel unter Ausbildung eines Interferenzmusters in einem Bereich, der sich mit der Probe überlappt oder diese umschließt.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung, das erfindungsgemäße Mikroskop und das erfindungsgemäße Verfahren können durch die folgenden, jeweils unabhängig voneinander kombinierbaren Ausgestaltungen weiter verbessert werden.
Das Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels kann mindestens einen Strahlteiler und/oder mindestens einen Glasblock und/oder mindestens eine planparallele Platte beinhalten. Auch kann das Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels mindestens zwei drehbare Strahlteiler oder mindestens einen beweglichen Strahlteiler und mindestens einen beweglichen Spiegel beinhaltet, um die Flexibilität und Justierbarkeit der Beleuchtungsanordnung zu erhöhen.
Weiterhin können die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel zwischen dem Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels und des fokussierenden optischen Systems im Wesentlichen parallel zueinander verlaufen.
Auch kann die Beleuchtungsanordnung so ausgestaltet sein, dass die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems parallel zur optischen Achse der Beleuchtungsanordnung verlaufen.
Es ist des Weiteren vorteilhaft, wenn die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems im Wesentlichen kollimiert sind.
Zur Erzeugung eines Lichtblattes im Probenvolumen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung sind verschiedene Ausgestaltungen der Erfindung denkbar:

So kann die Beleuchtungsanordnung beispielsweise eine oder mehrere Scananordnungen (Scanner), durch die der Interferenzbereich in einer Ebene hin- und herbewegt werden kann, umfassen. Dies kann beispielsweise so realisiert sein, dass der Scanner auf das Beleuchtungsstrahlenbündel vor Durchlaufen des Mittels zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels wirkt. Hierdurch werden die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel hin- und herbewegt und damit das durch diese erzeugte Interferenzmuster. Es wird so ein virtuelles Lichtblatt erzeugt.

Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die Beleuchtungsanordnung zur Erzeugung eines statischen Lichtblattes auch mindestens eine Zylinderlinse umfassen, durch die das Beleuchtungsstrahlenbündel oder die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel vor oder beim Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems in einer Richtung fokussiert werden.
Die Fokussierung der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel durch eine Zylinderlinse erfolgt entlang nur einer ersten Richtung, während die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel in einer zweiten Richtung, die quer zur ersten Richtung steht, im Wesentlichen kollimiert bleiben. Beispielsweise kann mittels einer Zylinderlinse die Teilstrahlenbündel nur entlang der Richtung fokussiert werden, die quer zu der Achse liegt, entlang der die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems zueinander beabstandet sind. Die Zylinderlinse kann auch Teil des fokussierenden optischen Systems sein oder identisch mit diesem sein.
Weiterhin alternativ oder zusätzlich kann die Beleuchtungsanordnung zur Erzeugung eines statischen Lichtblattes auch mindestens eine Spaltblende umfassen, durch die das Beleuchtungsstrahlenbündel oder die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel vor oder beim Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems in mindestens einer Richtung begrenzt werden.
Idealerweise wird mit den erfindungsgemäß erzeugten Teilbeleuchtungsstrahlenbündeln eine Probe beleuchtet und in dieser Fluoreszenz angeregt, die mit Hilfe einer Detektionsoptik detektiert wird. Besondere Vorteile ergeben sich aus der Verwendung der Beleuchtungsanordnung in einem Lichtblattmikroskop, in dem die Beleuchtungsanordnung ein Lichtblatt in der Probe generiert, das mit der Detektionsrichtung einen Winkel von 90° oder näherungsweise 90° einschließt, beispielsweise 75°, vorzugsweise 85°, besonders vorzugsweise 87°, ganz besonders vorzugsweise 89° einschließt, und in dem die Ausbreitungsrichtung des Lichtblatts in der Fokusebene der Detektionsoptik liegt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Beleuchtungsanordnung ist vorgesehen, dass das fokussierende optische System die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel derart fokussiert, dass die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel in dem genannten Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang die optische Achse der Beleuchtungsanordnung schneiden. Dabei laufen die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel nach Durchtritt durch das fokussierende optische System vorzugsweise so aufeinander zu, dass der Schnittpunkt der Zentral- oder Hauptstrahlen, welche die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel repräsentieren, auf der optischen Achse der Beleuchtungsanordnung liegt.
Vorzugsweise ist ferner vorgesehen, dass das fokussierende optische System die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel derart fokussiert, dass das Strahlprofil jedes fokussierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündels in dem genannten Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang eine Strahltaille aufweist. Die vorzugsweise variabel einstellbaren Strahltaillen bestimmen zusammen mit dem Winkel, unter dem das jeweilige Teilbeleuchtungsstrahlenbündel die optische Achse der Beleuchtungsanordnung schneidet, die räumliche Ausdehnung des Interferenzmusters, das durch die Überlagerung der beiden Teilbeleuchtungs-strahlenbündel in der Probe entsteht.
Vorzugsweise umfasst die Beleuchtungsanordnung ein Mittel zum Einstellen des Strahldurchmessers des Beleuchtungsstrahlenbündels oder des jeweiligen Teilbeleuchtungsstrahlenbündels. Dieses Mittel ist z.B. in Form einer Teleskopoptik, einer Zoomoptik, eines Beamexpanders und/oder eines telezentrischen 4F-Systems realisiert. Ferner kann es in Lichtausbreitungsrichtung vor oder auch nach der Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels angeordnet sein. Im ersteren Fall wirkt es somit auf das von der Lichtquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel, während es im zweiten Fall separat auf die schon getrennten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel wirkt.
Vorzugsweise treten die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel jeweils mit einem Versatz quer zur optischen Achse der Beleuchtungsanordnung außermittig in das fokussierende optische System. Durch diese beidseitige, außermittige Unterleuchtung des fokussierenden optischen Systems lassen sich in besonders effizienter Weise die Winkel einstellen, unter denen die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel auf die optische Achse der Beleuchtungsanordnung und damit aufeinander zulaufen. Je größer die vorgenannten Winkel gegenüber der optischen Achse sind, desto kleiner ist die Periode des durch die Überlagerung der beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel generierten Interferenzmusters. Die Periode des Interferenzmusters bestimmt wiederum die Zahl an Lichtblättern, die im Bereich der Überlagerung der beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel in paralleler Anordnung zueinander und senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik erzeugt werden, sowie die Dicke des jeweiligen Lichtblattes, insbesondere die Dicke des für die Abbildungsqualität maßgeblichen zentralen Lichtblattes, das in der Fokusebene der Detektionsoptik liegt.
Ferner sieht die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere ein Lichtblatt- und SPIM-Mikroskop oder ein Schiefeebenemikroskop wie ein OPM- oder SCAPE-Mikroskop vor, das eine Beleuchtungsanordnung erfindungsgemäßer Art umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mikroskop eine Detektionsoptik, deren optische Achse zumindest näherungsweise senkrecht zur optischen Achse der Beleuchtungsanordnung liegt.
Vorzugsweise ist die Beleuchtungsanordnung des Mikroskops ausgebildet, durch das Interferenzmuster eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung aus mehreren parallel zueinander angeordneten Lichtblättern zu generieren, die aus Intensitätsmaxima des Interferenzmusters gebildet sind und zumindest näherungsweise senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik liegen. Mittels der Beleuchtungsanordnung lässt sich die Beleuchtungslichtverteilung insbesondere im Hinblick auf die Anzahl der zur Abbildung der Probe beitragenden Lichtblätter sowie deren Dicken in gewünschter Weise einstellen. Was die flexibel einstellbare Lichtblattdicke betrifft, ist hierbei insbesondere die Dicke des für die Abbildung maßgeblichen zentralen Lichtblattes zu berücksichtigen, das in die Fokusebene der Detektionsoptik gelegt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mikroskop ein Mittel zum Positionieren des Interferenzmusters relativ zu einer Fokusebene der Detektionsoptik derart, dass eines der Intensitätsmaxima des Interferenzmusters, vorzugsweise das zentrale Intensitätsmaximum in der Fokusebene liegt.
Ferner umfasst das Mikroskop vorzugsweise ein Mittel zum Anpassen der Periode des Interferenzmusters an die Schärfentiefe der Detektionsoptik. Auf diese Weise lässt sich die Lichtblattbeleuchtung besonders flexibel an Vorgaben anpassen, die durch die Detektionsoptik gegeben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung zum Zweck der Probenbeleuchtung einen Strahlteiler auf, der ein kohärentes Beleuchtungsstrahlenbündel einer Lichtquelle, typischerweise eines Lasers, in zwei einzelne Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (einen ersten Teilstrahl (Teilstrahlenbündel 1) und einen zweiten Teilstrahl (Teilstrahlenbündel 2)) aufteilt. Die Kohärenzlänge des Beleuchtungsstrahlenbündels kann dabei in der Größenordnung des Weglängenunterschieds liegen, der zwischen den beiden Teilstrahlen im Probenvolumen bzw. im Interferenzbereich besteht. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist das Probenvolumen der Raumbereich, in dem sich die Probe befindet, in der mittels der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel Fluoreszenz angeregt wird. Typischerweise liegt es um die Fokusebene des Beleuchtungsobjektivs und des Detektionsobjektivs herum. Das Probenvolumen überdeckt sich zumindest teilweise mit dem Interferenzbereich.
Vorzugsweise ist die Kohärenzlänge größer als der Weglängenunterschied zwischen den beiden Teilstrahlen. Die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel verlaufen auf der lichtquellenseitigen Brennebene einer Beleuchtungsoptik (beispielsweise eines Beleuchtungsobjektivs) im Wesentlichen parallel zu dessen optischer Achse. Vorzugsweise verlaufen die Strahlen in diesem lichtquellenseitigen Bereich (Raumregion) im Wesentlichen kollimiert, das bedeutet insbesondere, dass sie nicht durch eine weitere Optik in die hintere Brennebene fokussiert sind (vgl. auch 2). Die beiden Teilstrahlen sind entlang einer Richtung versetzt, die nachfolgend als Detektionsrichtung bezeichnet wird.
Nach Durchlaufen der Beleuchtungsoptik werden die Teilstrahlen gegen die optische Achse der Beleuchtungsoptik abgelenkt. Die Ausbreitungsrichtung der Teilstrahlenbündel schließt nun einen Winkel b1 (für Teilstrahl 1), b2 (für Teilstrahl 2) mit der optischen Achse ein (vgl. auch 5). Die Winkel b1 und b2 sind proportional zum Abstand des jeweiligen Teilstrahlenbündels in der lichtquellenseitigen Brennebene. Die Teilstrahlenbündel werden durch das Objektiv darüber hinaus fokussiert, und zwar unter dem Winkel a1 (Teilstrahl 1) bzw. a2 (Teilstrahl 2) der von dem Durchmesser des jeweiligen Teilstrahls in der hinteren Brennebene abhängt. Die beiden Teilstrahlenbündel schneiden die optische Achse jeweils in einem Schnittbereich. Die Teilstrahlenbündel überlappen und interferieren in einem Volumen, dem Interferenzbereich, der idealerweise an der und um die optische Achse herum liegt. Die Größe des Interferenzbereichs und Länge des Schnittbereichs hängen von a1, a2, b1 und b2 ab (vgl. auch 5)
Die Teilstrahlen müssen in der Beleuchtungsanordnung vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems (der Beleuchtungsoptik, lichtquellenseitig) nicht zwingend parallel zur optischen Achse verlaufen. Dies stellt allerdings eine besonders einfach zu realisierende Möglichkeit dar, bei der der Interferenzbereich in der objektseitigen Fokusebene der Beleuchtungsoptik liegt.
Die Teilstrahlen verlaufen in der Beleuchtungsanordnung vorzugsweise lichtquellenseitig im Wesentlichen kollimiert. Dieses Vorgehen weist u.a. den Vorteil auf, dass es eine besonders effiziente Erzeugung des Interferenzmusters und damit der erfindungsgemäßen Probenbeleuchtung erlaubt.
Im Beleuchtungsstrahlengang ist ein Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels in zwei Teilstrahlenbündel vorgesehen. Zusätzlich kann auch ein Mittel zur Positionierung der Teilstrahlenbündel in der hinteren Brennebene der Beleuchtungsoptik vorgesehen sein. Diese beiden Aufgaben können auch von einem einzigen Mittel erreicht werden.
Beispielsweise kann die Aufgabe durch einen Strahlteiler und einen Spiegel erfüllt werden. Die beiden Bauteile sind vorzugsweise so gekoppelt, dass sie sich gemeinsam, insbesondere symmetrisch gegen die optische Achse verschieben lassen (vgl auch 3).
Alternativ kann ein Glasblock (insbesondere eine planparallele Platte) verwendet werden (vgl. auch 1). Dieser weist eine Vorder- und eine Rückseite und eine Drehachse auf. Die Vorder- und Rückseite sind vorzugsweise zueinander parallel. Die Drehachse verläuft ebenfalls vorzugsweise parallel zu Vorder- und Rückseite. Der Glasblock weist einen teilverspiegelten Bereich auf. Das Beleuchtungsstrahlenbündel trifft gegenüber der optischen Achse versetzt auf den verkippten Glasblock, wird an der Eintrittsfläche gebrochen und nach Durchlaufen des Glasblocks an einem teilverspiegelten Bereich teilweise reflektiert, vorzugsweise zu 50%. Das an dieser Stelle transmittierte Licht wird an der Grenzfläche wiederum gebrochen und verläuft weiterhin parallel zur optischen Achse (Teilstrahlenbündel 1). Das reflektierte Licht bildet das Teilstrahlenbündel 2 und läuft weiterhin durch den Glasblock und trifft auf einen vollverspiegelten Bereich an dem es wiederum reflektiert wird und nach einem weiteren Durchlauf durch den Glasblock diesen in Probenrichtung verlässt, wobei es an der Grenzfläche gebrochen wird.
Idealerweise verlaufen Teilstrahlenbündel 1 und 2 hinter dem Glasblock symmetrisch zur optischen Achse. Zu diesem Zweck kann je nach Drehwinkel des Glasblocks erforderlich sein, dass der Abstand, in dem das Beleuchtungsstrahlenbündel zur optischen Achse in den Glasblock eingekoppelt wird, verändert wird. Dies kann z.B. durch einen weiteren drehbaren Glasblock (vorzugsweise eine planparallele Platte) erreicht werden.
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren erläutert. Darin zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einer Beleuchtungsanordnung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
2 eine schematische Darstellung, die eine Anordnung eines fokussierenden optischen Systems des Mikroskops nach 1 relativ zu einer in dem Mikroskop enthaltenen Detektionsoptik zeigt;
3 eine schematische Darstellung, die eine gegenüber dem in den 1 und 2 dargestellten Mikroskop abgewandelte Ausführungsform zeigt;
4 eine schematische Darstellung, die eine Überlagerung zweier fokussierter Teilbeleuchtungsstrahlenbündel zur Erzeugung eines Interferenzmusters zeigt;
5 eine der 4 entsprechende Darstellung, in der Kenngrößen angegeben sind, anhand derer die Ausdehnung des Interferenzmusters einstellbar ist; und
6 eine schematische Darstellung, in welcher der Zusammenhang zwischen einer Detektionspunktspreizfunktion und dem Intensitätsverlauf des Interferenzmusters veranschaulicht ist.

Die 1 und 2 zeigen Teile eines Mikroskops 100, das ein Ausführungsbeispiel der Erfindung darstellt. Das Mikroskop 100 ist in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel als Lichtblattmikroskop ausgeführt, das eine Beleuchtungsanordnung 102 zur Beleuchtung einer Probe 104 sowie eine (nur in 2 dargestellt) Detektionsoptik 106 umfasst. In der beispielhaften Konfiguration gemäß den 1 und 2 sind die Beleuchtungsanordnung 102 und die Detektionsoptik 106 so zueinander angeordnet, dass ihre optischen Achsen BO bzw. DO im Wesentlichen senkrecht zueinander liegen. Dies bedeutet, dass eine in den 1 mit DR bezeichnete Detektionsrichtung senkrecht zur optischen Achse BO der Beleuchtungsanordnung 102 liegt, die eine Beleuchtungsrichtung BR definiert. In den Figuren wird diesbezüglich auf ein rechtwinkliges Koordinatensystem Bezug genommen, dessen z-Achse mit der optischen Achse BO der Beleuchtungsanordnung 102 und dessen x-Achse mit der optischen Achse BO der Detektionsachse DO der Detektionsoptik 106 zusammenfällt. Somit definiert die z-Achse die Beleuchtungsrichtung BR und die x-Achse die Detektionsrichtung DR.
Die Beleuchtungsanordnung 102 des Mikroskops 100 weist einen Beleuchtungseingang 108 mit einer Lichtquelle 110 auf, die beispielsweise als Laserlichtquelle ausgeführt ist und ein kohärentes Beleuchtungsstrahlenbündel 112 aussendet. Um den Strahldurchmesser des von der Lichtquelle 110 ausgesendeten Beleuchtungsstrahlenbündels 112 nach Wunsch einstellen zu können, ist in der Beleuchtungsanordnung 102 eine optionale Baugruppe 114 vorhanden, die beispielsweise durch eine Teleskopoptik, einen Beam-Expander oder ein telezentrisches 4f-System gebildet ist. In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel weitet die Baugruppe 112 den Strahldurchmesser des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 auf, worauf das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 einem Mittel 116 zugeführt wird, welches dazu dient, das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 in mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 aufzuteilen.
In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist das vorgenannte Mittel 116 aus zwei längs der optischen Achse BO hintereinander angeordneten planparallelen Platten 122, 124 gebildet, die jeweils als transparenter Block, z.B. Glasblock ausgeführt sind und eine senkrecht zur optischen Achse BO liegende Drehachse 126 bzw. 128 aufweisen, um die sich die jeweilige planparallele Platte 122 bzw. 124 in einer Richtung verdrehen lässt, die in 1 für die Platte 122 mit einem Pfeil P1 und die Platte 124 mit einem Pfeil P2 angedeutet ist. Zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 wird Letzteres zunächst an einer zur optischen Achse BO schräggestellten Vorderseite 130 der planparallelen Platte 122 von der optischen Achse BO weggebrochen, durchläuft die planparallele Platte 122 und wird dann an einer Rückseite 132, die parallel zur Vorderseite 130 angeordnet ist, so zurück in Richtung der optischen Achse BO gebrochen, dass das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 mit einem Parallelversatz gegenüber der optischen Achse BO aus der Platte 122 austritt. Anschließend fällt das auf diese Weise parallel versetzte Beleuchtungsstrahlenbündel 112 auf eine Vorderseite 134 der planparallelen Platte 124, die ebenfalls schräg zur optischen Achse BO ausgerichtet ist und somit das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 weiter von der optischen Achse BO weg bricht. Anschließend durchläuft das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 die planparallele Platte 124 und fällt auf einen teilverspiegelten Bereich 136 einer Rückseite 138 der Platte 124, der das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 zu einem Teil reflektiert und zum anderen Teil transmittiert. Beispielsweise ist der teilverspiegelte Bereich 136 so ausgeführt, dass er das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 zu etwa 50 % reflektiert und zu etwa 50 % transmittiert.
Dertransmittierte Anteil des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 wird durch die Rückseite 138 der planparallelen Platte 124 wieder in Richtung der optischen Achse BO gebrochen, so dass er mit einem weiteren Parallelversatz gegenüber der optischen Achse BO aus der Platte 124 austritt. Demgegenüber wird der reflektierte Anteil des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 innerhalb der planparallelen Platte 124 schräg zur optischen Achse BO in Richtung eines vollverspiegelten Bereichs 140 der Vorderseite 134 reflektiert, der wiederum diesen Anteil des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 zurück auf einen nichtverspiegelten Bereich 142 der Rückseite 138 der planparallelen Platte 124 reflektiert. Dieser nichtverspiegelte Bereich 142 der Rückseite 138 bricht den auf ihn fallenden Anteil des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 derart, dass Letzterer wiederum mit einem Parallelversatz gegenüber der optischen Achse BO aus der planparallelen Platte 124 austritt. Dabei ist der vorgenannte Parallelversatz gegenläufig zu demjenigen Versatz, mit dem der teilverspiegelte Bereich 136 der planparallelen Platte das Beleuchtungsstrahlenbündel 112 bei dessen Austritt aus der planparallelen Platte 124 versieht.
In dem Ausführungsbeispiel nach 1 sind die vorgenannten Parallelversätze gerade so gewählt, dass die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in gleichen Abständen zu beiden Seiten der optischen Achse BO parallel zu dieser propagieren. Ferner ist die Beleuchtungsanordnung 102 in dem gezeigten Ausführungsbeispiel so konfiguriert, dass die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 jeweils in Form eines kollimierten Lichtbündels auf eine Beleuchtungsoptik, z.B. ein Beleuchtungsobjektiv 144 fallen, welches ein fokussierendes optisches System darstellt. Durch die unter Verwendung der planparallelen Platten 122, 124 bewirkte Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 werden die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 dabei so in das Beleuchtungsobjektiv 144 geleitet, dass die Letzteres zu beiden Seiten der optischen Achse BO außermittig unterleuchtet wird.
Die fokussierende Wirkung des Beleuchtungsobjektivs 144, das einen Beleuchtungsausgang 145 der Beleuchtungsanordnung 102 bildet, liegt zum einen darin, dass es die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in Richtung der optischen Achse BO ablenkt, so dass die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 nach Durchtritt durch das Beleuchtungsobjektiv 144 aufeinander zulaufen und einander auf der optischen Achse BO schneiden. Zum anderen bewirkt das Beleuchtungsobjektiv 144, dass jedes der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 für sich betrachtet in Richtung der optischen Achse BO konvergiert, so dass es im Bereich des vorgenannten Schnittpunktes einen Beleuchtungsfokus in Form einer Strahltaille ausbildet (vgl. 4 und 5). Somit formt das Beleuchtungsobjektiv 144 aus den beiden kollimierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in der Probe 104 zwei fokussierte Lichtverteilungen, die so zur Überlagerung gebracht werden, dass sie ein weiter unten genauer erläutertes Interferenzmuster ausbilden.
Zur Erzeugung einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung ist in dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 ferner ein Bauelement 146 vorgesehen, das beispielsweise zwischen der Baugruppe 114 und der planparallelen Platte 122 angeordnet ist. Dieses Bauelement 146 kann durch einen Scanner gebildet sein, der das beispielsweise mit einem runden Strahlquerschnitt aus der Lichtquelle 110 emittierte Beleuchtungsstrahlenbündel 112 längs einer Richtung senkrecht zur Lichtausbreitungsrichtung hin- und her bewegt, um ein sogenanntes virtuelles Lichtblatt zu generieren. Das Bauelement 146 kann in einer alternativen Ausführungsform aber auch beispielsweise als Zylinderlinse ausgeführt sein, die eine Fokussierung des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 in nur einer Richtung bewirkt, um auf diese Weise ein statisches Lichtblatt zu generieren. Zusätzlich oder alternativ kann zur Lichtblatterzeugung auch eine Spalt- oder Schlitzblende 148 z.B. zwischen der Lichtquelle 110 und der Baugruppe 114 vorgesehen werden.
Wie nochmals in der Darstellung nach 2 veranschaulicht, propagieren die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in Form kollimierter Lichtbündel in Richtung des Beleuchtungsobjektivs 144. Insbesondere durchsetzen sie die in 2 mit FB1 bezeichnete lichtquellenseitige Brennebene des Beleuchtungsobjektivs 144 als kollimierte Lichtbündel. In 2 ist ferner dargestellt, dass die Detektionsoptik 106 unter Berücksichtigung ihrer Brennweite f relativ zur Beleuchtungsanordnung 102 so positioniert ist, dass die in 2 mit FD bezeichnete objektseitige Fokus- oder Brennebene der Detektionsoptik 106 mit der optischen Achse BO der Beleuchtungsanordnung 102 zusammenfällt, d.h. auf Letztere fokussiert ist. 2 zeigt ferner die objektseitige Brennebene FB2 des Beleuchtungsobjektivs 102, die mit der optischen Achse DO der Detektionsoptik 106 zusammenfällt und damit senkrecht zur Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 liegt.
In 3 ist eine abgewandelte Ausführungsform dargestellt, die zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 anstelle der beiden planparallelen Platten 122, 124 einen Strahlteiler 150 sowie einen Spiegel 152 aufweist. Der Strahlteiler 150 ist so ausgeführt, dass er einen Teil des einfallenden Beleuchtungsstrahlenbündels 112 in Richtung des Beleuchtungsobjektivs 144 reflektiert, während er den übrigen Teil transmittiert. Der transmittierte Teil des Beleuchtungsstrahlenbündels 112 fällt dann auf den Spiegel 152 und wird an diesem auf das Beleuchtungsobjektiv 144 reflektiert. Um eine variable Positionierung der beiden in dieser Weise generierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 quer zur optischen Achse BO zu ermöglichen, sind in der gezeigten Abwandlung sowohl der Strahlteiler 150 als auch der Spiegel 152 mittels geeigneter Stellelemente senkrecht zur optischen Achse BO bewegbar, wie in der Darstellung nach 3 durch die beiden Doppelpfeile P3, P4 angedeutet ist.
Unter Bezugnahme auf die 4 bis 6 wird im Folgenden anhand eines Beispiels erläutert, wie sich mit Hilfe der beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 das durch deren Überlagerung in der Probe 104 erzeugte Interferenzmuster zur Optimierung der optischen Abbildung variieren lässt. Dabei zeigen die 4 und 5 schematisch einen Interferenzbereich, innerhalb dessen das mit IM bezeichnete Interferenzmuster durch Überlagerung der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 generiert wird. In 6 sind eine Detektionspunktspreizfunktion (Detektions-PSF) der Detektionsoptik 106 und der Intensitätsverlauf des Interferenzmusters IM einander gegenübergestellt.
Die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 interferieren im Probenvolumen (also dem Raumvolumen, das durch die Probe ausgefüllt wird) in einem Raumbereich (Interferenzbereich), dessen Länge zl von der Schärfentiefe der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 sowie dem Winkel b1 bzw. b2, unter dem das jeweilige Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 gegen die optische Achse BO geneigt verläuft, abhängt. Das Interferenzmuster IM der beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 verläuft dabei entlang der Detektionsrichtung DR bzw. x und kann näherungsweise beschrieben werden durch eine sin²(x)-Funktion, die mit einer Einhüllenden multipliziert wird, die durch das Profil der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 gegeben ist. Die Breite des Interferenzmusters IM entlang der Detektionsrichtung x ergibt sich aus der Breite w1, w2 der Strahltaillen der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 und dem Winkel b1, b2 relativ zur optischen Achse BO. Die Länge zl des Interferenzmusters entlang der Beleuchtungsachse ergibt sich näherungsweise gemäß zl = w1 / sin(b1) = w2 / sin(b2), sofern angenommen wird, dass w1 = w2 und b1 = b2 gilt. Diese Annahme dient lediglich der vereinfachten Erläuterung und soll die vorgenannten Kenngrößen der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel in keiner Weise beschränken.
Weiterhin besteht die Möglichkeit, die zwei im Wesentlichen kollimierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in der hinteren Brennebene des Beleuchtungsobjektivs 144 so zu positionieren, dass die Länge und Breite des Interferenzmusters IM (also des Interferenzbereiches) an die Probe 104 und die Beleuchtungsoptikangepasst sind, bspw. die Probe 104 möglichst deckend beleuchten. Zu beachten sind hierbei insbesondere die folgenden drei Punkte:

1. Die Länge zl des Bereichs IM kann durch Einstellen des Durchmessers derTeilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 angepasst werden. Größere Strahldurchmesser in der hinteren Brennebene FB1 erhöhen den Fokussierwinkel a1, a2 der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120, verkürzen also den Interferenzbereich. Die Größe der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 kann beispielsweise durch die Baugruppe 114, also z.B. eine Teleskopoptik und/oder einen Beamexpander und/oder ein telezentrisches 4f-System für die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 separat oder gemeinsam (dann idealweise vor der Aufspaltung, also auf das Beleuchtungsstrahlenbündel wirkend) erfolgen.
2. Die Auflösung des Mikroskops 100 entlang der Detektionsachse DO kann insbesondere dadurch erhöht bzw. optimiert werden, dass die Periode des Interferenzmusters IM verändert bzw. optimiert wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Position der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in der hinteren Brennebene FB1 des Beleuchtungsobjektivs 144 verändert / angepasst wird. Die Veränderung der Strahlpositionen ist weiter oben erklärt. Eine besonders vorteilhafte Periode des Interferenzmusters IM kann hier z.B. so gewählt werden, dass die doppelte Periode genau der vollen Schärfentiefe der Detektionsoptik 106 entspricht (vgl. 6). Die volle Schärfentiefe ist in diesem Zusammenhang die Distanz der zwei Minima vor und hinter dem Fokus, an denen die Intensität entlang der optischen Achse DO bzw. x auf nahezu 0 abfällt. Wird die Struktur der Beleuchtung derart gewählt, bedeutet dies, dass die axiale Auflösung des gesamten optischen Systems (bestehend aus Beleuchtung und Detektion) näherungsweise verdoppelt werden kann gegenüber dem System mit der gleichen Detektion ohne vorteilhafte Beleuchtung.
3. Besonders können die Veränderung von Abstand und Durchmesser der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 gekoppelt angepasst werden, so dass z.B. die Länge zl des Bereichs unverändert bleibt, indem die Strahldurchmesser in der hinteren Brennebene FB1 verkleinert werden (und mit ihnen a1, a2), wenn die Winkel b1 und b2 angepasst werden, um die Periode des Interferenzmusters IM zu erhöhen.

Das Interferenzmuster IM wird gegenüber der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 justiert, insbesondere wird ein Maximum des Interferenzmusters IM direkt in die Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 gelegt. Für die typischerweise genutzte symmetrische Aufspaltung in zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 bedeutet dies, dass das zentrale Maximum des Interferenzmusters IM in der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 liegt. Bei einer asymmetrischen Verteilung wird das ausgeprägteste, stärkste Maximum, also das mit der höchsten Intensität, in die Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 justiert.
Die optische Achse BO der Beleuchtungsoptik 144 liegt idealerweise in der Fokusebene FD des Detektionsobjektivs 106, mit dem das durch das Beleuchtungslicht (das Interferenzmuster der Teilbeleuchtungsstrahlen) angeregte Probenlicht / Fluoreszenzlicht auf einen Flächendetektor, beispielsweise einen Kamera-Sensor, abgebildet wird. Im dem Detektionsstrahlengang von Fokusebene des Detektionsobjektiv bis Kamera können sich zusätzlich auch andere Optiken und optische Vorrichtungen befinden, beispielsweise Linsen (wie eine Tubuslinse), dichroitische Filter, Bandpass-Filter, Spiegel und Strahlteiler.
Anmerkung: Vollständig kollimierte Strahlen existieren in der Realität nicht, da Licht eine Welle ist und damit Beugungseffekten unterliegt. Kollimierte Strahlen sind ein übliches Modell, um Strahlen zu beschreiben, deren Durchmesser sich nur sehr schwach verändert. Dies ist z.B. immer dann der Fall, wenn ein Strahlenbündel einen Fokus bzw. im Bild Gauss'scher Strahlen eine Strahltaille (alle Strahlen des Bündels schneiden sich in einem Punkt) in einer rückwärtigen Brennebene einer Optik aufweist - das Strahlenbündel in der vorderseitigen Brennebene wird dann als „kollimiert“ bezeichnet, und die einzelnen Strahlen des Bündels werden parallel zu einander gezeichnet. Im vorliegenden Fall wird unter „im Wesentlichen kollimiert“ verstanden, dass die Strahlen näherungsweise kollimiert sind, sich also der Durchmesser bei der Propagation über in der Beschreibung relevante Längen nur um einen kleinen relativen Anteil, vorzugsweise 1% verändert. Alternativ kann für Gauss'sche Strahlen eine Divergenz angegeben werden, die vom Verhältnis des Durchmessers des Strahlenbündels zur Wellenlänge abhängt. Im Fall der vorliegenden Erfindung wäre diese Verhältnis > 1000, z.B. 1 mm Strahldurchmesser bei einer Wellenlänge von 0.5 µm. Insbesondere bedeutet „kollimiert“ und „im Wesentlichen kollimiert“ im Rahmen dieser Erfindung, dass die Lagen eines Fokus oder einer Strahltaille nicht weiter spezifiziert werden muss, also z.B. die Lage gegenüber der Fokusebene einer Optik keine relevanten Auswirkungen auf den weiteren Strahlverlauf (etwa die Lage der Foki hinter weiteren Optiken) hat.
Die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 werden in den Figuren mittels ihrer Einhüllenden dargestellt. Diese Einhüllende sind Linien konstanter Intensität (Iso-Intensitätslinien) und kennzeichnen den Verlauf der Grenze, an der die Intensität auf einen bestimmten Teil des Maximalwerts abgefallen ist. Für einen entlang einer Achse z sich ausbreitenden Strahl markiert die Iso-Intensitätslinie die Position, an der die Intensität l(r,z) auf l(0,z)/e² abgefallen ist, wobei r eine radiale Koordinate senkrecht zur z-Achse bezeichnet. Gleiches gilt für 6, in der die DetektionsPunktspreizfunktion (Detektions-PSF) durch Iso-Intensitätslinien als Einhüllende dargestellt ist.
Wie die vorstehenden Erläuterungen zeigen, lässt sich über die beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 die Ausdehnung des Interferenzmusters IM in einfacher Weise steuern. So können sowohl die Länge als auch die Breite des Interferenzmusters IM, das in den in den 4 und 5 dargestellten Schnitten ein näherungsweise rautenförmiges Muster darstellt, zum einen über die Fokussierwinkel a1, a2 der Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 und zum anderen über die Eintrittswinkel b1, b2, unter denen die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in die Probe 104 gelenkt werden, eingestellt werden. Wie in 5 gezeigt, legen die Fokussierwinkel a1, a2 den Durchmesser w1 bzw. w2 der Strahltaille des jeweiligen Teilbeleuchtungsstrahlenbündels 118, 120 und damit dessen Schärfentiefe fest. Demgegenüber bestimmen die Eintrittswinkel b1, b2 die Ausbreitungsrichtungen, unter denen die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel 118, 120 in der Probe 104 propagieren. Damit stehen in besonders vorteilhafter Weise zwei Freiheitsgrade für die Lichtblattbeleuchtung zur Verfügung. Ein erster Freiheitsgrad ist durch die Dicke eines der Lichtblätter gegeben, die jeweils einem der Intensitätsmaxima des in 6 dargestellten Intensitätsverlaufs zugeordnet sind. In der Regel wird dies das zentrale Lichtblatt sein, das in der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 liegt. Der Grund hierfür ist in 6 veranschaulicht. Dort bezeichnet der gestrichelte Kurvenverlauf, der dem Intensitätsverlauf des Interferenzmusters IM überlagert ist, das durch die Detektionsoptik 106 erfasste Intensitätsprofil längs der optischen Achse DO. Dieses Intensitätsprofil ergibt sich dadurch, dass sich der Querschnitt der Detektions-PSF mit zunehmenden Abstand von der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 vergrößert, wodurch die durch die Detektionsoptik 106 erfasste Intensität entsprechend sinkt.
Rein beispielhaft wird ein besonders günstiges Verhältnis zwischen der Dicke des zentralen Lichtblattes und der Anzahl an zusätzlichen Lichtblättern erzielt, wenn der Durchmesser des jeweiligen Teilbeleuchtungsstrahlenbündels 118, 120 etwa 1/10 bis 1/2, insbesondere 1/8 bis 1/4 bis des Durchmessers der Objektivpille beträgt. Liegt der Strahldurchmesser in einem solchen Bereich, so wird eine optimale Bildqualität gewährleistet. So führen kleine Strahldurchmesser in der Pupille zu langen, dicken Strahlenbündeln im Probenraum. Diese Strahlenbündel können in der Probe unter einem größeren Winkel miteinander interferieren, da sie in der Pupille des Objektivs näher am Pupillenrand platziert werden können. Auf diese Weise wird ein dünneres zentrales Lichtblatt erzeugt. Der Abstand des Strahls vom Rand der Pupille sollte dabei etwas größer als der Strahlradius sein. Die Erzeugung eines besonders dünnen zentralen Lichtblattes ermöglicht eine höhere Auflösung entlang der Detektionsrichtung, insbesondere wenn durch Entfaltung eine Kontrasterhöhung und/oder eine Hintergrundunterdrückung durchgeführt wird. Andererseits führen vergleichsweise dicke Strahlenbündel aber auch zu einer größeren Anzahl an zusätzlichen Lichtblättern, die den Bildkontrast verschlechtern und eine zusätzliche Lichtbelastung der Probe verursachen. Diese Aspekte sollten demnach bei der Wahl eines geeigneten Strahldurchmessers gegeneinander abgewogen werden.
Die hier vorgestellte Lichtblattbeleuchtung kann zwar als eine Art von strukturierter Beleuchtung angesehen werden, jedoch unterscheidet sie sich grundlegend von üblichen, aus dem Stand der Technik bekannten strukturierten Beleuchtungen, die zur Auflösungs- oder Kontraststeigerung eingesetzt werden. Während nämlich die aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen darauf ausgelegt sind, die durch die Beleuchtung bewirkte Strukturierung auch abzubilden, ist es bei der hier vorgestellten Lösung nicht vorgesehen, detektionsseitig zwischen den einzelnen Beleuchtungsebenen zu diskriminieren. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, dass vorliegend das Beleuchtungslicht längs der optischen Achse DO der Detektionsoptik 106 strukturiert wird, indem die den einzelnen Intensitätsmaxima des Interferenzmusters IM zugeordneten Lichtblätter parallel zueinander gleichsam längs der vorgenannten Achse DO aufgereiht sind. Eine Diskriminierung hinsichtlich der abgebildeten Beleuchtungsebene erfolgt allein in Wechselwirkung mit der Detektions-PSF dergestalt, dass die in der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 liegende Beleuchtungsebene scharf abgebildet wird, während die zu beiden Seiten dieser Ebene aufgereihten Beleuchtungsebenen entsprechend dem größer werdenden Querschnitt der Detektions-PSF mit zunehmendem Abstand von der Fokusebene FD mit höherer Unschärfe abgebildet werden.
Die variable Dimensionierung des Interferenzmusters IM wird vorzugsweise so gewählt, dass zum einen eine gewünschte Bildfeldgröße erzielt werden kann und zum anderen die Zahl an zusätzlichen Lichtblättern, die sich längs der Detektionsachse DO auf beiden Seiten des in der Fokusebene FD liegenden zentralen Lichtblattes aneinanderreihen, nicht zu groß wird. Denn diese zusätzlichen Lichtblätter generieren Bildinformation, die aus Probenbereichen außerhalb der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 stammt und somit in der Regel unerwünscht ist. In diesem Zusammenhang ist noch darauf hinzuweisen, dass die Zahl der an sich unerwünschten zusätzlichen Lichtblätter näherungsweise linear mit der Bildfeldgröße zunimmt. Dies liegt daran, dass das Interferenzmuster IM, wie in den 4 und 5 veranschaulicht, näherungsweise die Form einer Raute hat und die (in den 4 und 5 vertikale) Breite dieser Raute, welche die Gesamtzahl an generierten Lichtblättern bestimmt, näherungsweise linear mit der (in den 4 und 5 horizontalen) Länge der Raute korreliert, welche die Größe des Bildfeldes bestimmt. Somit bietet die erfindungsgemäße Lösung die Möglichkeit, eine signifikante Vergrößerung des Bildfeldes zu erzielen, ohne dabei eine übermäßig große Anzahl zusätzlicher Lichtblätter zu generieren.
Unerwünschte Effekte auf die Abbildungsqualität, die durch die Generierung zusätzlicher Lichtblätter außerhalb der Fokusebene FD der Detektionsoptik 106 verursacht werden, lassen sich durch geeignete Maßnahmen zur Bildnachverarbeitung weitgehend vermeiden. Ein erster Ansatz hierfür besteht in der Anwendung von Entfaltungsalgorithmen, die unter Zuhilfenahme einer effektiven Punktspreizfunktion, welche sowohl die Beleuchtung als auch die Detektion berücksichtigt, die unerwünschte Bildinformation beseitigt. Dabei wird aus der erfassten 3D-Bildinformation in einem interaktiven Prozess auf die wahrscheinlichste Verteilung der Quellen zurückgeschlossen, welche die erfasste Bildinformation bewirken könnte. Eine solche Nachverarbeitung hat insbesondere den Vorteil, dass sie intensitätserhaltend ist, d.h. die erfasste Lichtintensität nur umverteilt, nicht jedoch verwirft. Alternativ können auch Algorithmen zur Hintergrundreduktion eingesetzt werden.
Bezugszeichenliste

100: Mikroskop
102: Beleuchtungsanordnung
104: Probe
106: Detektionsoptik
108: Beleuchtungseingang
110: Lichtquelle
112: Beleuchtungsstrahlenbündel
114: Baugruppe
116: Mittel zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels
118, 120: Teilbeleuchtungsstrahlenbündel
122, 124: planparallele Platten
126, 128: Drehachsen
130: Vorderseite
132: Rückseite
134: Vorderseite
136: teilverspiegelter Bereich
138: Rückseite
140: vollverspiegelter Bereich
142: nichtverspiegelter Bereich
144: Beleuchtungsobjektiv
145: Beleuchtungsausgang
146: Bauelement
148: Spaltblende
150: Strahlteiler
152: Spiegel
BO: optische Achse der Beleuchtungsanordnung
DO: optische Achse der Detektionsoptik
BR: Beleuchtungsrichtung
DR: Detektionsrichtung
FB1: lichtquellenseitige Brennebene der Beleuchtungsanordnung
FB2: objektseitige Brennebene der Beleuchtungsanordnung
FD: Fokusebene der Detektionsoptik
f: Brennweite der Detektionsoptik
IM: Interferenzmuster

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102007063274 A1 [0004]
WO 2017/220699 A1 [0005]

Claims

Beleuchtungsanordnung (102) für ein Mikroskop (100), insbesondere ein Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder ein Schiefeebenemikroskop, wie ein OPM- oder SCAPE-Mikroskop, zur Beleuchtung einer Probe (104), wobei die Beleuchtungsanordnung (102) einen Beleuchtungseingang (108) zur Einspeisung eines Beleuchtungsstrahlenbündels (112) einer kohärenten Lichtquelle (110) entlang einer optischen Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102), ein Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) in mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120), ein fokussierendes optisches System (144) zur Fokussierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) und einen einer Probenseite zugewandten Beleuchtungsausgang (145) zur Ausgabe der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) zur Probenseite, aufweist, wobei das fokussierende optische System (144) die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) fokussiert und in einem Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang (145) so zur Überlagerung bringt, dass diese ein Interferenzmuster (IM) ausbilden.
Beleuchtungsanordnung (102) nach Anspruch 1, bei der das fokussierende optische System (144) die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) derart fokussiert und in Überlagerung bringt, dass das Interferenzmuster (IM) ein Intensitätsmaximum auf der optischen Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102) aufweist.
Beleuchtungsanordnung (102) nach Anspruch 1 oder 2, bei der das fokussierende optische System (144) die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) derart fokussiert, dass die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) in dem genannten Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang (145) die optische Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102) schneiden.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das fokussierende optische System (144) die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) derart fokussiert, dass das Strahlprofil jedes fokussierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündels (118, 120) in dem genannten Bereich am probenseitigen Beleuchtungsausgang (145) eine Strahltaille aufweist.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein Mittel (116) zur Positionierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) in einer lichtquellenseitigen Brennebene (FB1) der Beleuchtungsanordnung (102).
Beleuchtungsanordnung (102) nach Anspruch 5, bei der das Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) und das Mittel (116) zur Positionierung der beiden Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) durch ein einziges Mittel gebildet sind.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein Mittel (114) zum Einstellen des Strahldurchmessers des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) oder des jeweiligen Teilbeleuchtungsstrahlenbündels (118, 120).
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) zwischen dem Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) und dem fokussierenden optischen System (144) im Wesentlichen parallel zueinander verlaufen.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems (144) parallel zur optischen Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102) verlaufen.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) vor Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems (114) im Wesentlichen kollimiert sind.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) jeweils mit einem Versatz quer zur optischen Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102) außermittig in das fokussierende optische System (144) eintreten.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) mindestens einen Strahlteiler (150) und/oder mindestens einen Glasblock und/oder mindestens eine planparallele Platte (122, 124) beinhaltet.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels mindestens zwei drehbare Strahlteiler (122, 124) beinhaltet.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112) mindestens einen beweglichen Strahlteiler (150) und mindestens einen beweglichen Spiegel (152) beinhaltet.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Beleuchtungsanordnung eine Scananordnung (146) umfasst, durch die das Interferenzmuster (IM) in einer Ebene bewegt werden kann.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Beleuchtungsanordnung (102) mindestens eine Zylinderlinse (146) umfasst, durch die das Beleuchtungsstrahlenbündel (112) oder die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) vor oder beim Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems (144) in einer Richtung fokussiert werden.
Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Beleuchtungsanordnung (102) mindestens eine Spaltblende (148) umfasst, durch die das Beleuchtungsstrahlenbündel (112) oder die Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) vor oder beim Durchlaufen des fokussierenden optischen Systems (144) in mindestens einer Richtung begrenzt werden.
Verfahren zur Beleuchtung einer Probe (104), vorzugsweise unter Verwendung einer Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: - Einspeisen eines kohärenten Beleuchtungsstrahlenbündels (112) in einen Beleuchtungseingang (108) der Beleuchtungsanordnung (102), - Erzeugen mindestens zweier Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) mit einem Mittel (116) zur Aufteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (112), - Fokussierung der mindestens zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) mittels eines fokussierenden optischen Systems (144), - Überlagerung der beiden fokussierten Teilbeleuchtungsstrahlenbündel (118, 120) unter Ausbildung eines Interferenzmusters (IM) in einem Bereich, der sich mit der Probe (104) überlappt oder diese umschließt.
Mikroskop (100), insbesondere Lichtblatt- oder SPIM-Mikroskop oder Schiefeebenemikroskop, wie OPM- oder SCAPE-Mikroskop, umfassend eine Beleuchtungsanordnung (102) nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
Mikroskop (100) nach Anspruch 19, umfassend eine Detektionsoptik (106), deren optische Achse (DO) zumindest näherungsweise senkrecht zur optischen Achse (BO) der Beleuchtungsanordnung (102) liegt.
Mikroskop (100) nach Anspruch 20, bei dem die Beleuchtungsanordnung (102) ausgebildet ist, durch das Interferenzmuster (IM) eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung aus mehreren parallel zueinander angeordneten Lichtblättern zu generieren, die aus Intensitätsmaxima des Interferenzmusters (IM) gebildet sind und zumindest näherungsweise senkrecht zur optischen Achse (DO) der Detektionsoptik (106) liegen.
Mikroskop (100) nach Anspruch 21, umfassend ein Mittel (116) zum Positionieren des Interferenzmusters (IM) relativ zu einer Fokusebene (FD) der Detektionsoptik (106) derart, dass eines der Intensitätsmaxima des Interferenzmusters (M) in der Fokusebene (FD) liegt.
Mikroskop (100) nach einem der Ansprüche 17 bis 22, umfassend ein Mittel (116) zum Anpassen der Periode des Interferenzmusters (IM) an die Schärfentiefe der Detektionsoptik (106).