DE2216411B2 - Mikrocalorimetrische vorrichtung zur biochemischen analyse - Google Patents

Mikrocalorimetrische vorrichtung zur biochemischen analyse

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DE2216411B2 DE19722216411 DE2216411A DE2216411B2 DE 2216411 B2 DE2216411 B2 DE 2216411B2 DE 19722216411 DE19722216411 DE 19722216411 DE 2216411 A DE2216411 A DE 2216411A DE 2216411 B2 DE2216411 B2 DE 2216411B2
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Description

Die Erfindung betrifft eine mikrocalorimetrische Vorrichtung, wie sie im Oberbegriff des Anspruchs 1 vorausgesetzt ist.
Calorimetrische Verfahren liefern verschiedene Daten bei einer Anzahl von Analysen. Ein besonders nützliches Gebiet ist die Biochemie. Viele bekannte mikrocalorimetrische Vorrichtungen sind für solche Untersuchungen jedoch nicht zufriedenstellend, entweder weil sie wegen der einfachen Konstruktion nicht genau genug sind oder weil sie nur bei äußerst aufwendigem Aufbau eine brauchbare Genauigkeit ergeben.
Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine mikrocalorimetrische Vorrichtung relativ einfacher Konstruktion anzugeben, die bei einfacher Handhabung nützliche Wärmemessungen liefert. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist für die biochemische Analyse bestimmt.
Diese Aufgabe wird bei der eingangs genannten Vorrichtung durch die im Kennzeichenteil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst.
Die Patentansprüche 2 und 3 nennen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Ein oft beim Nachweis von Bakterien oder anderem mikrobiologischem Wachstum durch calorimetrische Verfahren anzutreffendes Problem liegt darin, daß zur gleichen Zeit wie die Bakterien andere während der Meßzeitwärme erzeugende Systeme in dem Calorimeter vorhanden sein können, beispielsweise Enzym-Substrat-Systeme oder eine oder mehrere lebende, sich aber nicht teilende Zellenpopulationen, z. B. rote und weiße Blutkörperchen. Bei der Vermehrung sich teilender, mikrobiologischer Zellen tritt stets während einer beträchtlichen Zeitspanne eine zeitliche exponentiell ansteigende Wärmeentwicklung auf, deren Geschwindigkeit in einem unmittelbaren Verhältnis zu der in dei Population vorhandenen Zellenanzahl steht. Aufgrüne der Geschwindigkeit der Wärmeentwicklung bei ver schiedenartigen Systemen ist es möglich, zwischen de auf wachsende mikrobiologische Zellenpopulationei zurückgehenden Wärmeentwicklung und der War meentwicklung anderer Populationen zu unterscheiden da die bei anderen Systemen auftretende Geschwindig keit der Wärmeentwicklung eine stetig fallende, nich aber eine steigende sein kann.
Bei der nachstehend noch näher erläuterten mikroca lorimetrischen Vorrichtung ist mindestens ein Teil dei Wandung einer isolierten Kammer porös. Als poröse isolierender Werkstoff eignet sich Polyurethanschaum stoff, der dadurch, daß 90% oder mehr der Zellei miteinander verbunden sind, eine relativ leicht! Luftströmung gestattet. In der Kammer ist eii Stützg.'ied für die zu analysierende Probe vorgesehen Ein Konditionierungsgas (meist Luft) wird vor den Einführen in die Kammer auf eine gleichmäßig vorgewähke Temperatur erhitzt und unter Überdrud in die Kammer eingeführt, so daß ein Druckgefälle übei die poröse Isolierwandung aufrechterhalten bleibt unc eine stetige Gasströmung durch die poröse Kammer wandung stattfindet. Die Gasströmung wird bei einei ausreichend hohen Geschwindigkeit gehalten - be einer bestimmten Ausführungsform mit einer Kammei mit einem Volumen von 200 dm3 wird eine Gasdurch flußgeschwiridigzeit von 7,62 m/min verwendet — unc reicht aus, um Konvektionskräfte zu überwinden. Dabe entspricht die Temperatur an der Außenwandung dei Kammer im wesentlichen der Temperatur des in die Kammer einfließenden Gases, so daß die Innenflächt der Kammerwandung dieselbe Temperatur wie dai Konditionierungsgas aufweist.
Gemäß einem besonderen Ausführungsbeispiel dei Erfindung wird das Gas durch eine Reihe vor gesteuerten Heizstufen eingeführt, deren jede Stuf« durch je eine Steuerschaltung gesteuert wird, wobei die Rückkopplung und der Verstärkungsgrad mit Bezug au die physikalischen Werte des Systems optimiert werden um eine Proportionalsteuerung und den maximaler Verstärkungsgrad zu gewährleisten. Ein Gebläse hai die innerhalb der Kammer befindliche Luft in Umlauf das Gebläse wird durch einen außerhalb der Kammei angeordneten Antrieb angetrieben — und das erwärmte Gas entweicht durch die poröse Wandung.
Weiterhin kann selbstverständlich eine Vielzah einzelner Calorimetereinheiten vorgesehen sein, wöbe jedes Calorimeter einen isolierten, zur Aufnahme der zi analysierenden Probe bestimmten Behälter, ein Tempe raturfühlglied und ein Heizelement, welches da; Zustandekommen eines Temperaturausgleichs der Pro be bei der vorgewählten Systemtemperatur beschleu nigt, umfaßt. Hierbei ist die Kammer durch einer angelenkten Deckel geschlossen, in dem die poröse Isolierwandung angeordnet ist. Die Störung bein: öffnen des Systems (Reduzierung des Luftströmungs Widerstandes) ist nur geringfügig. Nach dem Schließet des Deckels kehrt das System verhältnismäßig schnell ir den stabilen Temperaturzustand zurück. Weiterhin wire die aus der Kammer aufgesaugte Luft durch eir Schaltungsgehäuse geführt, so daß die elektronischer Bauteile bei gleichbleibender Temperatur gehalter werden.
Die hier erläuterte mikrocalorimetrische Vorrichtunf ist imstande, in einer 50 g-Wasserprobe entwickelte Wärmeleistungen unter 3 Mikrowatt zu erfassen, d. h
• als 0,1% der Leistung, die in einer Probe dieses ^1"86»«« tvoischerweise von einer wachsenden Popu-'?! mikrobiologischer Zellen erzeugt wird. Die · ng benötigt nur ein Mindestmaß an Linstellun- ! den Bedienenden. Die Vorric'.itung arbeitet und kann selbstverständlich SicherheitseinncniunBen, wie z. B Schaltungen die eine
fVctrömung voraussetzen, ehe die Heizelemente in
■ b genommen werden können, und Maximaltem-Betr'.HrfüWieder, die das System abschalten, wenn die f'fSoeratur einen vorbestimmten Wert übersteigt,
halten Nach dem Einführen eines Probenbehälters in e Calorimetereinheit stellt sich automatisch ein Sichgewichtszustand ein. Die Auswertung der Meßdaten kann selbstverständlich durch Datenverarbei-
t.mes'ysteme erfolgen.
nie erfindungsgemäße mikrocalonmetrische Vorvh,me ist nachfolgend in weiteren E.nzelhe.ten
Sand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt Pi β 1 eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung, Pie 2 eine perspektivische Ansicht einer einzelnen
nitt durch die in F i g. 1 gezeigte
ρ;» 4 eine teilweise abgebrochene Aufsicht von oben der Vorrichtung der Fig.l mit geöffnetem aus Polyurethanschaumstoff abgeschlossen.
Gemäß F i g. 1 und 3 sind die Calorimetereinheiten auf einem Stützglied 50 in der Kammer 16 abgestützt, unterhalb dessen sich ein Temperaturfühler 54, em
Luftleitgitter 56 und ein in einer Ummantelung w» angeordnetes Gebläserad 58 von 38 cm Durchmesser befindet. Letzteres ist auf einer Welle 62 angeordnet, die durch eine Isolierhülse 64 ragt und auf der eine Antriebsscheibe 66 befestigt ist, über weicne mittels
,o eines Antriebsriemens 68 ein Antrieb von einem außerhalb der Kammer 16 angeordneten Motor Ai
F?g5 einen Schnitt durch die Vorrichtung gemäß Pig lauf der Linie 5-5 der F ig. 3,
Fig 6 bis 9 die elektronische Schaltung zur QtPiierune der Heizelemente; .
StFieg K eine graphische Darstellung des typischen Ansorechverhaltens eines Heizsystems und das AusgangssTgna? für eine eine biologische Probe enthaltende uemau Fig.3 bis 5 wird Luft durch einen Einlaß 72 eingeführt und fließt durch den Kanal 74, ein erstes Gebläse 75, fünf angedeutete Heizstufen 76 bis W. denen je ein Temperaturfühlglied zugeordnet ist. ein zweites Gebläse 82 und Kanäle 84 und 86. die in die unterhalb des Gebläses 58 liegende Kammer Ib münden. Die durch die Kammer * umgewälzte Luft bewegt sich nach oben an den Zwischenwanden \S und den Stützgliedern 50 vorbei und strömt durch d« porenaufweisende Isolierwandung 90 und den Kanal Sn den Deckel 14 zur öffnung 94 die e^en Durchmesser von 10 cm hat. Die die Öffnung 94 vertassende 2, Luftströmung fließt durch eine zweite ICl cm-0 fnung 9b 5 in ein Gehäuse mit elektronischen Schaltungen hinein, das die Luft durch eine Auslaßoffnung 100 in der hinteren Wandung des Schrankkorpers 10 ver aßt Dichtungen 102 an der unteren Flache ^ Decfceh schließen die Öffnung 94 und damit die Kammer
InVIg. 4 ,st die Kammer 60 mit 40 ^Ion«ne«reinhdten 20 von oben zu sehen. Das Calorimeter^2Oa ist ein Bezugscalorimeter. dessen Thermistor m.t ein.m
FS^ iTnigTaphische Darstellung der Wärmeentwicklung für die Fälle, daß das System nur Blut bzw. Blut
untere
Wardung und die Seitenwandung
- 45 punkt 126 verbunden
Transistorverstarkers
55
■mn·
anderen Heizstufen 77 bis 80. Jede Heizeinrichtung wird durch eine besondere, je mit einem Fühlglied (z. B. Thermistor 150) ausgestattete Einrichtung gesteuert, die der Heizstufe in der Luftströmung nachgeordnet ist. Der Thermistor 150 ist in der Brückenschaltung 152 geschaltet, welcher Gleichstrom zugeführt wird. Dieser Versorgungsgleichstrom für die Brückenschaltung wird mit einem 12 Hz-Sägezahnsignal geringer Amplitude überlagert, das durch eine mit einem Unijunctiontransistor 156 bestückte Sägezahngeneratorschaltung 154 erzeugt wird. Das Brückenausgangssignal wird einem Operationsverstärker 158 zugeführt, der zusammen mit einer einen Transistor 162 enthaltenden Nulldurchgangsschaltung den Unijunctiontransistor 160 ansteuert. Die Ausgangsimpulse des Transistors 160 werden durch den Transformator 164 einem Triac 166 zugeführt, der das Heizelement 76 steuert. Die Nulldurchgangsschaltung sorgt dafür, daß der Thyristor 166 einzelne Ausgangsimpulse abgibt, die vollständige Halbwellen des Wechselstromes sind und schaltet weitgehendst jegliche hochfrequente Störung aus. Das durch die Schaltung 154 gelieferte Sägezahnsignal sorgt für eine Zeitmodulation der Leistungsimpulse des Thyristors 166 und ermöglicht den Proportionalbetrieb des Heizelementes. Der Verstärkungsgrad des Verstärkers 158 wird eingestellt, um für die jeweils gewünschte Temperatur den optimalen Betrieb zu gewährleisten.
Die Schaltung des letzten Heizelementes 88 ist in Fig.9 gezeigt. Bei diesem Steuergerät sind zwei Zweige einer temperaturempfindlichen Brücke durch zwei genau aufeinander abgestimmter Sekundärwicklungen eines Transformators 170 gebildet. Die zwei anderen Zweige sind durch ein Temperaturfühlglied 54 (einen Nickelwiderstand) bzw. einen Drahtwiderstand 174 gebildet. Die Brücke wird durch einen Rechteckwellenoszillator 176 mit einer Betriebsfrequenz von etwa 1 kHz gespeist. Das Regelabweichungsausgangssignal der Brücke wird durch einen zweistufigen, zwei Operationsverstärker 178 und 180 umfassenden Wechselstromverstärker verstärkt. Dabei wird das resultierende Signal durch einen Kondensator 182 gekoppelt. Nach synchroner Demodulation durch einen Feldeffekttransistor 184 wird das Signal über ein Filter 186 und eine Gleichstromleistungsverstärkerstufe 188 geleitet, um die letzte Heizwicklung 88 zu steuern.
Die graphische Darstellung gemäß Fig. 10 veranschaulicht den Betrieb eines typischen Calorimeterheizelementes nach dem Einlegen eines Probenbehälters 38. Beim Einlegen des Behälters 38 wird die volle Heizleistung angeschaltet. Nach einigen Minuten ist gemäß der Kurve 200 eine Abnahme der Heizleistung zu verzeichnen, während die Calorimetertemperatur (Kurve 202) sich der Grundlinie 204 (370C) nähert. Nach der Ausgleichsperiode wird das Calorimeterheizelement 34 bei Punkt 204 abgeschaltet. (Das Calorimeterheizelement ist nur in Betrieb, wenn die Temperatur des Probencaloritneters unter der des Bezugscalorimeters 20a liegt.) Beim Abschalten des Heizelementes beginnt eine Calorimetermessungsanalyse.
Wird einem typischen, zur Züchtung von Bakterien eingesetzten, sterilen Nährboden bakterienfreies Blut zugesetzt, der die zur Aufrechterhaltung des Blutzellen-Stoffwechsels notwendigen Grundstoffe und Substrate enthält, so wird durch die verschiedenen Stoffwechselvorgänge der Blutzellen Wärme erzeugt (Kurve 208).
Da es jedoch zu keiner Vermehrung der Blutzellen kommt, ist die Geschwindigkeit der Wärmeerzeugung gleichbleibend oder bei einer mit der Zeit eintretenden Verschlechterung der Faktoren sinkend. Werden dagegen lebende Bakterien dem sterilen Nährboden zugesetzt, so findet eine Bakterienvermehrung und eine gemäß Kurve 210 steigende Wärmeentwicklung bis zu dem Punkt statt, an dem die Wachstumsfaktoren weniger günstig werden, so daß nach der Spitze 212 eine sinkende Wärmeentwicklung zu verzeichnen ist.
Ein Vergleich spezifischer Bakterien ist in F i g. 11 gegeben. Die Kurve 214 stellt die wahrgenommene Wärmeentwicklung von Escherischia coli in BHI-Nährboden dar, wobei die Kurve eine positive Steigung bei 216 und ihre Spitze bei 218 aufweist Die Kurven 220 und 222 geben die wahrgenommene Wärmeentwicklung von E. coli in Thiglykollat-Nährboden bzw. von Λ-haemolytischen Streptococci in BHI-Nährboden an. Es sei darauf hingewiesen, daß jede dieser Kurven einen positiven Δ R-TeW aufweist. Verschiedene Methoden stehen zur Auswertung der Meßdaten zur Verfügung. Zu diesem Zweck läßt sich z. B. eine analoge Schaltung anwenden, um mittels eines analogen Differentiators die Ableitung der Geschwindigkeit der Wärmeentwicklung zu erzeugen. Die bei diesem Ausführungsbeispiel angewandte Methodik umfaßt die Wahrnehmung einer Änderung in der Wärmeentwicklung bei festen Zeitspannen (Δ T) Nach jeder neuen Messung wird ein Vergleich zwischen einem neuen Temperaturänderungswert (Δ R) bei dem vorhergehenden Δ Ä-Wert durchgeführt. Ein schematisch bei 123 angedeuteter digitaler Computer bearbeitet die Meßdaten der 39 Probenkanäle in einer Ausführungsform. In einer theoretischen Population sich teilender mikrobiologischer Zellen wird Wärme mit einer gleichmäßig steigenden Geschwindigkeit entwickelt, so daß jeder nacheinander kommende Δ R-Wert den unmittelbar vorhergehenden Δ R- Wert übersteigt, und so daß die Kurve eine positive, das Wachstum von Bakterien nachweisende Ableitung aufweist
Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

A/ ϊ Patentansprüche:
1. Mikrocalorimetrische Vorrichtung zur biochemischen Analyse mit einer thermisch isolierten Kammer, mit einem zu der Kammer führenden Gasleitweg, mit einer Temperatursteuerung für das der Kammer gelieferte Gas und mit einem Stützglied für eine in der Kammer zu analysierende Probe, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der thermischen Isolierung porös ist und das Gas in die Kammer unter Aufrechterhaltung einer stetigen Strömung durch die poröse Isolierung in der Kammer geführt ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Isolierung (90) sich in einem Deckei(12)der Kammer befindet.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas mittels eines Gebläses durch einzelne, in dem Gasleitweg angeordnete Heizstufen gefördert ist, die je mit einem Temperaturfühlglied ausgestattet sind, daß das der letzten Heizstufe zugeordnete Heizelement sich in der Kammer befindet, und daß eine auf die einzelnen Heizelemente ansprechende und das zugeordnete Heizelement steuernde elektronische Schaltung sich in einem Gehäuse (98) befindet, und daß das Gas nach Verlassen der Kammer über die poröse Isolierung (90) in das Gehäuse hineinfließend geführt ist.
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