DE2216411C3 - Mikrocalorimetrische Vorrichtung zur biochemischen Analyse - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine mikrocalorimetrische Vorrichtung, wie sie im Oberbegriff des Anspruchs 1 vorausgesetzt ist.

Calorimetrische Verfahren liefern verschiedene Daten bei einer Anzahl von Analysen. Ein besonders nützliches Gebiet ist die Biochemie. Viele bekannte mikrocalorimetrische Vorrichtungen sind für solche Untersuchungen jedoch nicht zufriedenstellend, entweder weil sie wegen der einfachen Konstruktion nicht genau genug sind oder weil sie nur bei äußerst aufwendigem Aufbau eine brauchbare Genauigkeit ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine mikrocalorimetrische Vorrichtung relativ einfacher Konstruktion anzugeben, die bei einfacher Handhabung nützliche Wärmemessungen liefert. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist für die biochemische Analyse bestimmt.

Diese Aufgabe wird bei der eingangs genannten Vorrichtung durch die im Kennzeichenteil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Die Patentansprüche 2 und 3 nennen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Ein oft beim Nachweis von Bakterien oder anderem mikrobiologischem Wachstum durch calorimetrische Verfahren anzutreffendes Problem liegt darin, daß zur gleichen Zeit wie die Bakterien andere während der Meßzeitwärme erzeugende Systeme in dem Calorimeter vorhanden sein können, beispielsweise Enzym-Substrat-Systeme oder eine oder mehrere lebende, sich aber nicht teilende Zellenpopulationen, z. B. rote und weiße Blutkörperchen. Bei der Vermehrung sich teilender, mikrobiologischer Zellen tritt stets während einer beträchtlichen Zeitspanne eine zeitliche exponentiell ansteigende Wärmeentwicklung auf, deren Geschwindigkeit in einem unmittelbaren Verhältnis zu der in der Population vorhandenen Zellenanzahl steht Aufgrund der Geschwindigkeit der Wärmeentwicklung bei verschiedenartigen Systemen ist es möglich, zwischen der auf wachsende mikrobiologische Zellenpopulationen zurückgehenden Wärmeentwicklung und der Wärmeentwicklung anderer Populationen ?u unterscheiden, da die bei anderen Systemen auftreter<üs Geschwindigkeit der Wärmeentwicklung eine stetig fallende, nicht

ίο aber eine steigende sein kann.

Bei der nachstehend noch näher erläuterten mikrocalorimetrischen Vorrichtung ist mindestens ein Teil der Wandung einer isolierten Kammer porös. Als poröser isolierender Werkstoff eignet sich Polyurethanschaumstoff, der dadurch, daß 90% oder mehr der Zellen miteinander verbunden sind, eine relativ leichte Luftströmung gestattet In der Kammer ist ein Stützglied für die zu analysierende Probe vorgesehen. Ein Konditionierungsgas (meist Luft) wird vor dem Einführen in die Kammer auf eine gleichmäßig, vorgewählte Temperatur erhitzt und unter Überdruck in die Kammer eingeführt so daß ein Druckgefälle über die poröse Isolierwandung aufrechterhalten bleibt und eine stetige Gasströmung durch die poröse Kammerwandung stattfindet Die Gasströmung wird bei einer ausreichend hohen Geschwindigkeit gehalten — bei einer bestimmten Ausführungsform mit einer Kammer mit einem Volumen von 200 dm³ wird eine Gasdurchflußgeschwindigzeit von 7,62 m/min verwendet — und reicht aus, um Konvektionskräfte zu überwinden. Dabei entspricht die Temperatur an der Außenwandung der Kammer im wesentlichen der Temperatur des in die Kammer einfließenden Gases, so daß die Innenfläche der Kammerwandung dieselbe Temperatur wie das Konditionierungsgas aufweist

Gemäß einem besonderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Gas durch eine Reihe von gesteuerten Heizstufen eingeführt, deren jede Stufe durch je eine Steuerschaltung gesteuert wird, wobei die Rückkopplung und der Verstärkungsgrad mit Bezug auf die physikalischen Werte des Systems optimiert werden, um eine Proportionalsteuerung und den maximalen Verstärkungsgrad zu gewährleisten. Ein Gebläse hält die innerhalb der Kammer befindliche Luft in Umlauf — das Gebläse wird durch einen außerhalb der Kammer angeordneten Antrieb angetrieben — und das erwärmte Gas entweicht durch die poröse Wandung.

Weiterhin kann selbstverständlich eine Vielzahl einzelner Calorimetereinheiten vorgesehen sein, wobei jedes Calorimeter einen isolierten, zur Aufnahme der zu analysierenden Probe bestimmten Behälter, ein Temperaturfühlglied und ein Heizelement, welches das Zustandekommen eines Temperaturausgleichs der Probe bei der vorgewählten Systemtemperatur beschleunigt, umfaßt. Hierbei ist die Kammer durch einen angelenkten Deckel geschlossen, in dem die poröse Isolierwandung angeordnet ist. Die Störung beim öffnen des Systems (Reduzierung des Luftströmungswiderstandes) ist nur geringfügig. Nach dem Schließen des Deckels kehrt das System verhältnismäßig schnell in den stabilen Temperaturzustand zurück. Weiterhin wird die aus der Kammer aufgesaugte Luft durch ein Schaltungsgehäuse geführt, so daß die elektronischen Bauteile hei gleichbleibender Temperatur gehalten werden.

Die hier erläuterte mikrocalorimetrische Vorrichtung ist imstande, in einer 50 g-Wasserprobe entwickelte Wärmeleistungen unter 3 Mikrowatt zu erfassen, d. h.

weniger als 0,1 % der Leistung, die in einer Probe dieses Volumens typischerweise von einer wachsenden Population mikrobiologischer Zellen erzeugt wird. Die Vorrichtung benötigt nur ein Mindestmaß an Einstellungen durch den Bedienenden. Die Vorrichtung arbeitet vollautomatisch und kann selbstverständlich Sicherheitseinrichtungen, wie z. B. Schaltungen, die eine Luftströmung voraussetzen, ehe die Heizelemente in Betrieb genommen werden können, und Maximaltemperaturfühlglieder, die das System abschalten, wenn die Lufttemperatur einen vorbestimmten Wert übersteigt, enthalten. Nach dem Einführen eines Probenbehälters in eine Calorimetereinheit stellt sich automatisch ein Gleichgewichtszustand ein. Die Auswertung der Meßdaten kann selbstverständlich durch Datenverarbeitungssysteme erfolgen.

Die erfindungsgemäße mikrocalorimetrische Vorrichtung ist nachfolgend in weiteren Einzelheiten anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 eine perspektivische Ansicht der Vor richtung, ;o

Fig.2 eine perspektivische Ansicht einer einzelnen Calorimetereinheit,

F i g. 3 einen Schnitt durch die in F i g. 1 gezeigte Vorrichtung,

F i g. 4 eine teilweise abgebrochene Aufsicht von oben der Vorrichtung der F i g. 1 mit geöffnetem Deckel,

Fig. 5 einen Schnitt durch die Vorrichtung gimäß Fig. 1 aufderLinie5-5derFig. 3,

Fig.6 bis 9 die elektronische Schaltung zur Steuerung der Heizelemente;

Fig. 10 eine graphische Darstellung des typischen Ansprechverhaltens eines Heizsystems und das Ausgangssignal für eine eine biologische Probe enthaltende Probenkammer, und "

Fig. 11 eine graphische Darstellung der Wärmeentwicklung für die Fälle, daß das System nur Blut bzw. Blut und Bakterien enthält.

Die in Fig. 1 gezeigte mikrocalorimetrische Vorrichtung hat ein Gehäuse, an dem mit einem Scharnier 14 ein Deckel befestigt ist. Das Gehäuse enthält eine Kammer 16 mit einer Breite von etwa 40 cm, einer Länge von etwa 70 cm und einer Tiefe von etwa 70 cm. Die untere Wandung und die Seitenwandung dieser Kammer sind durch 5 cm dicken Polystyrolhartschaumstoff 52 isoliert. Im Deckel 12 befindet sich eine Polyurethanschaumstoffschicht 90, durch welche die aus der Kammer austretende Luft fließt. Oben in der Kammer 16 sind Zwischenwände 18 aus Aluminium angeordnet, die vierzig Räume (in fünf mal acht Reihen) bilden, welche die einzelnen Calorimetereinheiten (Fig. 2) aufnehmen.

Jede dieser Einheiten 20 umfaßt ein zylindrisches Außengehäuse 22, das bei diesem Ausführungsbeispiel einen Durchmesser von 9 cm und eine Länge von 15 cm hat. Eine eingeschäumte Polyurethanisolierung 24 hält den zylindrischen Aluminiuminnenbehälter 26, dessen Länge 12 cm, dessen Durchmesser 5 cm und dessen Wandstärke 0,2 mm beträgt. Eine Grundplatte 28 des Innenbehälters 26 wird durch eine 0,5 cm starke Aluminiumplatte gebildet, auf der ein Thermistorfühler 30 mit Ausgangsleitungen 32 befestigt ist. Um den Innenbehälter 26 herum ist eine Widerstandsdrahtwicklung 34 mit Zuleitungen 36 angeordnet. Ein Probenbehälter 38 mit einer Kappe 40 paßt mit Gleitsitz in den hs Innenbehälter 26, um einen guten thermischen Kontakt mit dessen Seitenwandung und Grundplatte zu gewäi.rleisten. Die Calorimetereinheit ist durch eine Kappe 42 aus Polyurethanschaumstoff abgeschlossen.

Gemäß F i g. 1 und 3 sind die Calorimetereinheiten auf einem Stützglied 50 in der Kammer 16 abgestützt, unterhalb dessen sich ein Temperaturfühler 54, ein Luftleitgitter 56 und ein in einer Ummantelung 60 angeordnetes Gebläserad 58 von 38 cm Durchmesser befindet. Letzteres ist auf einer Welle 62 angeordnet, die durch eine Isolierhülse 64 ragt und auf der eine Antriebsscheibe 66 befestigt ist, über v. eiche mittels eines Antriebsriemens 68 ein Antrieb von einem außerhalb der Kammer 16 angeordneten Motor 70 erfolgt.

Gemäß F i g. 3 bis 5 wird Luft durch einen Einlaß 72 eingeführt und fließt durch den Kanal 74, ein erstes Gebläse 75, fünf angedeutete Heizstufen 76 bis 80, denen je ein Temperaturfühlglied zugeordnet ist, ein zweites Gebläse 82 und Kanäle 84 und 86, die in die unterhalb des Gebläses 58 liegende Kammer 16 münden. Die durch die Kammer 16 umgewälzte Luft bewegt sich nach oben an den Zwischenwänden 18 und den Stützgliedern 50 vorbei und strömt durch die porenaufweisende Isolierwandung 90 und den Kanal 92 in den Deckel 14 zur öffnung 94, die einen Durchmesser von 10 cm hat. Die die öffnung 94 verlassende Luftströmung fließt durch eine zweite 10 cm-Öffnung 96 in ein Gehäuse mit elektronischen Schaltungen 98 hinein, das die Luft durch eine Auslaßöffnung 100 in der hinteren Wandung des Schrankkörpers 10 verläßt. Dichtungen 102 an der unteren Fläche des Deckels 12 schließen die öffnung 94 und damit die Kammer 16 dicht ab.

In F i g. 4 ist die Kammer 60 mit 40 Calorimetereinheiten 20 von oben zu sehen. Das Calorimeter 20a ist ein Bezugscalorimeter, dessen Thermistor mit einem entsprechenden Bezugskanal verbunden ist.

In den F i g. 6 und 7 ist die Schaltung der Meßkanäle für die Calorimetereinheiten 20 und des Bezugskanals dargestellt. Jeder Thermistor 30 der 39 Meßcalorimetereinheiten ist mit einer Brückenschaltung verbunden, deren Ausgangssignal dem nicht invertierenden Eingang eines Operationsverstärkers 120 zugeleitet wird. Gemäß F i g. 6 wird das Ausgangssignal der Meßschaltung über eine Ausgangsklemme 122 dem Datenverarbeitungs-(<4/?,J-Gerät 123 zugeleitet, z. B. einem digitalen Computer. Die Ausgänge dieser Kanäle sind außerdem über einen Widerstand 124 mit einem Summierungspunkt 126 verbunden. Ein zweites Signal an diesem Summierungspunkt kommt über den Widerstand 128 und die Klemme 130 aus dem Bezugskanal, der einen Thermistor in einer etwa der F i g. 7 entsprechenden Brückenschaltung enthält. Das Ausgangssignal der Brückenschaltung wird dem Verstärker 120a und über einen als Inverter dienenden Operationsverstärker 132 eines Transistorverstärkers mit den insgesa.nt mit 134 bzw. 136 bezeichneten Transistoren zugeführt, welche über die Klemmen 138 und 130 den Summierungspunkten 126 aller Meßkanäle Strom zuführen. Das Summensignal wird dem Operationsverstärker 140 zugeführt, dessen Ausgangssignal die Transistorverstärker 142 und 144 ansteuert, welche ihrerseits die außen um jeden Calorimeterbehälter 26 angeordnete Heizwicklung steuern. Beim Einsetzen einer neuen Probe in die Calorimetereinheit sorgt diese Schaltung dafür, daß die Temperatur der Calorimetereinheit rasch asymptotisch 1^0) auf die Temperatur des Bezugscalorimeters, z. B. 37°C, gebracht wird.

Fig. 8 zeigt eine Schaltung zur Steuerung der Heizstufe 76. Ähnliche Schaltuneen steuern ie eine der

anderen Heizstufen 77 bis 80. Jede Heizeinrichtung wird durch eine besondere, je mit einem Fühlglied (z. B. Thermistor 150) ausgestattete Einrichtung gesteuert, die der Heizstule in der Luftstromuπι,- nachgeordnet ist. Der Thermistor 150 ist in der Brückenschaltung 152 geschaltet, welcher Gleichstrom zugeführt wird. Dieser Versorgungsgleichstrom für die Brückenschaltung wird mit einem 12 Hz-Sägezahnsignal geringer Amplitude überlagert, das durch eine mit einem Unijunctiontransistor 156 bestückte Sägezahngeneratorschaltung 154 erzeugt wird. Das Brückenausgangssignal wird einem Operationsverstärker 158 zugeführt, der zusammen mit einer einen Transistor 162 enthaltenden Nulldurchgangsschaltung den Unijunctiontran:,istor 160 ansteuert. Die Ausgangsimpulse des Transistors 160 werden durch den Transformator 164 einem Triac Ϊ66 zugeführt, der das Heizelement 76 steuert. Die Nulldurchgangsschaltung sorgt dafür, daß der Thyristor 166 einzelne Ausgangsimpulse abgibt, die vollständige Halbwellen des Wechselstromes sind und schaltet weitgehendst jegliche hochfrequente Störung aus. Das durch die Schaltung 154 gelieferte Sägezahnsignal sorgt für eine Zeitmodulation der Leistungsimpulse des Thyristors 166 und ermöglicht den Proportionalbetrieb des Heizelementen Dc- Versiärkun^sgrad des Verstärkers 158 wird eingestellt, um für die jeweils gewünschte Temperatur den optimalen Betrieb zu gewährleisten.

Die Schaltung des letzten Heizelementes 88 ist in F i g. 9 gezeigt. Bei diesem Steuergerät sind zwei Zweige einer temperaturempfindlichen Brücke durch zwei genau aufeinander abgestimmter Sekundärwicklungen eines Transformators 170 gebildet. Die zwei anderen Zweige sind durch ein Temperaturfühlglied 54 (einen Nickelwiderstand) bzw. einen Drahtwiderstand 174 gebildet Die Brücke wird durch einen Rechteckwellenoszillator 176 mit einer Betriebsfrequenz von etwa 1 kHz gespeist. Das Regelabweichungsausgangssignal der Brücke wird durch einen zweistufigen, zwei Operationsverstärker 178 und 180 umfassenden Wechselstromverstärker verstärkt. Dabei wird das resultierende Signal durch einen Kondensator 182 gekoppelt. Nach synchroner Demodulation durch einen Feldeffekttransistor 184 wird das Signal über ein Filter 186 und eine Gleichstromleistungsverstärkerstufe 188 geleitet, um die letzte Heizwicklung 88 zu steuern.

Die graphische Darstellung gemäß Fig. 10 veranschaulicht den Betrieb eines typischen Calorimeterheizelementes nach dem Einlegen eines Probenbehälters 38. Beim Einlegen des Behälters 38 wird die volle Heizleistung angeschaltet. Nach einigen Minuten ist gemäß der Kurve 200 eine Abnahme der Heizleistung zu verzeichnen, während die Calorimetertemperatur (Kurve 202) sich der Grundlinie 204 (37°C) nähert. Nach der Ausgleichsperiode wird das Calorimeterheizele ment 34 bei Punkt 204 abgeschaltet. (Das Calorimeter heizelement ist nur in Betrieb, wenn die Temperatur de Probencalorimetcrs unter der des Bezugscaloririeter s 20a liegt.) Beim Abschalten des Heizelementes beginn eine Calorimetermessungsanalyse.

Wird einem typischen, zur Züchtung von Baktcriei eingesetzten, sterilen Nährboden bakterienfreies BIu zugesct/t, der die zur Aufrechterhaltung des Blut/eilen

ίο Stoffwechsels notwendigen Grundstoffe und Substrat! enthält, so wird durch die verschiedenen Stoffwechsel vorgänge der Blutzellen Wärme es zeugt (Kurve 208).

Da es jedoch zu keiner Vermehrung der Blutzellet kommt, ist die Geschwindigkeit der Wärmeerzeugung gleichbleibend oder bei einer mit der Zeit eintretender Verschlechterung der Faktoren sinkend. Werdei dagegen lebende Bakterien dem sterilen Nährbodei zugesetzt, so findet eine Bakterienvermehrung und eini gemäß Kurv λ 210 steigende Wärmeentwicklung bis zi dem Punkt statt, an dem die Wachstumsfaktorei weniger günstig werden, so daß nach der Spitze 212 eini sinkende Wärmeentwicklung zu verzeichnen ist.

Ein Vergleich spezifischer Bakterien ist in Fig. Γ gegeben. Die Kurve 214 stellt die wahrgenommen« Wärmeentwicklung von Escherischia coli in BHI-Nähr boden dar, wobei die Kurve eine positive Steigung be 216 und ihre Spitze bei 218 aufweist. Die Kurven 22< und 222 geben die wahrgenommene Wärmeentwick lung von E. coli in Thiglykollat-Nährboden bzw. vor a-haemolytischen Streptococci in BHl-Nährboden an Es sei darauf hingewiesen, daß jede dieser Kurven einer positiven Δ R-TeU aufweist. Verschiedene Methoder stehen zur Auswertung der Meßdaten zur Verfugung Zu diesem Zweck läßt sich z. B. eine analoge Schaltung anwenden, um mittels eines analogen Differentiators di« Ableitung der Geschwindigkeit der Wärmeentwicklung zu erzeugen. Die bei diesem Ausführungsbeispie angewandte Methodik umfaßt die Wahrnehmung einei Änderung in der Wärmeentwicklung bei festen Zeitspannen (Δ T). Nach jeder neuen Messung wird eir Vergleich zwischen einem neuen Temperaturänderungswert (Δ R) bei dem vorhergehenden Δ /?-Wen durchgeführt. Ein schematisch bei 123 angedeuteter digitaler Computer bearbeitet die Meßdaten der 3S Probenkanäle in einer Ausführungsform. In einer theoretischen Population sich teilender mikrobiologischer Zellen wird Wärme mit einer gleichmäßig steigenden Geschwindigkeit entwickelt, so daß jeder nacheinander kommende Δ ß-Wert den unmittelbar vorhergehenden Δ R - Wert übersteigt, und so daß die Kurve eine positive, das Wachstum von Bakterien nachweisende Ableitung aufweist.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Mfkrocalorimetrische Vorrichtung zur biochemischen Analyse mit einer thermisch isolierten Kammer, mit einem zu der Kammer führenden Gasleitweg, mit einer Temperatursteuerung für das der Kammer gelieferte Gas und mit einem Stützglied für eine in der Kammer zu analysierende Probe, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der thermischen Isolierung porös ist und das Gas in die Kammer unter Aufrechterhaltung einer stetigen Strömung durch die poröse Isolierung in der Kammer geführt ist

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Isolierung (90) sich in einem Deckel (12) der Kammer befindet

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas mittels eines Gebleses durch einzelne, in dem Gasleitweg angeordnete Heizstufen gefördert ist, die je mit einem Temperaturfühlglied ausgestattet sind, daß das der letzten Heizstufe zugeordnete Heizelement sich in der Kammer befindet, und daß eine auf die einzelnen Heizelemente ansprechende und das zugeordnete Heizelement steuernde elektronische Schaltung sich in einem Gehäuse (98) befindet, und daß das Gas nach Verlassen der Kammer über die poröse isolierung ^30) in das Gehäuse hineinfließend geführt ist