DE2657703A1 - Verfahren und vorrichtung zum tiefgefrieren von biologischen substanzen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum tiefgefrieren von biologischen substanzen

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Description

  • Verfahren und Vorrichtung zum Tiefgefrieren
  • von biologischen Substanzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen, bei dem die biologischen Substanzen in Biobehälter abgefüllt, und anschließend die Biobehälter mit einem Kühlmedium in Berührung gebracht werden.
  • Bei den kryogenen Verfahren zur Konservierung von biologischen Substanzen, wie Blut, Blutbestandteile, Zellsuspensionen oder Zellgeweben, besteht das Hauptproblem darin, irreversible Zelischädigungen der in der Substanz enthaltenen Zellen während des Gefrier- und Auftauvorganges zu vermeiden oder mindestens minimal zu halten.
  • Wie sich gezeigt hat, können hohe Überlebensraten der Zellen zum einen dadurch erreicht werden, daß der biologischen Substanz vor dem Tiefgefrieren ein kryophylaktisches Schutzadditiv zugemischt wird. Die bisher verwendeten Schutzadditive, wie z.B. Glyzerin, haben jedoch den Nachteil, daß sie gerade bei der Haltbarmachung von Blut nach dem Auftauen aufwendige Waschprozesse erfordern, da sie organismusunverträglich sind. Entsprechende Gefrierverfahren sind somit teuer und zeitaufwendig. Zum anderen werden hohe Uberlebensraten der Zellen (bis zu 98 %) auch dadurch erreicht, daß während des Gefriervorganges ein ganz bestimmter zellspezifischer Temperaturgradient eingehalten wird. Liegt die Geschwindigkeit des Gefriervorganges unter diesem Temperaturgradienten, wird während des Gefriervorganges eine Konzentrationserhöhung der extrazellulären Flüssigkeit durch das Ausfrieren von Wasser erzeugt, die ihrerseits eine osmotische Druckerhöhung zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren Milieu verursacht. Des weiteren kann während des Gefriervorganges Wasser den Zellen selbst entzogen werden, wodurch eine Konzentrationserhöhung der intrazellulären Lösung eintritt. Die Folge sind Denaturierungserscheinungen an den Proteinen im Zellinneren. Diese Auswirkungen dieses Prozesses können durch eine Erhöhung der Geschwindigkeit des Gefriervorganges vermieden werden. Allerdings tritt bei einer zu hohen Gefriergeschwindigkeit intrazelluläres Eis auf, welches in jedem Fall die Zellen zerstört.
  • Untersuchungen haben ergeben, daß beispielsweise für Erythrozyten, die nicht mit einem Schutzadditiv vermischt werden, der optimale Temperaturgradient bei etwa 5000 K/min liegt, während z.B. korpuskuläre Blutbestandteile, wie Thrombozyten oder Lymphozyten, vergleichsweise nur sehr kleine Temperaturgradienten von wenigen K/min benötigen.
  • Bekannte Verfahren zur Tiefkühlkonservierung von biologischen Substanzen mit kleinem Temperaturgradienten machen sich die Tatsache zu Nutze, daß beim Eintauchen von in Behältern abgefüllten biologischen Substanzen in ein flüssiges Kühlmedium die Temperaturgradienten klein gehalten werden können, wenn nur ausreichend dickwandige Behälter verwendet werden. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß ein Gefriervorgang unter Einhaltung eines bestimmten zellspezifischen Temperaturgradienten nur unvollkommen verwirklicht werden kann. Denn je nach Wandstärke der Behälter und abhängig von dem verwendeten Kühlmedium, stellt sich immer ein bestimmter Wärmeübergang ein, der in den meisten Fällen dem optimalen zellspezifischen Temperaturgradienten der in dem Behälter abgefüllten biologischen Substanz höchstens nur angenähert sein kann.
  • Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Tiefgefrieren von in Biobehältern abgefüllten biologischen Substanzen, die nur mit niederen Gefriergeschwindigkeiten eingefroren werden dürfen, mit dem Ziel zu entwickeln, daß ein Gefriervorgang einer solchen biologischen Substanz genau entsprechend einem für diese als optimal erkannten Temperaturgradienten mit hoher Präzision nachvollzogen werden kann.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Biobehälter für das Tiefgefrieren zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem Material eingelegt werden, deren Wandstärke entsprechend einem für die abgefühlte biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten rechnerisch bestimmt wird.
  • Die Anordnung der Biobehälter zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem Material, z.B. zwischen Kunststoffplatten, und die rechnerische Bestimmung der Wandstärke dieser Platten entsprechend einem für eine bestimmte biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten ermöglicht es, als Biobehälter immer gleiche, in der Herstellung möglichst wandige billige, dünn- Behälter, z.B. flexible Kunststoffbeutel, für verschiedene biologischen Substanzen mit unterschiedlichen Temperaturgradienten einzusetzen und dennoch immer bestimmte, ausreichend kleine Temperaturgradienten einhalten zu können.
  • Denn durch die Berechnung der Wandstärke der Platten vor dem Tiefgefrieren in Abhängigkeit der zu gefrierenden biologischen Substanz und selbstverständlich auch unter Berücksichtigung des verwendeten Kühlmediums sowie mit der mathematischen Lösung des bei der Berechnung auftretenden komplexen Wärmeübergangsproblemes, das sich aus der Temperaturabhängigkeit sämtlicher auftretender Stoffgrößen, wie der Dichte, des Wärmeleitfähigkeitskoeffizienten, der Wärmekapazität und der Wärmeübergangszahlen sowie der Mehrschichtigkeit des zu betrachtenden Gegenstandes ergibt, kann der Wärmeübergang zwischen biologischer Substanz und Kühlmedium vorherbestimmt werden. Somit kann für jede biologische Substanz bei Verwendung eines bestimmten Kühlmediums und eines bestimmten Materials sowohl für die Biobehälter als auch die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material die jeweilige Wandstärke der Platten vorgegeben werden, so daß für die Tiefgefrierung verschiedener biologischer Substanzen lediglich eine gewisse Anzahl von unterschiedlich dicken Platten vorhanden sein muß, die dann entsprechend dem Temperaturgradienten der einzufrierenden biologischen Substanz eingesetzt werden.
  • Vorteilhafterweise kann die rechnerische Bestimmung der Wandstärken der Platten in Abhängigkeit einer Temperatur-Zeitkurve durchgeführt werden, die für die Außenwand der Biobehälter entsprechend dem für die abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten errechnet wird. Ist die mathematische Lösung des bei einer Berechnung der Wandstärke der Platten auftretenden komplexen Wärmeltbergangs problemes einmal bekannt, kann ohne Schwierigkelt für die Außenwand der Biobehälter eine Temperatur-Zeitkürve, die dem Temperaturgradienten der biologischen Substanz im inneren des Biobehälters entspricht, aufgestellt werden. Damit ist dann eine einfache Möglichkeit für die Uberwachung der Geschwindigkeit des Gefriervorganges gegeben, denn die errechnete Temperatur-Zeitkurve kann leicht mit einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen tatsächlichen Temperatur verglichen werden. Sterilitätsprobleme, die sich bei bekannten Gefriervorrichtungen mit einer Überwachung des Temperaturverlaufs mittels eines im Inneren des Biobehälters angeordneten Thermoelementes ergeben, können somit außer Acht gelassen werden.
  • Um neben der Überwachung auch eine Regelung der Gefriergeschwindigkeit durchführen zu können, ist es des weiteren zweckmäßig, wenn, wie nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des Erfindungsgedankens, die Biobehälter während des Tiefgefrierens von außen beheizt werden, wobei die Heizleistung entsprechend dem Differenzwert geregelt wird, der sich aus einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen Temperatur und der für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve ergibt. Eine Anpassung des Tiefgefriervorganges an einen gewünschten Temperaturgradienten kann dann zum einen durch die Vorgabe der Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und zum anderen durch die Beheizung der Außenwand der Biobehälter erfolgen. Das Anbringen der Platten stellt dabei zunEchst eine Grobregelung der Gefriergeschwindigkeit dar, während die Heizung die Feinregelung Ubernimmt. Zudem bietet sich dann die Möglichkeit, während des Tiefgefrierens nicht nur einen konstanten Temperaturgradienten einzuhalten, sondern auch ein genaues Programm mit Temperatur-Haltepunkten nachzufahren.
  • Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens weist einen Behälter für flüssiges Kühlmedium, eine Taucheinrichtung und vorteilhafterweise eine an die Taucheinrichtung angehängte Halteeinrichtung auf. Die Halteeinrichtung, die mit Druckelementen versehen ist, umspannt dabei Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und einen zwischen diesen angeordneten Biobehälter.
  • Beispielsweise kann die Halteeinrichtung aus zwei im Abstand voneinander angeordneten, über Stege in Verbindung stehenden U-förmigen Einsteckelementen bestehen, zwischen deren Schenkel zwei Platten aus schlecht wärmeleitendem Material mit einem dazwischen liegenden Biobehälter eingeschoben werden.
  • Als Druckelemente können jeweils an einem Schenkel der U-förmigen Einsteckelemente zwei federbelastete Hebel beweglich befestigt sein, die die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und den zwischen ihnen eingelegten Biobehälter gegen den zweiten Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes drücken.
  • Die Schenkel länge des U-förmigen Einsteckelementes entspricht dabei in etwa der Höhe der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material.
  • Die Halteeinriahtung kann aber auch aus ebenso U-förmigen Klammern mit kurzer Schenkellänge bestehen, die die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und den zwischen diesen liegenden Biobehälter nur an deren oberen und unteren Ende umfassen. Zwischen den Schenkeln der Klammern kann dann als Druckelement eine Feder angeordnet sein.
  • Trotz der relativ einfachen Konstruktion solcher Vorrichtungen wird dann sicher vermieden, daß sich beim Eintauchen in flüssiges Kühlmedium zwischen den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und dem Biobehälter Kühlsich ergebenden medium ansammelt, was sonst infolge desJunterschiedlichen Wärmeübergangs einen ungleichmäßigen Gefriervorgang nach sich ziehen würde.
  • Besonders vorteilhaft erweist es sich des weiteren, wenn zwischen die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und dem Biobehälter dünne Metallplatten eingeklemmt sind, auf deren Außenseite, die den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist, eine Heizvorrichtung und auf deren Innenseite, die dem Biobehälter zugewandt ist, ein Thermoelement angeordnet ist, wobei das Thermoelement und die Heizvorrichtung an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit angeschlossen sind. Die Metallplatten sind dabei nicht nur als Träger des Thermoelementes und der Heizvorrichtung gedacht, sondern sie dienen gleichzeitig auch zur Formgebung des beispielsweise aus einem Kunststoffbeutel bestehendem Biobehälters und zur Homogenisierung des Wärmestromes Weitere Einzelheiten der Erfindung werden anhand eines in den Figuren 1 und 2 schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Durchführung des erf indungs gemäßen Verfahrens beschrieben.
  • Es zeigt: Figur 1 eine Stirnansicht einer Halteeinrichtung mit einem eingesetzten, zwischen Metallplatten und Platten aus schlecht wärmeleitendem Material eingeklemmten Biobehälter, Figur 2 eine Seitenansicht zur Figur 1, wobei n beiden Figuren für die gleichen Teile die gleichen Bezugszeichen verwendet sind.
  • In den Figuren 1 und 2 ist mit 1 ein Behälter für flüssiges Kühlmedium und mit 2 eine nur teilweise dargestellte Taucheinrichtung bezeichnet, die beispielsweise eine in verschiedenen Höhen geführte Fördereinrichtung sein kann. An die Taucheinrichtung 2 ist eine Halteeinrichtung 3 angehängt, die aus zwei im Abstand voneinander angeordneten, über einen oberen und einen unteren Steg 6, 7 in Verbindung stehenden U-förmigen Einsteckelementen 4, 5 besteht. Zur Aufhängung der Halteinrichtung 3 an die Taucheinrichtung 2 ist in der Mitte des oberen Steges ein Bügel 8 befestigt.
  • Zwischen den Schenkeln der Einsteckelemente 4, 5 ist ein mit der zu gefrierenden biologischen Substanz gefüllter Biobehälter 14, z.B. ein flexibler Kunststoffbeutel, der von einem Metaliplattenpaar 15 und von einem Plattenpaar 16 aus schlecht wärmeleitendem Material, wie z.B. Kunststoff, eingeschlossen ist, eingelegt. Die Wandstärke des Plattenpaares 16 aus schlecht wärmeleitendem Material wird dabei im voraus in Abhängigkeit des für die zu gefrierende biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten rechnerisch bestimmt. Nach der errechneten Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 richtet sich dann der Abstand zwischen den Schenkeln der U-förmigen Einsteckelemente 4, 5.
  • Um zu vermeiden, daß sich beim Eintauchen der Halteeinrichtung 3 in den Behälter 1 zwischen der Oberfl#che des Biobehälters 14, den Metallplatten 15 und den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 Kühlmedium ansammeln kann, drücken durch Federn 13 belastete Hebel 9, 10 und 11, 12, die jeweils an einem Schenkel der U-förmigen Einsteckelemente 4, 5 beweglich angelenkt sind, die eingelegten Platten und den zwischen diesen eingeschlossenen Biobehälter 14 gegen den zweiten Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes 4, 5.
  • Zur genauen Einhaltung eines vorgegebenen Temperaturgradienten sind die Metallplatten 15 auf ihrer Außenseite, die den Platten 16 aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist, mit einer Heizvorrichtung 18 versehen, die z.B. eine in Silikon-Kautschuk eingebettete Heizwendel sein kann. Die Heizvorrichtung 18 ist ebenso wie ein auf der Innenseite der Metallplatten 15 angeordnetes Thermoelement 17 an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 angeschlossen. Über die Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 kann dann die Heizleistung der Heizvorrichtung 18 entsprechend dem Differenzwert geregelt werden, der sich aus einer an der Außenwand des Biobehälters 14 mit dem Thermoelement 17 gemessenenTemperatur und einer im voraus flir die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve, die dem Temperaturgradienten der einzugefrierenden biologischen Substanz entspricht, geregelt werden.
  • L e e r s e i t e

Claims (5)

  1. PatentansprUche 1. Verfahren zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen, bei dem die biologischen Substanzen in Biobehälter abgefüllt und anschließend die Biobehälter mit einem Kühlmedium in Berührung gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Biobehälter für das Tiefgefrieren zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem Material eingelegt werden, deren Wandstärke entsprechend einem für die abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten rechnerisch bestimmt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rechnerische Bestimmung der Wandstärke der Platten in Abhängigkeit einer Temperatur-Zeitkurve durchgeführt wird, die für die Außenwand der Biobehälter entsprechend dem für die abgefUllte biologische Substanz vorgegebenen Temperaturgradienten errechnet-wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeitnet, daß die Biobehälter während des Tiefgefrierens von außen beheizt werden, wobei die Heizleistung entsprechend dem Differenzwert geregelt wird, der sich aus einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen Temperatur und der für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve ergibt.
  4. 4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 mit einem Behälter für flüssiges Kühlmedium und einer Taucheinrichtung, gekennzeichnet durch eine an die Taucheinrichtung (2) angehängte Halteeinrichtung (3), die Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material und einen zwischen diesen angeordneten Biobehälter (14) umspannt, wobei die Halteeinrichtung (3) Druckelemente (9, 10, 11, 12, 13) aufweist.
  5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen die Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material und den Biobehälter (14) dünne Metallplatten (15) eingeklemmt sind, auf deren Außenseite, die den Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist, eine Heizvorrichtung (18) und auf deren Innenseite, die dem Biobehälter (14) zugewandt ist, ein Thermoelement (17) angeordnet ist, wobei das Thermoelement (17) und die Heizvorrichtung (18) an eIne Regelungs- und/oder Steuereinheit (19) angeschlossen sind.
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