DE2228150A1 - Peptide und Verfahren zu ihrer Her stellung - Google Patents

Description

CIBA-GEIGY AG, BASEL (SCHWEIZ)

Case 4-7560 +
DEUTSCHLAND

Neue Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide mit

erhöhter und verlängerter adrenocorticotroper Aktivität, welche l8 - 39 Aminosäuren vom N-Terminus der natürlichen Corticotropine aufweisen, in denen jedoch die erste Aminosäure, Serin, durch D-oc-Phenylglycin (abgekürzt D-a-Phg) und die Aminosäuren in 17- und l8-Stellung durch L-Lysin oder L-Ornithin ersetzt sind, ferner Analoge dieser Peptide, die statt des Serinrestes in 3~ßfcellung den Rest des Glycins und/oder statt des Methionin-

2 0 9 8 5 2/1171

restes in 4-Stellung einen L-a-Niederalkyl-a-aminoacetylrest wie den Rest des L-Norleucins, L-Norvalins, L-Leucins, L-Valins oder der α-Aminobuttersäure und/oder statt des Glutaminsäurerestes in 5-Stellung den Rest des Glutamins und/oder statt des Restes in 25-Stellung den Rest des L-Valins enthalten, sowie C-terminale Amide dieser Peptide, und Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen. Es wurde gefunden, dass die neuen Peptide eine stärkere und längere adrenocorticotrope Wirkung als die bekannten ACTH-wirksamen Peptide aufweisen. Besonders hervorzuheben sind die Peptide und N-terminalen Peptidamide mit 18 - 25 Aminosäuren, vor allem das D-a-Phg -Lys ^[l -ß -Corticotropin-Lys -amid und- das D-a-Phg -Lys '' -ß -Corticotropin und dessen C-terminales Amid.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von

therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwer lösliche Salze wie Sulfate, Phosphate, Sulfonate oder höhere Alkanoate wie z.B. Stearate zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen, und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt

2 0 9 8 5 2/1171

und insbesondere von Zink, ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B. "Calgon N", "Calgon 322", "Calgon 188" oder "Polyron B 12". Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin^ Polyglutaminsäure oder Polyasparaginsäure.

Die neuen Verbindungen zeigen eine hohe und

langandauernde adrenocorticotrope Wirkung, z.B.- im Test nach Desaulles and Rittel (Memoirs of the Soc. for Endocrinology I968 No. 17, S. 124 - 137), worin die Corticosteronausscheidung aus den Nebennieren hypophyektomierter Ratten nach subcutaner Injektion des Peptids gemessen wird. Die neuen Verbindungen können daher als Heilmittel an Stelle der natürlichen Corticotropine verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man aus geschützten Peptiden und Peptidamiden,'welche 18 - 39 Aminosäuren

20 9852/1171

vom N-Terminus der natürlichen Corticotropine aufweisen, in denen jedoch die erste Aminosäure durch D-a-Phenylglycin und die Aminosäuren in I7- und l8-Stellung durch L-Lysin oder L-Ornithin ersetzt sind oder Analogen dieser Verbindungen, in welchen eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 3 - 5 und 25 durch andere α-Aminosäuren ersetzt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze öder Komplexe überführt.

Als Schutzgruppe für die Ausgangsstoffe und für

die bei der Synthese der Ausgangsstoffe erforderlichen Zwischenprodukte verwendet man die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen, insbesondere diejenigen, die für die Synthese von ACTH-Sequenzen bekannt sind, vor allem solche, die mittels starken anorganischen oder organischen Säuren, z.B. Halogenwasserstoff säuren wie Salzsäure, Fluorwasserstoff, oder Trifluoressigsäure abgespalten werden können. Als Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise zu nennen gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen wie Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppen, oder Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, oder vor allem von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogen-

209852/1171

atome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxyearbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und vor allem 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl, ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z.B. Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthyloxycarbonyl, 2-Jodäthoxyearbonyl, und in erster Linie tert. Butyloxycarbonyl.

Die Carboxylgruppen werden beispielsweise durch

Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Zur Veresterung geeignet sind z.B, niedere gegebenenfalls substituiertc Alkanole wie Methanol, Aethanol, Cyamnethylalkohol oder insbesondere tert. -Butanol,, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls substituierte Benzylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, Phenole und Thiophenole wie p-Nitrothiophenolj 2_J ⁱl_J5-Trichlorphenol, p-Cyanphenol, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B.

N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.

2 0 9 8 5 ?/1171

Die Hydroxygruppen der Seitenketten, z.B. der Serin- und/oder Tyrosinreste können z.B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit terfc.-Butanol geschützt werden, sie brauchen aber nicht notwendig

geschützt zu werden. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogruppierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe. und die Tosylgruppe zur Anwendung, doch braucht die Guanidinogruppe nicht geschützt zu werden. Ebenso braucht die Iminogruppe des Histidins nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, die zu schützen, z.B. durch Benzyl, Trityl, Aciamantyloxycarbonyl oder die in Ber. 100 (I967), 3838 -38^9 beschriebenen 2,2,2~Trifluor~l-tert.-butyloxycarbonylaminoäthyloder-l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt in bekannter Weise

durch Hydrogenolyse oder Hydrolyse, vor allem saure Hydrolyse, in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen.

Vorzugsweise verwendet man ein Ausgangspeptid, in dem die Aminogruppen der Seitenketten durch die tert. Butyloxycarbonylgruppe und die Carboxylgruppen der Seitenkette und der C-terminalen Säure, sofern sie nicht amidiert

20985?/117 1

sind, durch die tert.Butylestergruppe geschützt sind. Diese Schutzgruppen werden zweckmässig mittels Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Fluorwasserstoff abgespalten.

Zwecks Herstellung der Ausgangspeptide werden die Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung klei-nerer Peptideinheiten verknüpft. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der V/eise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter ct-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier Ct-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer

Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter oc-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch üeberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, - isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, 2,ⁱr,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinollnester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von

209852/1171

N-Hydroxysuccinimid oder unsubstituiertem oder z.B. Halogen-, ,Methyl- oder Methoxy-substituiertem 1-Hydroxy-benzotriazol) oder NjN'-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem

Phosphitamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden

sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode,, ferner die Merrifield-Methode.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionolle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, wie oben erwähnt» . . "

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus dem SaI-zen können in an sich bekannter V/eise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer SaI- ze geeignet.sind. Salze gewinnen, wie z.B. solche mit "anor-

209857/1 171

ganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispiels- ' weise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phophorsäure, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztrauben-

m * ν

säure,· Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, · Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure., Hydroxymäleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, ^-Arninosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Tol'uolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem z.B. für die intravenöse, intramuskuläre, subcutane oder intranasale Application geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie . z.B. Gelatine, Milchzucker, Glucose, Stärke, Cellulose,

20985?/.1171

z.B. "Avicel" (mikrokristalline Cellulose) und Cellulosederivate wie Carboxymethylcellulose, Methyl- oder Aethylcelluloso, Talkj Magnesiiunstearat, Gummi, Polyalkyleri-glycole, V/asser, ein- oder mehrwertige Alkohole wie Aethanol, Isopropanol, Glycerin, Hexite, pflanzliche OeIe und andere Fettsäureester wie Arachidö'l, Baumwollsaatöl, Mandelöl, Olivenöl, Ricinusöl, Aethyloleat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, "Cetiol V" (Oels-äureester flüssiger Fettalkohole), "Miglyol" der "Labrafac" (Triglyceridgemisch von Fettsäuren mit 8-12 Kohlenstoffatomen), "Labrafil M 2735" oder "Labrafac WL 1219" (Mischungen von Glycerin und Polyoxyäthylenfettsäuroestern), "Arlacel" (Sorbitanfettsäureester), "Tween" (Polyoxyäthylen-Eorbitan-monooleat) oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Tabletten. Dragees oder Kapseln oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Metz- oder Emulgiermittel. Sie "können auch noch andere therapeutisch 'wertvolle Stoffe enthalten.

20985?//! 171

Für therapeutische' Zwecke wendet man 0,01 bis .3 mg des Peptids in Lösung oder Suspension, z.B. als Zinkkomplex-Suspension oder als Gelatine-Lösung oder als Polyphloretinphosphat-Lösung,, an. Von den Lösungen oder !Suspensionen verabreicht man 0,1 bis 5 ml, beispielsweise intravenös, intramuskulär, subcutan oder intranasal. Die Anwendung kann z.B. ein- bis dreimal täglich oder ein- oder mehrmals pro Woche erfolgen. Das freie Peptid wird "vorzugsweise intravenös oder intramuskulär,, die Komplexe, z.B. Zinkkomplexe, vorzugsweise intramuskulär oder subcutan angewandt.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Folgende Abkürzungen werden angewendet : Boc ~ tert.Butyloxycarbonyl,
% = Carbobenzoxy

But ö tert.Butyl " . ■

OSu = N-Hydroxysuccinimidester

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme und Platten verwendet:

System 4jA : tert,-Arnylalkohol-Isopropanol-WasserilOOi^O^O)

System H^C : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser(51:21:28)

System 43E : tert.-Amy lalkohol-Isopropanol-V/asser (32:32:36)

System 45 ' sec.Butanol-3$iges wässeriges Ammoniak (70:30)

209βδ?/1171

System 52

System 89

System 101,

System 102A

System 102E

System HlA

System HlB

System lllC

n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7*5:21)

Essigester-Aceton-Wasser (72:24:4)

η-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:3ο)

Aethylacetat-Metfryläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50:30:10:10)

Essigester-Methyläthylketon-Eisessig-Wasser (50:30:10:10)

n-Butanol-Pyridin-konz. Ammoniak-V/asser (42:24:4:30)

n-Butanol-Pyridin-konz. Ammoniak-Wasser (40:24:6:30)

n-Butanol-Pyridin-konz. Ammoniak-Wasser (38:24:8:30)

Silicagel, Fertigplatten SL 254 der Firma Antec, Birsfelden, BL, -Schweiz,

Aluminiumoxid D-O der Firma Camag, (mit 8% Gips)

Cellulose, "Avicel"-Fertigplatten l44O, der Firma Schleicher und Schüll.

2G385?/1171

Beispiel 1:

H-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-VaI-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂ (D-a-Phg¹-Lys¹⁷'¹ -ß¹"¹ -Corticotropm-Lys -amid).

225 mg BCC-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(B0C)-NH₂ werden bei 0° und unter Stickstoff in 40 ml 95$iger Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschliessend wird die Lösung in 500 ml peroxydfreien, auf 0° gekühlten Aether eingerührt, der ausgefallene, flockige Niederschlag abfiltriert und mit Aether gewaschen. Zur Umwandlung des Octadecapeptidamid-trifluoracetates in das Acetat wird das Produkt in 10 ml Wasser gelöst und durch eine Säule (2,0 χ l8 cm) Amberlite CG—'+5 (sehwach basischer Ionenaustauscher) in Acetatform laufen gelassen.

Die Fraktionen des Eluates welche gemäss Durchflussanalyse das obige Produkt enthalten, werden lyophilisiert. Man erhält ein weisses Lyophilisat.

Das Produkt zeigt in Dünnschiehtchromatogrammen folgende Rf-Werte:

Rf (A) = 0,40 (101), Rf (A) = 0,30 (lllB), Rf(C) = 0^ Rf (C) = 0,42 (HlA).

209852/1171

In der Elektrophorese auf Cellulose wandert die Substanz bei pH 1,9 (Essigsäure-Arr.eisensäurepuffer) bei 200V in 1,5 Stunden 8,5 cm in Richtung Kathode; bei pH 4,75 (Ammoniumacetatpuffer) 200 V in 1,5 Stunden: 5,7 ^cm iⁿ Richtung Kathode,
UV (0,1-N NaOH) Jj _fflax = 28l nm (£ = 54.00) und 288nrn (ε = 5250)

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

1. B0C-D-a-Phg-0Su

100 g BOC-D-a-Phg-OH-Cyclohexylammoniumsalz werden in Chloroform mit Zitronensäure in die freie Säure übergeführt und diese wird in 1 Liter Acetonitril und Jfc_}h g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Bei 0 gibt man 65 g Dicyclohexylcarbodiimid gelöst in 400 ml Acetonitril zu, rührt 1 Stunde bei 0 und l6 Stunden bei Zimmertemperatur.. Dann wird nach Kühlung mit Eiswasser vorn ausgefallenen Dieyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat mit Aktivkohle behandelt und das Produkt aus Acetonitril-Aether-Hexan kristallisierte Man erhält es in Form feiner Nadeln vom F. 155 - I58 .

2. BOC-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-OCH

6,0 g BOC-D-a-Phg-OSu werden zusammen mit 6,4 g H-Tyr-Ser-Met-OCH-. in 75 ml absolutem Dimethylformamid unter Stickstoff gelöst und 20 Stunden bei Zimmertemperatur belassen.

209852/1 171

Dann wird auf etwa das halbe Volumen am Vakuum eingeengt und die Lösung in 400 ml Aether von 0° eingerührt. Man erhält das Produkt als amorphes Pulver vom P. I30 J35°. Rf (S) = 0,54 (89), Rf (S) = 0,68 (43A), Rf (S) = 0,50 (Chloroform-Methanol 9:1);

3. B0C-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-NH-NH₂

3,0 g BOC-D-cc-Phg-Tyr-Ser-Met-OCH, werden in 30 ml Methanol unter Stickstoff gelöst und bei 0 mit 3^5 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Nach 21 Stunden Stehenlassen im Kühlschrank ist eine dicke Paste ausgefallen, a%e man mit 10 rnl Methanol-Aether (1:2) schüttelt, filtriert und trocknet. Man erhält 2,8 g des amorphen Produktes vom P. I9I (Zers.). [α]ρ° = -11° (c = 2.,0 in Dimethylformamid) Rf (S) = 0,60 (43A), Rf(S) - 0,74 (102E), Rf(S) = 0,25 (Chloroform -Methanol 85:15).

4. BOC-D-a-Phg-^rryr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-GIy-OH

2,2 g BOC-D-a-Phß-Tyr-Ser-Met-NlI-NH₂ werden in 20 ml Acetonitril aufgeschlämmt und bei -18 durch Zufügen von 6,7 nil wässriger 2-n. Salzsäure klar gelöst. Bei -l4° gibt man 350 mg in 2 ml Wasser gelöstes Natriumnitrat zu

2 09857/1171

und rührt 15 Minuten bei -10°, unter gleichzeitiger Verdünnung mit 20 ml Acetonitril. Dann kühlt man auf -15 * gibt 5*3 rol 2-n. Sodalösung und 2,5 g Kochsalz zu, und trennt die wässrige Phase ab. Diese wird noch 2 mal mit 5 ml Acetonitril extrahiert. Die Acetonitrilphasen werden sofort kalt zu 2,69 g H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH, die vorher zusammen mit 0,44 ml N,N-Diisopropyläthylamin in 70 ml Dimethylformamid und 2 ml Wasser gelöst und dann vorgekühlt worden waren, gegeben und 4 Stunden bei 0 und 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt.

Man filtriert vom ausgefallenen Produkt ab und kristallisiert aus Aceton!tril/Wasser (1:1) um. Auf diese Weise erhält man ein weisses Pulver vom P. 210° (Zers.). Rf (S) = 0,53 (43 E), Rf(S) = 0,34 (52), Rf(S) = 0,27 (45).

5. BOC-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-GluiOtBuJ-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-NH₂

1,20 mg BOC-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH werden in 40 ml absolutem Dimethylformamid mit 0,28 ml 3~ⁿ« Chlorwasserstoff in Dioxan gelöst und mit 1,13 ß H-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOG)-Lys(BOG)-Lys(BOC)-NH unter Stickstoff verrührt. Man gibt I62 mg N-Hydroxybenztriazol und 247 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt

209852/1171

19 Stunden bei 4O°. Anschliessend rührt man in 500 ml peroxydfreien Aether bei 0° ein und filtriert vom Nie- , derschlag ab. Das Rohprodukt wird im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:7:²I; Puffer: 19*3 S Ammoniumacetat, 28,6 ml Eisessig, 1 Liter V/asser) multiplikativ über 75O Stufen verteilt (r = 54, K = 0,4? bei 22 und Phasenvolumen je 10 ml). Rf (S) = 0,51 (43A), Rf (S) = 0,51 (52). Rf (S) = 0,54 (102A).

Beispiel 2 :

D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Lys-Lys-Prο-VaI-Lys-VaI-Tyr-Pro-OH (D-a-Phg¹-Lys '' -ß -Corticotropin)

275 mg B0C-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu(0tBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Pro-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-OtBu werden bei 0° in 25 ml 90$iger Trifluoressigsäure gelöst und unter Stickstoff 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Die Lösung wird in 300 rnl peroxydfreien Aether eingerührt, der Niederschlag abfiltriert und mit Aether gewaschen. Man löst die Substanz in wenig Wasser und lässt sie durch eine Säule (1,8 χ 16 cm) Arnberlite CG-45 (schwach basischer Ionenaustauscher) in Acetatform laufen. Die Fraktionen des Eluateü,

20985?/1171

welche gemäss UV-Durchflussanalyse das Produkt enthalten, werden lyophlllsiert. Man erhält ein weisses, amorphes Lyophilisat. Rf (A) = 0,31 (lOlB), Rf. (A) = 0,4l (lUC) Rf (C) = 0,'U(IOl).

UV (0,1-N NaOH) : 2 _m = 282 (£ = 69OO), 289 (£ = 72OO).

In der Elektrophorese wandert die Verbindung in Richtung Kathode und zwar auf Celluloseplatten 200 V und 1,5 Stunden Laufdauer:

7,2 cm bei pH 1,9 (Essigsäure-Ameisensäurepuffer) 5,1 cm bei pH 4,75 (Ammoniumacetatpuffer).

Die Ausgangsverbindung kann wie folgt hergestellt werden:

BOC-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-OtBu

750 mg B0C-D-a-Phg-Tyr-Ser-Met-Glu(0tBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH werden in l8 ml absolutem Dimethylformamid mit 0,17 ml 3~n. Chlorwasserstoff in Dioxan 10 Minuten gerührt. Nachdem man 1,06 g H-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Prο-VaI-Lys (BOC )-VaI-Tyr-Pro-OtBu zugefügt hat, trägt man 104 mg N-Hydroxybenztriazol und 180 rnl Dicyclohexylcarbodiirnid ein und rührt 20 Stunden bei Zimmertemperatur. Anschliessend rührt man den Ansatz in ^Jt00 ml peroxidfreien, eiskalten Aether ein und filtriert

209852/1171

das amorph ausgefallene Produkt ab. Dieses wird zur weiteren Reinigung einer multipiikativen Gegenstromverteilung über 8OO Stufen unterworfen. Die reine Substanz zeigt einen K-Wert von O,l8 bei 22° (Phasenvolumen je 10 ml). Rf (S) = 0,71 (43c), Rf (S) = 0,46 (45), Rf (S) = 0,50 (102A).

Beispiel 3:

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten

1 17 18 1 18 IR

D~cc-Phg -Lys ^/j -ß -Corticotropin-Lys -amid 1,0 mg

ZnCl₂ 5,25 mg

Na₂HPO₄.2 H₂O ■ ' 1,05 mg

KaCl ' 2,0 mg

Benzylalkohol ' 10,0 mg 0,6-n. NaOH ad pH 8,0

Dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 4:

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-a-Phg¹-Lys^17>18-ß¹~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸~amid 1,0 mg · ZnCl₂ 4,20 mg

Na₂HPO₄.2 H₂O 1,26 mg

2098S?/1 171 1,5 mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH ad pH 8,0

Dest. Wasser ad 1,0 mg.

Beispiel 5:

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:
D-a-Phg¹-Lys^J"⁷'¹⁸-ß¹"¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amid 1,0 mg

Natriumpolyphosphat "Calgon 322" (Kondensationsgrad 15-30) 2,0 mg

NaCl 9 mg

dest. Wasser ad 1 ml,

Beispiel 6:

Man stellt eine Injektionslösung aus folgenden Komponenten her:

D-a-Phg¹~Lys¹⁷'¹⁸-ß¹"¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amid 0,50 mg

Eisessig 1,22 mg

CH₃COONa.3 H₂O 0,607 mg

NaCl 8^1 mg

dest. Wasser ad 1 ml.

209857/1171

Beispiel 7:

Man stellt eine Lösung aus folgenden Komponenten her:

t> -n-L 1 τ 17,18 _1—18 r, .. . τ 18 . , _Λ / D-a-Phg -Lys ' -ß -Corticotropxn-Lys -amid 0,4 mg 20%ige wässerige Lösung von Oxypolygelatine

mit 0,5% Phenol ad 1 ml.

Beispiel 8:

Man stellt ein Trockenvial folgender Zusammensetzung her:

1 17 18 1-18 18

D-a-Phg -Lys ' -ß -Corticotropin-Lys -amid 1,0 mg

Natriunipolyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,2 mg

NaCl 12,28 mg

Als Lösungsampulle wird bidestilliertes Wasser (2 ml) verwendet.

Beispiel 9:

Man stellt einen Nasenspray enthaltend ca. 100 Einzel-

dosen a 1 mg wie folgt her:

1 17 18 1-18 100 mg feingemahlenes D-a-Phg -Lys ' -ß -Corticotropin·

1 8
Lys -amid werden in einer Mischung von 75 mg Benzylalkohol und 1,395 g "Miglyol" 812 (Triglyzerid von Fettsäuren mit 8-12 Kohlenstoffatomen), suspendiert. Diese Suspension wird in 10 ml Aluminium-Monoblocdosen eingefüllt und mit einem

2 0 9 8 5 ?/ 117 1

Dosierventil verschlossen» Dann werden 6,0 g Freon 12/114 (40:60) unter Stickstoffdruck eingefüllt.

Beispiel 10:

Man stellt ein Trockenvial folgender Zusammensetzung her:

-. _V1, I₁. 17,18 _n 17,18 ,-,... . _ 18 ., in D-α-Pag -Lys ' -ß ' -Corticotropin-Lys -amid 1,0 mg

Mannit 40,0 mg

Als Lösungsampulle wird physiologische Kochsalzlösung (2 ml) verwendet.

Beispiel 11:

In den Beispielen 1 - 10 wird D-cc-Phg -Lys *

1 94 1 1 7 1 R TlR

β -Corticotropin statt des D-a-Phg -Lys ' -ß -

1 8
Corticotropin-Lys -amids eingesetzt.

2098B7/1171

Claims (13)

1. ΙΔΔΚ I OU - 23 -

   Patentansprüche:

   Yl\ Peptide und Peptidamide, welche 18 - 39 Aminosäuren vom N-Terminus der natürlichen Corticotropine aufweisen, in denen jedoch die erste Aminosäure durch D-cc-Phenylglycin und die Aminosäuren in 17- und 18-Stellung durch L-Lysin oder L-Orriithin ersetzt sind, und Analoge dieser Verbindungen, in welchen eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 3-5 und 25 durch andere α-Aminosäuren ersetzt sind, und Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen.
2. 2. Peptide oder Peptidamide mit 18-25 Aminosäuren
   der N-terminalen Sequenz natürlicher Corticotropine, in
   der jedoch die erste Aminosäure durch D-oc-Phenylglycin und die Aminosäuren in den Stellungen 17 und 18 durch L-Lysin oder L-Ornithin ersetzt sind, ihre Säureadditionssalze und Komplexe.
3. 3. D-a-Phenylglycyl-Lys^-p-¹·" -Corticotropin-

   18
   Lys -amid, seine Säureadditionssalze und Komplexe.
4. 4. D-a-Phenylglycyl¹-Lys^17jl8-ß¹"²⁴-Corticotropin, seine Säureadditionssalze und Komplexe.

   209857/1171
5. 5. Komplexe der in den Ansprüchen 1-4 genannten Peptide und Peptidamide mit schwerlöslichen Metallverbindungen.
6. 6. Komplexe der in den Ansprüchen 1-4 genannten Peptide oder Peptidamide mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd.
7. 7. Komplexe der in den Ansprüchen 1-4 genannten Peptide oder Peptidamide mit. Alkalimetallpolyphosphaten.
8. 8. Komplexe der in den Ansprüchen 1 - 4 genannten Peptide oder Peptidamide mit Oxypolygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyphloretinphosphat oder Polyglutaminsäure.
9. 9. Pharmazeutische Präparate, welche die in den Ansprüchen 1-8 genannten Verbindungen enthalten.
10. 10. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man aus geschützten Peptiden oder Peptidamiden, welche 18-39 Aminosäuren vom N-Terminus der natürlichen Corticotropine aufweisen, in

    209852/1171

    denen jedoch die erste Aminosäure durch D-cc-Phenylglycin und die Aminosäuren in 17- und 18-Stellung durch L-Lys.in oder L-Ornithin ersetzt sind, oder Analoge dieser Verbindungen, -in welchen eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 3-5 und" 25 durch andere α-Aminosäuren ersetzt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminoschutzgruppe die tert.Butyloxycarbonylgruppe ist.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylschutzgruppe die tert.Buty!estergruppe ist.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen mittels Säuren abspaltet.

    209852/1171