DE2657703C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen, bei dem die biologischen Substanzen in Biobehälter abgefüllt, die Biobehälter zwischen Platten gelegt und anschließend zum Tiefgefrieren mit einem Kühlmedium in Berührung gebracht werden.

Bei den kryogenen Verfahren zur Konservierung von biologischen Substanzen, wie Blut, Blutbestandteile, Zellsuspensionen oder Zellgeweben, besteht das Hauptproblem darin, irreversible Zellschädigungen der in der Substanz enthaltenen Zellen wänrend des Geirier- und Auftauvorganges zu vermeiden oder mindestens minimal zu halten.

Wie sich gezeigt hat, können hohe Überlebensraten der Zellen zum einen dadurch erreicht werden, daß der biologischen Substanz vor dem Tiefgefrieren ein kryophylaktisches Schutzadditiv zugemischt wird. Die bisher verwendeten Schutzadditive, wie z. B. Glyzerin, haben jedoch den Nachteil, daß sie gerade bei der Haltbarmachung von Blut nach dem Auftauen aufwendige Waschprozesse erfordern, da sie organismusunverträglich sind. Entsprechende Gefrierverfahren sind somit teuer und zeitaufwendig. Zum anderen werden hohe Überlebensraten der Zellen (bis zu 98%) auch dadurch erreicht, daß während des Gefriervorganges eine ganz bestimmte zellspezifische Gefriergeschwindigkeit eingehalten wird. Liegt die Geschwindigkeit des Gefriervorganges unter dieser zellspezifischen Gefriergeschwindigkeit, wird während des Gefriervorganges eine Konzentrationserhöhung der extrazellulären Flüssigkeit durch das Ausfrieren von Wasser erzeugt, die ihrerseits eine osmotische Druckerhöhung zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren Milieu verursacht. Des weiteren kann während des Gefriervorganges Wasser den Zellen selbst entzogen werden, wodurch eine Konzentrationserhöhung der intrazellulären Lö-

3i sung eintritt. Die Folge sind Denaturierungserscheinungen an den Proteinen im Zellinneren. Diese Auswirkungen dieses Prozesses können durch eine Erhöhung der Geschwindigkeit des Gefriervorganges vermieden werden. Allerdings tritt bei einer zu hohen Gefriergeschwindigkeit intrazelluläres Eis auf, welches in jedem Fall die Zellen zerstört.

Untersuchungen haben ergeben, daß beispielsweise für Erythrozyten, die nicht mit einem Schutzadditiv vermischt werden, die optimale Gefriergeschwindigkeit bei etwa 5000 K/min liegt, während z. B. korpuskulare Blutbestandteile, wie Thrombozyten oder Lymphozyten, vergleichsweise nur sehr geringe Gefriergeschwindigkeiten von wenigen K/min benötigen.

Bekannte Verfahren zur Tiefkühlkonservierung von biologischen Substanzen mit geringen Gefriergeschwindigkeiten machen sich die Tatsache zu Nutze, daß beim Eintauchen von in Behältern abgefüllten biologischen Substanzen in ein flüssiges Kühlmedium die Gefriergeschwindigkeiten gering gehalten werden können, wenn nur ausreichend dickwandige Behälter verwendet werden. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß ein Gefriervorgang unter Einhaltung einer bestimmten zellspezifischen Gefriergeschwindigkeit nur unvollkommen verwirklicht werden kann. Denn je nach Wandstärke der Behälter und abhängig von dem verwendeten Kühlmedium, stellt sich immer ein bestimmter Wärmeübergang ein, der in den meisten Fällen der optimalen zellspezifischen Gefriergesehwindigkeil der in dem Behälter abgefüllten biologischen Substanz höchstens nur angenähert sein kann.

Die gleichen Probleme ergeben sich bei einer aus der DE-OS 24 10 061 bekannten Vorrichtung zum Gefrieren von in flexiblen Beuteln abgefüllten Flüssigkeiten,

insbesondere von biomedizinischen Flüssigkeiten wie Blut, bei der die flexiblen Beutel für den Gefriervorgang, der durch Eintauchen der flexiblen Beutel in einen mit Kühlmedium, wie z. B. flüssigen Stickstoff, gefüllten Behälter erfolgt, zwischen zwei senkrecht stehenden parallelen Platten angeordnet werden, die ihrerseits einer Einsteckeinrichtung zugeordnet sind. Dabei kommt den senkrecht stehenden Platten lediglich die Aufgabe zu. dem mit der zu gefrierenden biomedizinischen Flüssigkeit gefüllten flexiblen Beutel eine ausreichende Stabilität und damit der eingeschlossener flüssigen Masse einen möglichst gleichmäßigen, dünnen Querschnitt zu geben, der den Gefriervorgang günstig beeinflußt. Somit stellt sich auch bei dieser bekannten Vorrichtung zum Tiefgefrieren von biomedizinischen Flüssigkeiten immer ein bestimmter Wärmeübergang ein, der der optimalen zellspezifischen Gefriergeschwindigkeit der in dem flexiblen Beutel enthaltenen biomedizinischen Flüssigkeit nur angenähert sein kann. Außerdem wird bei der bekannten Vorrichtung die Einhaltung sehr hoher Gefriergeschwindigkeuen angestrebt, so daß diese Vorrichtung nicht zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen geeignet ist, die nur mit niedrigen Gefriergeschwindigkeiten eingefroren werden dürfen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Tiefgefrieren von in Biobehältern abgefüllten biologischen Substanzen, die nur mit niederen Gefriergeschwindigkeiten eingefroren werden dürfen, mit dem Ziel zu entwickeln, daß ein Gefriervorgang einer solchen biologischen Substanz genau entsprechend einer für diese als optima¹ erkannten Gefriergeschwindigkeit mit hoher Präzision nachvollzogen werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Platten aus schlecht wärmeleitendem Material verwendet werden und die Wandstärke der Platten entsprechend einer für die in den Biobehälter abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit rechnerisch bestimmt wird.

Die Anordnung der Biobehälter zwischen Platten aus schlecht wärmeleitendem Material, z. B. zwischen Kunststoffplatten, und die rechnerische Bestimmung der Wandstärke dieser Platten entsprechend einer für eine bestimmte biologische Substanz vorgegebenen Gefriergeschwindigkeit ermöglicht es, als Biobehälter immer gleiche, in der Herstellung möglichst billige, dünnwandige Behälter, z. B. flexible Kunststoffbeutel, für verschiedene biologische Substanzen mit unterschiedlichen zellspezifischen Gefriergeschwindigkeiten einzusetzen und dennoch immer bestimmte, ausreichend niedrige Gefriergeschwindigkeiten einhalten zu können. Denn durch die Berechnung der Wandstärke der Platten vor dem Tiefgefrieren in Abhängigkeit der zu gefrierenden biologischen Substanz und selbstverständlich auch in Abhängigkeit des verwendeten Kühlmediums sowie mit der mathematischen Lösung des bei der Berechnung auftretenden komplexen Wärmeübergangsproblemes, das sich aus der Temperaturabhängigkeit sämtlicher auftretender Stoffgrößen, wie der Dichte, des Wärmeleitfähigkeitskoeffizienten, der Wärmekapazität und der Wärmeübergangszahlen sowie der Mehrschichtigkeit des zu betrachtenden Gegenstandes ergibt, kann der Wärmeübergang zwischen biologischer Substanz und Kühlmedium vorherbestimmt werden. Somit kann für jede biologische Substanz bei Verwendung eines bestimmten Kühlinediums und eines bestimmten Materials sowohl für die Biobehälter als auch die Platten aus

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schlecht wärmeleitendem Material die jeweilige Wandstärke der Platten vorgegeben werden, so daß für die Tiefgefrierung verschiedener biologischer Substanzen lediglich eine gewisse Anzahl von unterschiedlich dicken Platten vorhanden sein muß, die dann entsprechend der z.ellspezifischen Gefriergeschwindigkeit der einzufrierenden biologischen Substanz eingesetzt werden.

Vorteilhafterweise wird zur rechnerischen Bestimmung der Wandstärke der Platten zunächst für die Außenwand der Biobehälter eine Temperatur-Zeitkurve errechnet, die der vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit der im inneren des Biobehälters vorhandenen biologischen Substanz entspricht und anschließend die Wandstärke der Platten in Abhängigkeit dieser Temperatur-Zeitkurve errechnet. Ist die mathematische Lösung des bei einer Berechnung der Wandstärke der Platten auftretenden komplexen Wärmeübergangsproblems einmal bekannt, kann auch ohne Schwierigkeit für die Außenwand der Biobehälter eine Temperatur-Zeitkurve, die der optimalen Gefriergeschwindigkeit der biologischen Substanz im Inneren des Biobehälters entspricht, aufgestellt werden. Damit ist dann eine einfache Möglichkeit für die Überwachung der Geschwindigkeit des Gefriervorganges gegeben, denn die errechnete Temperatur-Zeitkurve kann leicht mit einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen tatsächlichen Temperatur verglichen werden. Sterilitätsprobleme, die sich bei bekannten Gefriervorrichtungen mit einer Überwachung des Temperaturverlauts mittels eines im Inneren des Biobehälters angeordneten Thermoelementes ergeben, können somit außer Acht gelassen werden.

Um neben der Überwachung auch eine Regelung der Gefriergeschwindigkeit durchführen zu können, ist es des weiteren zweckmäßig, wenn, wie nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des Erfindungsgedankens, die Biobehälter während des Tiefgefrierens von außen beheizt werden, wobei die Heizleistung entspreche·. J dem Differenzwert geregelt wird, der sich aus einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen Temperatur und der für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve ergibt. Eine Anpassung des Tiefgefriervorganges an eine gewünschte Gefrie.-geschwindigkeit kann dann zum einen durch die Vorgabe der Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und zum anderen durch die Beheizung der Außenwand der Biobehälter erfolgen. Das Anbringen der Platten stellt dabei zunächst eine Grobregelung der Gefriergeschwindigkeit dar, während die Heizung die Feinregelung übernimmt. Zudem bietet sich dann die Möglichkeit, während des Tiefgefrierens nicht nur eine konstante Gefriergeschwindigkeit einzuhalten, sondern auch ein genaues Programm mit Temperatur-Haltepunkten nachzufahren.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfaßt eine Halteeinrichtung für die die tiefzufrierende biologische Substanz enthaltenden Biobehälter, in der die Biobehälter zwischen Platten angeordnet sind, sowie eine die Halteeinrichtung aufnehmende Gefricreinrichtung, die einen Behälter für flüssiges Kühlmedium aufweist. Erfindungsgemäß ist eine solche Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß die Halteeinrichtung an einer Taucheinrichtung angehängt ist, die Halteeinrichtung so ausgeführt ist, daß Planen verschiedener Wandstärken Aufnahme finden, die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material gefertigt sind und ein Rechner zur rechnerischen Bestimmung der Wandstär-

ke der Platten entsprechend einer für die in die Biobehälter abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit vorhanden ist.

Die Halteeinrichtung kann dabei beispielsweise aus zwei im Abstand voneinander angeordneten, über Stege in Verbindung stehenden U-förmigen Einsteckelementen bestehen, zwischen deren Schenkel zwei Platten aus schlecht wärmeleitendem Material mit einem dazwischen liegenden Biobehälter eingeschoben werden. Jeweils an einem Schenkel der U-förmigen Einsteckelemente können zv/ei federbelastete Hebel beweglich befestigt sein, die die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und den zwischen ihnen eingelegten Biobehälter gegen den zweiten Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes drücken. Die Schenkellange des U-förniigen Einsteckelementes entspricht dabei in etwa der Höhe der Platten aus schiecht wärmeleitendem Material.

Die Halteeinrichtung kann aber auch aus U-förmigen Klammern mit kurzer Schenkellänge bestehen, die die Platten aus schlecht wärmeleitendem Material und den zwischen diesen liegenden Biobehälter nur an deren oberen und unteren Ende umfassen. Zwischen den Schenkeln der Klammern kann dann als Druckelement eine Feder angeordnet sein.

Trotz der relativ einfachen Konstruktion solcher Vorrichtungen wird dann sicher vermieden, daß sich beim Eintauchen in flüssiges Kühlmedium zwischen den Platten aus schlecht wäi meleitendem Material und dem Biobehälter Kühlmedium ansammelt, was sonst infolge des sich ergebenden unterschiedlichen Wärmeübergangs einen ungleichmäßigen Gefriervorgang nach sich ziehen würde.

Besonders vorteilhaft erweist es sich des weiteren, wenn zwischen die Platten aus schiecht wärmeleitendem Material und dem Biobehälter dünne Metallplatten eingeklemmt sind, auf deren Außenseite, die den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist. eine Heizvorrichtung und auf deren Innenseite, die dem Biobehälter zugewandt ist, ein Thermoelement angeordnet ist, wobei das Thermoelement und die Heizvorrichtung an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit angeschlossen sind. Die Metallplatten sind dabei nicht nur als Träger des Thermoelementes und der Heizvorrichtung gedacht, sondern sie dienen gleichzeitig auch zur Formgebung des beispielsweise aus einem Kunststoffbeutel bestehendem Biobehälters und zur Homogenisierung des Wärmestromes.

Weitere Einzelheiten der Erfindung werden anhand eines in den F i g. 1 und 2 schematisch dargestellten Aiisführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, hs zeigt

Fig. 1 eine Stirnansicht einer Halteeinrichtung mit einem eingesetzten, zwischen Metallplatten und Platten aus schlecht wärmeleitendem Material eingeklemmten Biobehälter.

F i g. 2 eine Seitenansicht zur F ig. 1, wobei in beiden Figuren für die gleichen Teile die gleichen Bezugszeichen verwendet sind.

In den F i g. 1 und 2 ist mit 1 ein Behälter für flüssiges Kühlmedium und mil 2 eine nur teilweise dargestellte Taucheinrichtung bezeichnet, die beispielweise eine in verschiedenen Höhen geführte Fördereinrichtung sein kann. An die Taucheinrichtung 2 ist eine Halteeinrichtung 3 angehängi, die aus zwei im Abstand voneinander angeordneten, über einen oberen und einen unteren Steg 6, 7 in Verbindung stehenden U-förmigen F.insteekelemcntcn 4, 5 besteht. Zur Aufhängung der I lalieeinrichtung 3 an die Taucheinrichlung 2 ist in der Mitte des oberen Sieges ein Bügel 8 befestigt.

Zwischen den Schenkeln der F.insteckelemente 4, 5 ist ein mit der /u gefrierenden biologischen Substanz gefüllter Biobehiiiter i4. /. B. ein iiexibier Kunsistoffbeutel, der von einem Mctallplattcnpaar 15 und von einem Plattcnpaar 16 aus schlecht wärmeleitendem Material, wie z. B. Kunststoff, eingeschlossen ist, eingelegt. Die Wandstärk·: des Plattenpaares !6 aus schlecht wärmeleitendem Material wird dabei im voraus in Abhängigkeit der für die zu gefrierende biologische Substanz vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit rechnerisch bestimmt. Nach der errechneten Wandstärke der Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 richtet sich dann der Abstand zwischen den Schenkeln der U-förmigen Einsteckelemente 4,5.

Um zu vermeiden, daß sich beim Eintauchen der Halteeinrichtung 3 in den Behälter 1 zwischen der Oberfläche des Biobehälters 14. den Metallplatten 15 und den Platten aus schlecht wärmeleitendem Material 16 Kühlmedium ansammeln kann, drücken durch Federn 13 belastete Hebel 9,10 und 11,12, die jeweils an einem Schenkel der U-förmigori Einsteckelemente 4, 5 beweglich angelenkt sind, die eingelegten Platten und den zwischen diesen eingeschlossenen Biobehälter 14 gegen den zweiten Schenkel des U-förmigen Einsteckelementes 4,5.

Zur genauen Einhaltung einer vorgegebenen Gefriergeschwindigkeit sind die Metallplatten 15 auf ihrer Außenseite, die den Platten 16 aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist. mit einer Heizvorrichtung 18 versehen, die z. B. eine !τι Silikon-Kautschuk eingebettete Heizwendel sein kann. Die Heizvorrichtung 18 ist ebenso wie ein auf der Innenseite der Metallplatten 15 angeordnetes Thermoelement 17 an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 angeschlossen. Über die Regelungs- und/oder Steuereinheit 19 kann dann die Heizleistung der Heizvorrichtung 18 entsprechend dem Differenzwert geregelt werden, der sich aus einer an der Außenwand des Biobehälters 14 mit dem Thermoelement i7 gemessenen Temperatur und einer im voraus für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve, die der zellspezifischen Gefriergeschwindigkeit der einzugefrierenden biologischen Substanz entspricht, geregelt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen, bei dem die biologischen Substanzen in Biobehälter abgefüllt, die Biobehälter zwischen Platten gelegt und anschließend zum Tiefgefrieren mit einem Kühlmedium in Berührung gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß Platten aus schlecht wärmeleitendem Material verwendet werden und die Wandstärke der Platten entsprechend einer für die in die Biobehälter abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit rechnerisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur rechnerischen Bestimmung der Wandstärke der Platten zunächst für die Außenwand der Biobehälter eine Temperatur-Zeitkurve errechnet wird, die der vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit der im Inneren des Biobehälters vorhandenen biologischen Substanz entspricht, und daß anschließend die Wandstärke der Platten in Abhängigkeit dieser Temperatur-Zeitkurve errechnet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Biobehälter während des Tiefgefrierens von außen beheizt werden, wobei die Heizleistung entsprechend dem Differenzwert geregelt wird, der sich aus einer an der Außenwand der Biobehälter gemessenen Temperatur und der für die Außenwand errechneten Temperatur-Zeitkurve ergibt.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Halteeinrichtung für die die tiefzufrierende biologische Substanz enthaltenden Biobehälter, in der die Biobehälter zwischen Platten angeordnet sind, und mit einer die Halteeinrichtung aufnehmenden Gefriereinrichtung, die einen Behälter für flüssiges Kühlmedium aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltceinrichtung (3) an einer Taucheinrichtung (2) angehängt ist, die Halteeinrichtung (3) so ausgeführt ist, daß Platten (16) verschiedener Wandstärke Aufnahme finden, die Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material gefertigt sind und ein Rechner zur rechnerischen Bestimmung der Wandstärke der Platten (16) entsprechend einer für die in die Biobehälter (14) abgefüllte biologische Substanz vorgegebenen optimalen Gefriergeschwindigkeit vorhanden ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen die Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material und den Biobehältern (14) dünne Metallplatten (15) eingeklemmt sind, auf deren Außenseite, die den Platten (16) aus schlecht wärmeleitendem Material zugewandt ist, eine Heizvorrichtung (18) und auf deren Innenseite, die dem Biobehälter (14) zugewandt ist, ein Thermoelement (17) angeordnet ist, wobei das Thermoelement (17) und die Heizvorrichtung (18) an eine Regelungs- und/oder Steuereinheit (19) angeschlossen sind.