DE2243385A1

DE2243385A1 - Auflichtfluoreszenz-mikroskop

Info

Publication number: DE2243385A1
Application number: DE2243385A
Authority: DE
Inventors: Toshifumi Uetake
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1972-07-23
Filing date: 1972-09-04
Publication date: 1974-02-14
Also published as: DE2243385B2; DE7232618U; US3973827A; JPS4933643A; JPS523585B2

Description

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Tel, 22 45f'S

Olympus Optical Co., Limited oot 7247

Tokyo/JAPM · 4. September 1972

L/Br

Auflichtfluoreszenz-Mikroskop

auf
Die Erfindung "bezieht sich Fluoreszenzmikroskope, insbesondere auf Auflichtfluoreszenz-Mikroskope.

Die bekannten Auflichtfluoreszenz-Mikroskope sind, wie in 3?ig.1 gezeigt, so ausgebildet, daß die Lichtstrahlen 1, die von einer Lichtquelle ( nicht dargestellt ) kommen, die eine Quecksilberlampe oder dergleichen sein kann, durch ein Einlaßfilter#£( welches nur Lichtstrahlen einer gewünschten spezifirschen Wellenlänge durchläßt ) hindurchtreten und diese gefilterten Lichtstrahlen werdenden an einem dichroitischen Spiegel 3 so reflektiert, daß sie durch ein Objektiv 5 auf ein Objekt gelangen, welches fluoreszierend gemacht worden ist. Dieses Objekt 6 absorbiert die Lichtstrahlen mit der spezifischen Wellenlänge, welche auf das Objekt auftreffen und emitiert Licht- oder IFluoreszenzstrahlung. Diese Fluoresaenzstrahlung wird durch das Objektiv 5 den,dichroitischen Spiegel 3 und

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einen Grenzfilter 6 hindurchgelassen, um dann durch ein oder 2wei Okulare betrachtet zu werden." Normalerweise wird das zu untersuchende Objekt zuvor mit einer Fluoreszenzfarbe gefärbt. Als eine solche Farbe, d.h. Farbstoff für die Fluoreszenz-Antikörpertechnik wird beispielsweise F.I.T.C. (Fluoreszein Isothiocyanat) häufig verwendet. Daher sollen zunächst die Fälle beschrieben werden, in denen dieser Farbstoff zum Ärben des Objektes verwendet wird. Dieses F.I.T.C. besitzt eine maximale Absorption bei der Wellenlänge 490 m/i und e&itiert eine maximale Fluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge von 520 mn , welche nahe dabei liegt. Demgemäß ist es wünschenswert, einen dichroitisehen Spiegel zu verwenden,

_tw%e moglicbJ der so viel Licht der Wellenlänge von 490 nuUJr"eflektiert und der so viel Licht der Wellenlänge von 520 m^wie möglich durchläßt. Normalerweise wird ein Mehrschichtinterferenzfilter verwendet, welches eine maximale Durchlässigkeit für die Wellen», länge 520 m/i besitzt und eine solche spektrale,Eigenschaft, daß es diejenige Strahlung, die kleinere Wellenlängen besitzt, eliminiert. Da jedoch bei den bekannten Auflichtfluoreszenz-Mikroskopen mit einem optischen System, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, der Lichtfluß auf den dichroitischen Spiegel 3 unter einem Auftreffwinkel von 45° auftreffen gelassen wird, ergibt sich in Verbindung mit den optischen Eigenschaften eines solchen Mehrschichtinterferenzfilter, wie die Kurve 4. in Fig. 2 zeigt, daß die maximale Durchlässigkeit im Verhältnis

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zum vertikalen Auftreffen langsam abnimmt, so daß die Durchlässigkeit einen stetigen Abfall .zu den kürzeren Wellenlängen hin besitzt. Mit anderen Worten können,wie auch die Kurve a in Fig. 2 zeigt, mehr als 50% der Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge von 490 im. (welche gleich der Wellenlänge ist,an der F.I.T.C. maximale Absorption besitzt) durch den dichroitischen Spiegel hindurchtreten, so daß die Menge des reflektierten Lichtes entsprechend kleiner ist. Mit anderen Worten tritt ein wesentlicher Verlust an Licht auf, welches das fluoreszierende Objekt beleuchtet. Auch wenn das Objekt einen großen Reflektionsfaktor besitzt, werden mehr als 50% des vom fluoreszierenden Objekt reflektierten Lichtes durch den dichroitischen Spiegel hindurchgelassen. Derartiges Licht, welches durch diesen Spiegel hindurchtritt, versursacht das Entstehen von Wolken und dies hat den Nachteil, daß das erscheinende Bild dunkel und verschwommen ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Auflichtfluoreszenz-Mikroskop anzugeben, welches ein helles wolkenfreies und klares Bild liefert.

Die^s wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß der diehroitische Spiegel als Konkavspiegel ausgebildet ist und daß zwischen diesem und dem Einlaßfilter ein erster kleiner Reflexionsspiegel nahe der optischen Achse des Mikroskops angeordnet ist.

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BAD ORiQiNAL

Vorteilhaft ist dabei die Anordnung so getroffen, daß der Strom des beleuchteten Lichtes auf den konkaven dichroitischen Spiegel unter einem kleinstmöglichen Auftreffwinkel auftrifft.

Der kleine Reflexionsspiegel wird vorzugsweise an der Lichtquellenseite des konkaven dichroitischen Spiegels möglichst nahe an der optischen Achse des optischen Systems des Mikroskops angebracht. Weiterhin wird vorteilhaft eine Hilfslinse verwendet, die den Beleuchtungslichtstrom in der Nähe des kleinen Heflektionsspiegels fokussiert. Anstelle der Hilfslinse kann auch ein lonkavspiegel verwendet werden. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Grenzfilter so angeordnet, daß es eine Neigung zur optischen Achse des Mikroskops besitzt.

Das zu untersuchende Objekt wird vorteilhaft mit einer Fluoreszenzfarbe gefärbt, die ein grünes Licht als Erregungsstrahlung verwendet, in Verbindung mit einem dichroitischen Spiegel, der als Mehrschichtiniefferenzfilter ausgebildet ist und diejenigen Lichtstrahlen abschneidet, die auf der kurzwelligen SeJbe liegen

solche

und der eine Spektralcharakteristik besitzt, daß die Wellenlänge der Lichtstrahlen, die durchgelassen werden, bei einem Durchlaßfaktor von 50% 605 m« + 5 &M oder 590 mü + 5 m.u beträgt. Es kann auch eine für blaues Licht als Erregungsgtrahlung vor-

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gesehene Fluoreszenzfarbe in Verbindung mit einem als MehrschichtinHfferenzfilter ausgebildeten diehroitisehen Spiegel verwendet werden, der die auf der kurzwelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge., die mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassen wird, 505 ^myW ± 5 *®-ίλbeträgt.,

Ferner kann auch eine für violettes Licht als Erregungsstrahlung geeignete Fluoreszenzfarbe in Verbindung mit einem dichroitisehen Spiegel verwendet werden, der als Mehrschichtinterferenzfilter die auf der kurzwelligen Seite gelegene Lichtstrahlung abschneidet und der eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung bei 4-73 τ&μ ± 5 mj,t liegt.

Schließlich kann eine ultraviolettes Licht als Erregungsstrahlung aufnehmende Fluoreszenzfarbe in Verbindung mit einem

eJs

dichroitischen Spiegel verwendet werden, der Mehrschichtinterferenzfilter die Lichtstrahlung abschneidet, die auf der kurzwelligen Seite liegt und der eine solche Spektralcharakteristik besitzt, daß die Wellenlänge bei der Lichtstrahlung mit ^ einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassen wird, 4-10 m/Λ+ beträgt. , . . . -

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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen ist

Fig. 1 die schematische Ansicht des optischen Systems eines bekannten Auflichtfluoreszenz-Mikroskops

Fig. 2 ein Diagramm, das die spektralen Durchlaßfaktoren dichoritischer Spiegel, wie sie in Auflichtfluoreszenz-Hikroskopen verwendet werden, zeigt

Fig. 3 schematische Darstellungen des optischen Systems von

Fig. 4 Auflichtfluoreszenz-Mikroskopen nach der vorliegenden Erfindung und

Fig. 5 Darstellungen verschiedener konkaver dichroitischer A,B u.

C Spiegel, wie sie bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

In dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungsbeispiel durchläuft die von einer Lichtquelle kommende Lichtstrahlung 1 einen Eingangefilter 2, wird von einem zweiten Reflexionsspiegel 9 reflektiert und von der Hilfslinse 10 in die Nähe des ersten kleinen Beflektionsspiegels 8 reflektiert. Die von dem ersten kleinen. Reflexionsspiegel 8 reflektierte Strahlung wird weiter vn dem konkaven dichrojbischen Spiegel 3a aufgenommen und reflektiert und als vergrößertes Bild zum Funkt 4 der Austritts-

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pupille des Objektivs oder zum rückwärtigen Brennpunkt der ' , Objektivlinse fokussiert, wodurch eine perfekte Köhlerbeleuchtung mit der Objektivlinse erreicht wird. Zu diesem Zweck ist der konkave dichroitische Spiegel mit einer leichten Neigung relativ zur optischen Achse des Mikroskops angeordnet. Die aus dieser Anordnung resultierende Blugung der optischen Achse kann durch Anordnung des Grenzfilters 7 mit; einer Neigung relativ zur optischen Achse korriegiert werden. Es sei darauf hingewiesen, daß bei diesem Ausführungsbeispiel der erste kleine Reflektionsspiegel 8 an der Lichtquellenseite des konkaven dichroitischen Spiegels 3a einen wirksamen Durchmesser hat, der kleiner sein kann als der des dichroitischen Spiegels 3a. Daher kann der erste kleine Reflektionsspiegel 8 in der Nachbarschaft der optischen Achse des optischen Systems des Mikroskops angeordnet werden. Dadurch kann der Auftreffwinkel des Beleuchtungslicht Stroms auf den"

3a
konkaven dichroitischen Spiegel außerordentlich klein gehalten werden. Bei einem tatsächlichen Ausführungsbeispiel war es möglich, den Beleuchtungslichtstrom auf den konkaven dichroitischen

3a
Spiegel unter einem Auftreffwinkel von ungefähr 6 auftreffen zu lassen. - Selbstverständlich kann auch der zweite Reflektionsspiegel 9 ein Konkavspiegel sein, wie in einem weiteren Ausführungsbeispiel später beschrieben wird. Es sei jedoch erwähnt, daß, wenn kein zweiter Reflektionsspiegel 9 verwendet wird, die Lichtquelle schräg angeordnet werden muß. Daher wird es

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aus verschiedenen Gründen, wie der Lebensdauer der Lichtquelle, bevorzugt, daß ein solcher zweiter Reflektionsspiegel 9 verwendet wird. Auch bei diesem Ausführungsbeispiel ist schon aus der Zeichnung ersichtlich, daß der erste kleine Reflexionsspiegel 8 als Spiegelfläche auf der planen Seite einer plankonvexen Linse ausgebildet ist und eo angeordnet ist, daß deren konvexe Seite nach oben gerichtet ist. Selbstverständlich kann eine genau gleiche Funktion, wie bei dieser Anordnung, beider folgenden Anordnung erreicht werden, bei der eine Spiegelfläche an der konkaven Seite einer plankonkaven Linse angeordnet ist, wobei die konkave Fläche nach oben gerichtet ist. Erwähnt sei, daß es zwar möglich ist, den ersten kleinen Reflektionsspiegel 8 in Form eines Planspiegels auszubilden, daß aber die Ausbildung als plankonvexe Linse, wie sie in Fig. 3 gezeigt ist, aus dem folgenden Grunde vorteilhaft ist. Dadurch, daß der konkave. dichroitische Spiegel 3a eine leichte Krümmung hat, trägt ein Teil seiner Konvergenz dazu bei, daß Lichtstrahlen, die von dem ersten kleinen Reflektionsspiegel 8 ausgehen,

»verringert^ den schädlichen Effekt auf das BildYder durch die Neigung dieses dichroitischen Spiegels 3a relativ zur optischen Achse des Mikroskops bedingt iet₄

Die Kurve b in Fig. 2 zeigt die Spektraldurchlassigkeit, in dem Fall, in dem die Lichtstrahlen auf den dichroitischen Spiegel unter einem Auftreffwinkel von 6° auftreffen. Wie man aus dieser Kruve b entnehmen kann, ist die .spektrale Durchlässigkeit im

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wesentlichen die gleiche wie bei vertikalem Auftreffen. Insbesondere ergibt sich eine extrem kleine Durchlässigkeit bei der Wellenlänge 4-90 m/Λ , während eine extrem große Durchlässigkeit bei 520 mM beobachtet wird. Daher werden bei Anwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Auflichtfluoreszenz-Mikroskop die Lichtstrahlen so geführt, daß sie auf den dichroitisehen Spiegel mit einem Einfallswinkel von ungefähr 6° auftreffen, so daß ein helles, wolkenfreies und klares Bild beobachtet werden kann durch das Okular 13 mit der Austrittspupille 14. Das Okular 13 ist geneigt zur optischen Achse 17 cLes Auflichtfluoreszenz-Mikroskops angeordnet und daher ist im Gehäuseteil 16 mit dem geneigten Tubus für das Okular ein Prisma 15 angeordnet. Ar? den Tubusabschnitt 12 für Lichtprojektion des Mikroskopgehäuses schließt sich nach unten der Objektivteil mit dem auf einem Revolver 11 angeordneten Objektiv 5 an.

In Fig. 4 ist ein anderes Ausführungsbeispiel der Erfindung dargestellt. Wie sich aus dieser Fig. ergibt, sind sowohl die . Lichtquelle als auch das Einlaßfilter 2 in bezug auf die optische Achse des Mikroskops gegenüber dem ersten kleinen Reflektionsspiegel 8 und dem zweiten Reflektions spiegel 9 angeordnet. Auch der zweite Reflexionsspiegel 9 ist in der Form eines konkaven Spiegels ausgebildet, um in gleicher Weise wie die bei dem ersten Ausführungsbeispiel von Fig. 3 verwendete Hilfslinse 10 zu wirken. Selbstverständlich kann die vorliegende Erfindung

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sowohl in dem Fall verwirklicht werden, wenn bei dem ersten Ausführungsbeispiel keine Hilfslinse 10 verwendet wird, als auch in dem Fall, wenn im zweiten Ausführungsbeispiel der zweite Reflexionsspiegel als Planspiegel ausgebildet ist. Die in den Zeichnungen dargestellte Ausführung wird Jedoch bevorzugt, weil sie einen besseren Effekt liefert.

Weiterhin ist zu beachten, daß bei einem Fluoreszenzfarbstoff, wie F.I.T.C, der blaues Licht als Erregungsstrahlung verwendet (andere Farbstoffe ähnlicher Natur, wie F.I.T.C. enthalten Quinacrin Mustard, Fluorszenznatrium usw.),wie die Kurve b in Fig. 2 zeigt, die Verwendung eines dichroitisehen Spiegels optimal ist, der als Mehrschichtinterferenzfilter ausgebildet ist, welches diejenigen Lichtstrahlen abschneidet, die an der kurzwelligen Seite liegen und der eine Spektralcharakteristik hat, bei der die Wellenlänge der durchgelassenen Lichtstrahlung mit dem Dürchlaßfaktor 50% bei 505 na liegt. Für ein mit Tetraäthylrhodaminmischung, Tetraäthylrhodaminisothiocynat usw., d.h. mit FluoresÄenzfarben, die grünes Licht als Erregungsstrahlung verwenden, gefärbtes Objekt ist die Verwendung eines dichroitisehen Spiegels optimal, der aus einem Mehrschichtinterferenzfilter besteht, welches diejenige Wellenstrahlung abschneidet, die an der kurzwelligen Seite liegt und der eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit einem Durchlaufaktox von 50% durchgelassenen Strahlung

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605 m/4 oder 590 mM.beträgt. Für ein Objekt, das mit Serotonin oder einem anderen fluoreszierenden Farbstoff, der violettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet, gefärbt ist, ist die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal,der aus einem Mehrschichtinterferenzfilter besteht, welches die auf der kurzwelligen Seite liegende Strahlung wegschneidet und eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 4-73 mu beträgt. Schließlich ist für ein mit Oatecholamin oder der gleichen fluoreszierenden Farbstoff,der ultraviolettes licht als Erregungsstrahlung verwendet, die Verwendung eines dichroitischen Spiegels optimal, der aus einem Mehrschichtinterferenzfilter besteht, welches die an der kurzwelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und , eine Spektralcharakteristik besitzt, bei welcher die mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassene Strahlung bei 4-10 m/.< liegt.

In Fig. 3 und 4 sind konkave dichroitische Spiegel dargestellt, die eine Anordnung eines dichroitischen Spiegels darstellen, der an der Verbindungsfläche zwischen einer plankonkaven Linse und einer plankonvexen Linse angeordnet ist. In anderer Ausführung kann der dichroitische Spiegel Von der konkaven Fläche einer plankonkaven Linse, deu«.konkave Fläche nach unten gerichtet ist, gebildet werden, wie der Spiegel 3b in Fig. 5/i zeigt. Ferner kann der konkave dichroitische Spiegel auf der konvexen

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Fläche einer plankonvexen Linse angeordnet werden, deren plane Fläche nach unten gerichtet ist, wie der Spiegel 3c in Fig. 5B· Schließlich kann der konkave dichroitische Spiegel auf der konkaven Seite einer konkav-konkvexen Linse angeordnet werden, deren konkave Seite nach unten gerichtet ist, wie der Spiegel 3d in Fig. J?C zeigt. Die Anordnung der Lichtquelle, des Einlaßfilters 2, des konkaven dichroitischen Spiegels 3a» des ersten kleinen Reflektionsspiegels 8, des zweiten Reflektionsspiegels 9, des Grenzfilters 6 usw. kann geändert werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu überschreiten.

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Claims

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Pat ent ansprüc'he

1J Auflichtfluoreszenz-Mikroskop mit einem Einlaßfilter, einem dichroitischen Spiegel, einem Objektiv, einem fluoreszierenden Objekt, einem G-renzfilter und einem Okular, dadurch gekennzeichnet , daß der dichroitische Spiegel (5a) als Konkavspiegel ausgebiüet ist und daß zwischen diesem und dem Einlaßfilter (2) ein erster kleiner Reflektionsspiegel (8) nahe der optischen Achse des Mikroskops angeordnet ist.

2. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1,. dadurch gekennzeichnet, daß ein vergrößertes Bild der Xdchtquelle nahe der Austrittspupille oder des hinteren Brennpunktes (4) des Objektivs (5) mittels des konkaven dichroitischen Spiegels (3a) fokussiert wird.

3. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

da)

zeichnet, daß der erste kleine Eeflektionsspiegel als Spiegel« fläche auf der planen Seite einer plan^^konvexes, Mase, deren konvexe !lache nach oben gerichtet isi;, ausgebildet ist»·

4. Auflichtfluoreszenz-Mikrospkop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste kleine Reflexionsspiegel (8) als Spiegelfläche auf der konkaven Seite einer plankonkaven Linse ausgebildet ist, deren konkave Fläche nah oben gerichtet ist.

5. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Reflexionsspiegel (9) zwischen dem Einlaßfilter (2) und dem ersten kleinen Eeflektionsspiegel (8) vorgesehen ist.

6. Auflichtfluor__eszenz-Mikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Reflexionsspiegel (9a) als ein Konkavspiegel ausgebildet ist.

7. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hilfslinse (10) als konvergierendes Element zwischen dem Einlaßfilter (2) und dem ersten kleinen Reflexionsspiegel (8) vorgesehen ist.

8. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Grenzfilter (7) relativ zur optischen Achse (17) des Mikroskops geneigt ist.

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9. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Fluoreszenz anzuregende Objekt (6) mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der grünes Licht als Erregungsstrahlung verwendet, gefärbt ist'und daß der konkave dichroitische Spiegel (3a) zu diesem Zweck als ein Mehrschichtinterferenzfilter ausgebildet ist, welches die Lichtstrahlung wegschneidet, die an der kurzwelligen Seite liegt und welches eine derartige Spektralcharakteristik besitzt, dajS die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 605 mμ + 5 mK oder 590 iw+ 5 mubeträgt.

10. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zu Fluoreszenz anzuregende Objekt mit einer Fluoreszenzfarbe gefärbt ist, die blaues Licht, als Erregungsstrahlung verwendet und daß der konkave dichroitische Spiegel (3a) als ein Mehrschichtinterferenzfxlter ausgebildet ist, welches die an der kurzwelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und welches eine derartige Spektralcharakteristik besitzt, daß die Wellenlänge der Strahlung,die mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassen wird, 505 ^fA + 5 m ^beträgt.

11. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8,

dadurch gekennzeichnet, daß das zu Fluoreszenz anzuregende

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Objekt mit einem Flureszenz-Farbstoff, der violettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet, gefärbt ist und daß der konkave

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dichroitische Spiegel (3a) als Mehrschichtinterferenzfilter ausgebildet ist, welches die auf der kurzwelligen Seite liegende Lichtstrahlung abschneidet und welches eine solche Spektralcharakteristik besitzt, daß die Wellenlänge der mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Strahlung 4-73 ^JU + 5 mM beträgt.

12. Auflichtfluoreszenz-Hikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

(6) zeichnet, daß das zu Fluoreszenz anzuregende Objekt mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der ultraviolettes Licht als Erregungsstrahlung verwendet, gefärbt ist und daß der konkave di-

(3a)

chroitische Spiegel als ein Mehrschic.htinterferenzfilter ausgebildet ist, welches die an der kurzwelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und welches eine derartige Spektralcharakteristik besitzt, daß die Wellenlänge des mit einem Durchlaßfaktor von 50% durchgelassenen Lichtes bei 410 m/4+ 5 liegt.

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