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Verfahren und Vorrichtung zum Tiefgefrieren
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von biologischen Substanzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren
und eine Vorrichtung zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen, bei dem die
biologischen Substanzen in Biobehälter abgefüllt, und anschließend die Biobehälter
mit einem Kühlmedium in Berührung gebracht werden.
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Bei den kryogenen Verfahren zur Konservierung von biologischen Substanzen,
wie Blut, Blutbestandteile, Zellsuspensionen oder Zellgeweben, besteht das Hauptproblem
darin, irreversible Zelischädigungen der in der Substanz enthaltenen Zellen während
des Gefrier- und Auftauvorganges zu vermeiden oder mindestens minimal zu halten.
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Wie sich gezeigt hat, können hohe Überlebensraten der Zellen zum
einen dadurch erreicht werden, daß der biologischen Substanz vor dem Tiefgefrieren
ein kryophylaktisches Schutzadditiv zugemischt wird. Die bisher verwendeten Schutzadditive,
wie z.B. Glyzerin, haben jedoch den Nachteil, daß sie gerade bei der Haltbarmachung
von Blut nach dem Auftauen aufwendige Waschprozesse erfordern, da sie organismusunverträglich
sind. Entsprechende Gefrierverfahren sind somit teuer und zeitaufwendig. Zum anderen
werden hohe Uberlebensraten der Zellen (bis zu 98 %) auch dadurch erreicht, daß
während des Gefriervorganges ein ganz bestimmter zellspezifischer Temperaturgradient
eingehalten wird. Liegt die Geschwindigkeit des Gefriervorganges unter diesem Temperaturgradienten,
wird während des Gefriervorganges eine Konzentrationserhöhung der extrazellulären
Flüssigkeit durch das Ausfrieren von Wasser erzeugt, die ihrerseits eine osmotische
Druckerhöhung zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren Milieu verursacht. Des weiteren
kann während des Gefriervorganges Wasser den Zellen selbst entzogen werden, wodurch
eine Konzentrationserhöhung der intrazellulären Lösung eintritt. Die Folge sind
Denaturierungserscheinungen an den Proteinen im Zellinneren. Diese Auswirkungen
dieses Prozesses können durch eine Erhöhung der Geschwindigkeit des Gefriervorganges
vermieden werden. Allerdings tritt bei einer zu hohen Gefriergeschwindigkeit intrazelluläres
Eis auf, welches in jedem Fall die Zellen zerstört.
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Untersuchungen haben ergeben, daß beispielsweise für Erythrozyten,
die nicht mit einem Schutzadditiv vermischt werden, der optimale Temperaturgradient
bei etwa 5000 K/min liegt, während z.B. korpuskuläre Blutbestandteile, wie Thrombozyten
oder Lymphozyten, vergleichsweise nur sehr kleine Temperaturgradienten von wenigen
K/min benötigen.
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Bekannte Verfahren zur Tiefkühlkonservierung von biologischen Substanzen
mit kleinem Temperaturgradienten machen sich die Tatsache zu Nutze, daß beim Eintauchen
von in Behältern abgefüllten biologischen Substanzen in ein flüssiges Kühlmedium
die Temperaturgradienten klein gehalten werden können, wenn nur ausreichend dickwandige
Behälter verwendet werden. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß ein Gefriervorgang
unter Einhaltung eines bestimmten zellspezifischen Temperaturgradienten nur unvollkommen
verwirklicht werden kann. Denn je nach Wandstärke der Behälter und abhängig von
dem verwendeten Kühlmedium, stellt sich immer ein bestimmter Wärmeübergang ein,
der in den meisten Fällen dem optimalen zellspezifischen Temperaturgradienten der
in dem Behälter abgefüllten biologischen Substanz höchstens nur angenähert sein
kann.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und
eine Vorrichtung zum Tiefgefrieren von in Biobehältern abgefüllten biologischen
Substanzen, die nur mit niederen Gefriergeschwindigkeiten eingefroren werden dürfen,
mit dem Ziel zu entwickeln, daß ein Gefriervorgang einer
solchen
biologischen Substanz genau entsprechend einem für diese als optimal erkannten Temperaturgradienten
mit hoher Präzision nachvollzogen werden kann.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Biobehälter
für das Tiefgefrieren zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem Material eingelegt
werden, deren Wandstärke entsprechend einem für die abgefühlte biologische Substanz
vorgegebenen Temperaturgradienten rechnerisch bestimmt wird.
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Die Anordnung der Biobehälter zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem
Material, z.B. zwischen Kunststoffplatten, und die rechnerische Bestimmung der Wandstärke
dieser Platten entsprechend einem für eine bestimmte biologische Substanz vorgegebenen
Temperaturgradienten ermöglicht es, als Biobehälter immer gleiche, in der Herstellung
möglichst wandige billige, dünn- Behälter, z.B. flexible Kunststoffbeutel, für verschiedene
biologischen Substanzen mit unterschiedlichen Temperaturgradienten einzusetzen und
dennoch immer bestimmte, ausreichend kleine Temperaturgradienten einhalten zu können.
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Denn durch die Berechnung der Wandstärke der Platten vor dem Tiefgefrieren
in Abhängigkeit der zu gefrierenden biologischen Substanz und selbstverständlich
auch unter Berücksichtigung des verwendeten Kühlmediums sowie mit der mathematischen
Lösung des bei der Berechnung auftretenden komplexen Wärmeübergangsproblemes, das
sich aus der Temperaturabhängigkeit sämtlicher
auftretender Stoffgrößen,
wie der Dichte, des Wärmeleitfähigkeitskoeffizienten, der Wärmekapazität und der
Wärmeübergangszahlen sowie der Mehrschichtigkeit des zu betrachtenden Gegenstandes
ergibt, kann der Wärmeübergang zwischen biologischer Substanz und Kühlmedium vorherbestimmt
werden. Somit kann für jede biologische Substanz bei Verwendung eines bestimmten
Kühlmediums und eines bestimmten Materials sowohl für die Biobehälter als auch die
Platten aus schlecht wärmeleitendem Material die jeweilige Wandstärke der Platten
vorgegeben werden, so daß für die Tiefgefrierung verschiedener biologischer Substanzen
lediglich eine gewisse Anzahl von unterschiedlich dicken Platten vorhanden sein
muß, die dann entsprechend dem Temperaturgradienten der einzufrierenden biologischen
Substanz eingesetzt werden.
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Vorteilhafterweise kann die rechnerische Bestimmung der Wandstärken
der Platten in Abhängigkeit einer Temperatur-Zeitkurve durchgeführt werden, die
für die Außenwand der Biobehälter entsprechend dem für die abgefüllte biologische
Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten errechnet wird. Ist die mathematische
Lösung des bei einer Berechnung der Wandstärke der Platten auftretenden komplexen
Wärmeltbergangs problemes einmal bekannt, kann ohne Schwierigkelt für die Außenwand
der Biobehälter eine Temperatur-Zeitkürve, die dem Temperaturgradienten der biologischen
Substanz im inneren des Biobehälters entspricht,
aufgestellt werden.
Damit ist dann eine einfache Möglichkeit für die Uberwachung der Geschwindigkeit
des Gefriervorganges gegeben, denn die errechnete Temperatur-Zeitkurve kann leicht
mit einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen tatsächlichen Temperatur verglichen
werden. Sterilitätsprobleme, die sich bei bekannten Gefriervorrichtungen mit einer
Überwachung des Temperaturverlaufs mittels eines im Inneren des Biobehälters angeordneten
Thermoelementes ergeben, können somit außer Acht gelassen werden.
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Um neben der Überwachung auch eine Regelung der Gefriergeschwindigkeit
durchführen zu können, ist es des weiteren zweckmäßig, wenn, wie nach einer vorteilhaften
Ausgestaltung des Erfindungsgedankens, die Biobehälter während des Tiefgefrierens
von außen beheizt werden, wobei die Heizleistung entsprechend dem Differenzwert
geregelt wird, der sich aus einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen Temperatur
und der für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve ergibt. Eine Anpassung
des Tiefgefriervorganges an einen gewünschten Temperaturgradienten kann dann zum
einen durch die Vorgabe der Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material
und zum anderen durch die Beheizung der Außenwand der Biobehälter erfolgen. Das
Anbringen der Platten stellt dabei zunEchst eine Grobregelung der Gefriergeschwindigkeit
dar, während die Heizung die Feinregelung Ubernimmt. Zudem bietet sich dann die
Möglichkeit, während des Tiefgefrierens nicht nur einen konstanten
Temperaturgradienten
einzuhalten, sondern auch ein genaues Programm mit Temperatur-Haltepunkten nachzufahren.
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Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens weist einen Behälter
für flüssiges Kühlmedium, eine Taucheinrichtung und vorteilhafterweise eine an die
Taucheinrichtung angehängte Halteeinrichtung auf. Die Halteeinrichtung, die mit
Druckelementen versehen ist, umspannt dabei Platten aus schlecht wärmeleitendem
Material und einen zwischen diesen angeordneten Biobehälter.
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Beispielsweise kann die Halteeinrichtung aus zwei im Abstand voneinander
angeordneten, über Stege in Verbindung stehenden U-förmigen Einsteckelementen bestehen,
zwischen deren Schenkel zwei Platten aus schlecht wärmeleitendem Material mit einem
dazwischen liegenden Biobehälter eingeschoben werden.
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Als Druckelemente können jeweils an einem Schenkel der U-förmigen
Einsteckelemente zwei federbelastete Hebel beweglich befestigt sein, die die Platten
aus schlecht wärmeleitendem Material und den zwischen ihnen eingelegten Biobehälter
gegen den zweiten Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes drücken.
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Die Schenkel länge des U-förmigen Einsteckelementes entspricht dabei
in etwa der Höhe der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material.
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Die Halteeinriahtung kann aber auch aus ebenso U-förmigen Klammern
mit kurzer Schenkellänge bestehen, die die
Platten aus schlecht
wärmeleitendem Material und den zwischen diesen liegenden Biobehälter nur an deren
oberen und unteren Ende umfassen. Zwischen den Schenkeln der Klammern kann dann
als Druckelement eine Feder angeordnet sein.
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Trotz der relativ einfachen Konstruktion solcher Vorrichtungen wird
dann sicher vermieden, daß sich beim Eintauchen in flüssiges Kühlmedium zwischen
den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und dem Biobehälter Kühlsich ergebenden
medium ansammelt, was sonst infolge desJunterschiedlichen Wärmeübergangs einen ungleichmäßigen
Gefriervorgang nach sich ziehen würde.
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Besonders vorteilhaft erweist es sich des weiteren, wenn zwischen
die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und dem Biobehälter dünne Metallplatten
eingeklemmt sind, auf deren Außenseite, die den Platten aus schlecht wärmeleitendem
Material zugewandt ist, eine Heizvorrichtung und auf deren Innenseite, die dem Biobehälter
zugewandt ist, ein Thermoelement angeordnet ist, wobei das Thermoelement und die
Heizvorrichtung an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit angeschlossen sind. Die
Metallplatten sind dabei nicht nur als Träger des Thermoelementes und der Heizvorrichtung
gedacht, sondern sie dienen gleichzeitig auch zur Formgebung des beispielsweise
aus einem Kunststoffbeutel bestehendem Biobehälters und zur Homogenisierung des
Wärmestromes
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden anhand eines
in den Figuren 1 und 2 schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung
zur Durchführung des erf indungs gemäßen Verfahrens beschrieben.
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Es zeigt: Figur 1 eine Stirnansicht einer Halteeinrichtung mit einem
eingesetzten, zwischen Metallplatten und Platten aus schlecht wärmeleitendem Material
eingeklemmten Biobehälter, Figur 2 eine Seitenansicht zur Figur 1, wobei n beiden
Figuren für die gleichen Teile die gleichen Bezugszeichen verwendet sind.
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In den Figuren 1 und 2 ist mit 1 ein Behälter für flüssiges Kühlmedium
und mit 2 eine nur teilweise dargestellte Taucheinrichtung bezeichnet, die beispielsweise
eine in verschiedenen Höhen geführte Fördereinrichtung sein kann. An die Taucheinrichtung
2 ist eine Halteeinrichtung 3 angehängt, die aus zwei im Abstand voneinander angeordneten,
über einen oberen und einen unteren Steg 6, 7 in Verbindung stehenden U-förmigen
Einsteckelementen 4, 5 besteht. Zur Aufhängung der Halteinrichtung 3 an die Taucheinrichtung
2 ist in der Mitte des oberen Steges ein Bügel 8 befestigt.
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Zwischen den Schenkeln der Einsteckelemente 4, 5 ist ein mit der
zu gefrierenden biologischen Substanz gefüllter
Biobehälter 14,
z.B. ein flexibler Kunststoffbeutel, der von einem Metaliplattenpaar 15 und von
einem Plattenpaar 16 aus schlecht wärmeleitendem Material, wie z.B. Kunststoff,
eingeschlossen ist, eingelegt. Die Wandstärke des Plattenpaares 16 aus schlecht
wärmeleitendem Material wird dabei im voraus in Abhängigkeit des für die zu gefrierende
biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten rechnerisch bestimmt. Nach
der errechneten Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 richtet
sich dann der Abstand zwischen den Schenkeln der U-förmigen Einsteckelemente 4,
5.
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Um zu vermeiden, daß sich beim Eintauchen der Halteeinrichtung 3
in den Behälter 1 zwischen der Oberfl#che des Biobehälters 14, den Metallplatten
15 und den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 Kühlmedium ansammeln
kann, drücken durch Federn 13 belastete Hebel 9, 10 und 11, 12, die jeweils an einem
Schenkel der U-förmigen Einsteckelemente 4, 5 beweglich angelenkt sind, die eingelegten
Platten und den zwischen diesen eingeschlossenen Biobehälter 14 gegen den zweiten
Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes 4, 5.
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Zur genauen Einhaltung eines vorgegebenen Temperaturgradienten sind
die Metallplatten 15 auf ihrer Außenseite, die den Platten 16 aus schlecht wärmeleitendem
Material zugewandt ist, mit einer Heizvorrichtung 18 versehen, die z.B. eine in
Silikon-Kautschuk eingebettete Heizwendel sein kann. Die Heizvorrichtung 18 ist
ebenso wie ein auf der Innenseite der
Metallplatten 15 angeordnetes
Thermoelement 17 an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 angeschlossen. Über
die Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 kann dann die Heizleistung der Heizvorrichtung
18 entsprechend dem Differenzwert geregelt werden, der sich aus einer an der Außenwand
des Biobehälters 14 mit dem Thermoelement 17 gemessenenTemperatur und einer im voraus
flir die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve, die dem Temperaturgradienten
der einzugefrierenden biologischen Substanz entspricht, geregelt werden.
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L e e r s e i t e