-
Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch
Verteillungschromatographie das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Insulin oder
Insulinderivate der Verteilungschromatographie an einem mit Epichlorhydrin vernetzten
Dextran-Gel, dessen OH-Gruppen größtenteils alkyliert sind, in organischwäßrigen
Lösungsmittelsystemen, die neben Alkoholen mit 4-5 O-Åtomen Carbonsäuren mit 1-3
C-Atomen oderZund Ammoniak oder eine organische Base mit einem pKa-Wert zwischen
etwa 5.1 und 11 enthalten, unterwirft.
-
Unter Insulinderivaten sind solche Insuline zu verstehen, deren Ketten
verkürzt oder durch Aminosäuren oder Peptide verlängert sind. Die Verkürzung betrifft
das Aminoende der B-Kette, wo bis zu 6 Aminosäuren fehlen können, und das Carboxylende,
wo bis zu 4 Aminosäuren fehlen dürfen.
-
Die Verlängerung um einzelne Aminosäuren oder Peptidfragmente kann
sowohl an der A- wie auch an der B-Kette verliegen. An der A-Kette sind speziell
solche Verlängerungen von Bedeutung, die Teile des C-Peptids repräsentieren (vgl,
Z. Naturforsch. 24b (1969), Seite 999).jsinogruppen des Insulins können ferner acyliert,
Tyrosin kann jodiert, nitriert oder sulfatiert sein. Nichtessentielle Aulinosäuren
können durch andere ausgetauscht sein. Insuline in denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht
sind, wurden z. B.
-
in Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. Band 348 (1967), Seite 947 und
1715, Band 349 (1968), Seite 512, 1428, 1431, 1749, ferner Band 350 (1969), Seite
1480 und Band 315 (1970), Seite 263 beschrieben.
-
Ein erfindungsgemäßes Dextran-Gel ist z. B. Sephadex@ LH 20.
Erfindungsgemäße Basen sind z. B. Pyridin, Picoline, Alkyl-» Di-alkyl- oder Trialkylamine,
Morpholin, N-Alky3morpholin oder Äthanolamine.
-
Verteilungschromatographie ist ein an sich bekanntes Verfahren. Sie
wird wie jedes andere chromatographische Verfahren in Säulen ausgeführt. Auch säulenchromatographische
Reinigungsmethoden für Insulin sind schon bekannt. So lassen sich Insulinderivate
an Carboxymethylcellulose, DEAE-Cellulose oder Carboxymethyl-Sephadex trennen. Alle
diese bekannten Verfahren zeigen zwar ein hohes Auflösungsvermögen, stets muss aber
Harnstoff in hoher Konzentration zugefügt werden. Ohne Harnstoff würden sich die
zu trennenden Insulinderivate über Aggregatbildung vermischen, womit eine Auftrennung
in die einzelnen Komponenten nicht mehr möglich wäre.
-
Nur an den Molekularsieben Seplladex Zu G 50 oder G 75, einem vernetzten
Dextran-Gel, war eine gewisse Auftrennung ohne Harnstoffzusatz möglich, jedoch gelang
hier nur eine vorhältnismäßig grobe Auftrennung nach Molekülgröße, aber keine Feintrennung
verschiedenster Komponenten, wie sie die Tonenaustauscher-Chrumatographie unter
Zusatz von Harnstoff ermöglichte.
-
Die Notwendigkeit, Harnstoff zuzusetzen, hat aber zur Folge, daß ein
solches Verfahren nur zu analytischen oder präparativen Trennungen in kleinstom
Maßstab dienen kann, denn in technischem Umfang ist die Abtrennung der
enormen
Mengen Harnstoff durch Dialyse ökonomisch nicht mehr vertretbar und auch methodisch
nur schwer zu bewältigen.
-
Demgegenüber wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei hoher Trennschärfe
auf den Zusatz von Harnstoff verzichtet. Der technische Vorteil, den das neue Reinigungsverfahren
bietet, wird bei Betrachtung des Stoffdurchsatzes deutlich: In einer Säule von.
40 cm Durchmesser und 2 m Länge können innerhalb 24 Stunden 400 - 500 g Insulin
oder Insulinderivat gereinigt werden.
-
Bei der Durchführung des Verfahrens geht man so vor, daß zunächst
das Lösungsinittelgemisch, z. B. aus 4 Ltr.
-
Wasser, 0.8 Ltr. n-Butanol und o.4 Ltr. Eisessig, hergestellt wird.
Nach Vermischen der Lösungsmittel trennt sich das System in Ober- und Unterphase.
Dann läßt man Sephadex LH 20 in der Oberphase quellen, gibt dann Unterphase zu,
füllt das Gel in die Chromatographiersäule ein und läßt sodann Unterphase durch
die Säule laufen. Oberphase ("organische Phase") ist somit die stationäre, wäßrige
Unterphase die bewegliche Phase.
-
Das zu reinigende Insulin oder Insulinderivat wird in der Unterphase
gelöst, auf' die Säule gebracht und mit Unterphase eluiert. Der Austritt der verschiedenen
Eomponenten aus der Säule kann z. B. durch Messung der W-Extinktion gemessell werden.
Die einzelnen Fraktionen werden sodann nach geeigneten Methoden, z. B. Dünnschicht-oder
Papierchromatographie, Elektrophorese oder Aminosäureanalyse charakterisiert.
-
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich sowohl natürliches wie
auch synthetisches Insulin von Begleitstoffen weitgehend befreien, selbst dann,
wenn diese wie-beim
rohen synthetischen Insulin in t- aeblichem
Überschuß vorhanden sind.
-
Besondere glatt gelingt die Trennung von Insulinderivaten unterschiedlicher
Acylierungsstufe, z. B. Mono-, Di- und Tri-acyl-insulinen.
-
Auch kleine Unterschiede in physikalischen Eigenschaften reichen für
die Trennung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus. So läßt sich auf Grund unterschiedlicher
Löslichkeit glatt Insulin und Des-Phenylalanin B1-insulin voneinander trennen Diese
Wirksamkeit des neuen Verfahrens war überraschend, denn Sephadex H LH 20 ist zu
engmaschig, als daß Insulin in die inneren Bereiche des Gels eindringen önntc. Dennoch
ist die Kapazität der Trennsäulen für Insulin und Insulinderivate erstaunlich hoch,
wenn man bedenkt, daß sich der Vorgang ausschließlich an der Phasengrenzfläche auf
der Oberfläche der Gel-Partikel abspielen kann. Die Moleküle müssen in dieser Phasengrenzfläche
in sehr hoher Konzentration vorliegen. Daß unter diesen Umständen keine Aggregation
eintritt (da kein Harnstoff zur Desaggregierung benötigt wird), ist eine weitere
überraschende Eigenschaft des neuen Verfahrens, mit dem Insuline jeder Tierspezies
getrennt werden können.
-
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren näher erläutern.
-
Beispiel 1 4 Ltr. Wasser, 0.8 Ltr. n-Butanol und 0.4 Ltr. Eisessig
werden im Scheidetrichter geschütttelt. Dann läßt man einige Zeit stehen und trennt
die Phasen voneinander. 120 g Sephadex R LH 20 werden mit 150 ml Oberphase verrührt.
Nach 5 Min. gibt man 700 ml Unterphase zu. Man läßt 3 Stdn. bei Raumtemperatur stehen
und füllt eine Säule mit 2.5 cm Durcllmesser und 100 cm Länge.
-
0.5 g noch unreines Insulin werden in 5 ml Unterphase gelöst und auf
die Säule aufgetragen. Man eluiert mit Unterphase und fängt die einzelnen Fraktionen
getrennt auf. Die Hauptmenge (0-.39 g) enthält neben Insulin weitere Komponenten
nur noch in Spuren, wie aus der Disc-Eléktrophorese zu erkennen ist. Sie ist reiner
als handelsübliches Kristallinsulin und frei von höhermolekularen Komponenten.
-
Beispiel 2 Man trennt analog Beispiel 1) 0.5 g rohes Insulin in die
Komponenten auf, verwendet jedoch als Lösungsmittelsystem eine Mischung aus 5 Ltr.
Wasser, 1 Ltr. n-Butanol und 0.2 Ltr. Pyridin. Die Gehaltsbestimmung in den einzelnen
Fraktionen erfolgt durch Anfärben mit Folin-Reagens. Ausb. 0.40 g nahezu chromatographisch
reines Insulin.
-
Beispiel 3 Man reinigt analog Beispiel 1) 0.5 g rohes Insulin und
verwendet als Lösungsmittelsystem eine Mischung aus 5 Ltr. Wasser, 0.5 Ltr. Isoamylalkohol
und 0.1 Ltr.
-
Äthanolamin. Ausb. 0.38 g nahezu chromatographisch reines Ingulin.
-
Beispiel 4 0.7 g N@B1-Trifluoracetyl-iasulin, hergestellt "nalug Belg.
pat. 770,73 durch Umsetzung von B0C2-Insulin mit Trifluoressigsäure-phenylester
und Abspaltung der BOC-Gruppen durch Trifluoressigsäure'werden nach Beispiel 1)
gereinigt. Man erhält neben 57 mg Insulin und 70 mg nichtidentifizierten Nebenprodukten
550 mg reines N@B1 -Trifluoraeetyl-insulin, das in der Papierelektrophorese bei
pH 2 einheitlich ist.
-
Beispiel~ 5 o.6 g NαB1 -Pheltrlthiocarbamoy1-insulill (Ptc-Insulin),
hergestellt nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), Seite 741, werden
analog Beispiel 1) chromatographiert. Man erhält 360 mg reines 6 Insulin, 180 mg
NαA1, NαB1-Die-Pte-Insulln und 25 mg NαA1-Pte-Insulin.
-
Die Vorbindungen werden durch Edman-Abbau und auschließende Aminosäureanalyse
identifiziert.
-
Beispiel 6 131 0.5 g Des-Phenylalanin Insulin, hergestellt nach DOS
2 005 658 werden analog Beispiel 1) chromatographiert.
-
Man erhält 0.42 g reinstes Des-Phenylalanin R1-Insulin, daneben 50
mg Insulin, das im Ausgangsprodukt noch vorhanden war.
-
Beispiel 7 0.5 g rohes Des-(Phe-Val-Asn)B1-3-[Pyr4]insulin, hergestellt
nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 7, werden analog Beispiel
1) chromatographiert.
-
Man findet neben 0.240 g reiner Verbindung 0.210 g Des-(Phe-Val)B
1-2 insulin. Die Identifizierung der Verbindungen gelang durch Papierelektrophorese
und Aminosäureanalyse.
-
B e i s p i e l 8 0.5 g NαB1 -Lysyl-insulin, hergestellt nach
Belg. Pat.
-
770.758 werden analog Beispiel 1) chromatographiert.
-
-Man erhält 0.41 g der reinen Verbindung, die durch Papierelektrophorese
und Aminosäureanalyse charakterisiert wird.
-
Beispiel 9 1.0 g rohes synthetisches Insulin, hergestellt durch Kombination
der beiden Ketten analog Z. NAturforsch.
-
24b (1969), Seite 1127, wird analog Beispiel 1) in 5 ml Unterphase
suspendiert. Man filtriert nach ein stündigem Rühren die nicht gelösten Anteile
ab und cXlromatogrphiert analog Beispiel 1). Man erhält 46 mg Insulin, das unter
den üblichen Bedingungen kristallisiert und eine biologische Wirkung von 22-24 I.
E./mg besitzt.
-
B e i s p i e l 10 0.5 g NαA1-Arginyl-insulin, hergestellt nach
Hoppe Seylerts Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite 719, werden analog Beispiel 1
chromatographiert. Man erhält aus dem Rohprodukt 45 mg der reinen Verbindung mit
korrekter Aminosäureanalyse und einer biologischen Wirkung, die der in der Literatur
beschriebenen sogar etwas überlegen ist.