DE2209834A1

DE2209834A1 - Herstellung eines saccharaseinhibitors

Info

Publication number: DE2209834A1
Application number: DE2209834A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Frommer; Walter Dr Puls; Delf Dr Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-01
Filing date: 1972-03-01
Publication date: 1973-09-06
Also published as: ZA731395B; SE407810B; JPS4898089A; DE2209834C3; DD104553A5; AT319172B; PL92401B1; LU67106A1; NO136498B; US4019960A; CA992017A; CH576522A5; AU469493B2; KR780000002B1; NO136498C; FR2174239B1; IE37331L; NL175318C; IE37331B1; NL7302652A

Description

Patente, Marken und Lizenzen

Si/MH Herstellung eines Saccharase-Inhibitors

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0, britische Patentanmeldung No. 59 939/71) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinorayceten Inhibitoren von Glycosidhydrolasen, und zwar insbesondere Inhibitoren für Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 28 - 38 der genannten deutschen Patentanmeldung, wird die Gewinnung eines derartigen Amylase-Inhibitors aus dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50 beschrieben.

Die Kulturlösungen des Stammes SE 50 besitzen oft auch eine geringe saccharaseinhibitorische Wirksamkeit.

Die Gewinnung und Reindarstellung des gebildeten Saccharase-Inhibitors wird jedoch sehr stark erschwert durch das Vorhandensein erheblicher Amylase-Inhibitor-Mengen in der Kulturlösung.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren, bei dem es gelingt, die Bildung von Amylase-Inhibitor zu unterdrücken

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bei gleichzeitiger Förderung der Bildung von Saccharase-Inhibitor. Diese Effekte werden durch die folgenden Maßnahmen erreicht, die erfindungsgemäß entweder einzeln oder miteinander kombiniert angewandt werden:

1. Man verwendet eine stärkefreie Nährlösung.

2. Man fügt Maltose zur Nährlösung zu.

3. Man bricht die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saccharase-Inhibitor ab.

Ad 1 ■. Die Nährlösungen müssen stärkefrei sein. Man erhält so nach Optimierung Nährlösungen, z. B. der Zusammensetzung 3,5 i* Glucose, 0,5 i° Caseinhydrolysat, 1,3 9^ Hefe-Extrakt, 0,3 # K₂HPO₄, 0,3 ^ CaCO₃; pH mit KOH vor Sterilisation auf 7,8 eingestellt, die nach mehrtägiger Fermentation mit dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50, der im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, unter der Nr. CBS 961.70 hinterlegt wurde, Kulturbrühen ergeben, die über 10 SIE/ml enthalten. Bei einem Gehalt von 300 - 700 AIE/ml (Amylase-Inhibitor-Einheiten) ergibt sich ein SIE/AIE-Verhältnis von 15 x 10"^ 30 χ 10~⁵. (f = SIE/AIE χ 10⁵)

Ad 2. Man kann die Produktion von Saccharase-Inhibitor noch erhöhen, wenn man der Nährlösung Maltose zusetzt. Gibt man z. B. in oben erwähnte Nährlösung 1,5 9^ Maltose, so erhält man Kulturbrühen mit einem Gehalt von z. B. 16 - 18, ja bis zu 24 SIE/ml.

Ad 3. Entscheidend für das SIE/AIE-Verhältnis ist die Dauer der Kultur. Bricht man die Kultur kurz vor oder gerade beim Erreichen des maximalen SIE-Gehaltes ab, was je

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nach Beimpfung schon bei 1,5- bis 2tägiger Fermentation der Fall sein kann, so erhält man f-Werte bis zu

180.

Anstelle des~Stammes SE 50 können erfindungsgemäß auch dessen Mutanten und Varianten, z. B. der Stamm SE 50/13 (CBS-Nr. 614.71), verwendet werden.

Die Gewinnung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus den entsprechend fermentierten Kulturlösungen geschieht entweder durch Konzentration der Kulturbrühen im Vakuum auf 1/1O - 1/20 des ursprünglichen Volumens mit anschließender Lyophilisation oder durch Fällung der konzentrierten Lösungen mit 4-10 Volumenteilen organischen Lösungsmittels wie Alkoholen bzw. Ketonen, vorzugsweise mit 5-9 Volumenteilen Aceton, oder besonders einfach durch Adsorption des inhibierenden Prinzips aus der neutralen Kulturlösung an 0,5 - 4 $, vorzugsweise 1 - 2 <fo_t Aktivkohle und anschließende Desorption mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton besonders bei sauren pH-V/erten, vorzugsweise mit 50 ^igem Aceton bei pH 2 - 3. Das Desorbat wird anschließend im Vakuum auf 1/50 - 1/200, vorzugsweise 1/100, des Ausgangsvolumens (der Kulturlösung) eingeengt und anschließend mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, gefällt. Allgemein wird zur Gewinnung reinerer Präparate eine Voradsorption der die Kulturlösung verunreinigenden braunen Farbstoffe an 1 - 2 fo Aktivkohle bei sauren pH-Werten (pH-Werte von 1-4, vorzugsweise 2-3) vorgenommen, bei denen die Adsorption des Wirkstoffes überraschenderweise noch nicht in nennenswertem Umfang stattfindet.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen des Verdauungstraktes nach folgendem Schema

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Saccharase

Saccharose ^> Glucose + Fructose

bewirkt -werden. Diese Kyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alinentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und verminderten Fettabbau führt.

Die erfindungsgemäiBen, nach obigen Methoden gewonnenen und isolierter. Saccharase-Inhicitoren vermindern die alinentare Hypergivkäinie und Hyperinsulinänie nach Belastung von Ratten · mit Saccharose erheblich.

Weiter ist bekannt, daß Piaries nach Genuß von saccharosehaltigen C-enu.i- und Nahrungsmitteln besonders stark und häufig vcrkonnit ^z. 3. V/. Gold: Advances in Applied Microbiology i_! (1969) 135 - 157.7· Eine Hennung der Saccharosespaltung durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren vermindert die Bildung kariosener Stoffe.

Diese Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen:

Adiposixas, Hyperlipänie (Athercsklerose), Diabetes, Prädiabetes, Karies.

Dosierung: 100 - "10 000 SIE ein oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.

ZurereitunrTsforr.en: Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zus.-rfcs zu saccharosehaltigen Lebensund/cd er GenuQmittein.

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BAD ORIGINAL Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50 fi inhibieren. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 yu Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als /uVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsaure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als yuVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amyläselösung (20 - 22 AE/ml) mit 0-10 /Ug Inhibitor oder 0-20 zug der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCIp pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35 0 äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 C vorgewärmten 1 % Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35⁰C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in CoIowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band _1_, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

Inhibitor +

AE ++

+ bezogen auf Trockensubstanz
++ AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie

aufgetragen, der 50 # Hemmungepunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

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Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50 $> inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 yuMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die yuMol gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung ' mit 0-20 /ug Inhibitor oder 0-20 /ul der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriuminaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml auf 35 C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natri=. ummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharasereäktion durch Zugabe von 1 ml

2)
Glucoseoxidasereagens ' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50 # H₂SO. zugesetzt und bei 545 mn gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung

' Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. J_2, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

2)
¹ Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg GIu= coseoxidase (Pa. Boehringer Nr. 15423 EGAB) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7 und anschließende» Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton 100 + 8 g 95 # Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlosung (260 mg o-Dianisidin 2 HCl in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0,1 #iger wäßriger Peroxide= selösung (Pa. Boerhinger Nr. 15302 EPAP) hergestellt.

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wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase

erechnet und aus dem 50 i» Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Beispiel 1

Beimpft man I-Liter-Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3,5 °fi Glucose, 0,5 i° Caseinhydrolysat, 1,3 $> Hefe-Extrakt, 0,3 ^ CaCO₅, 0,3 1* K₂HPO., pH vor der Sterilisation mit KOH auf 7,8 eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes SE 50 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3 i> Glycerin, 3 i> Sojamehl, 0,2 $ CaCO^, gewonnen durch Inkubation auf einer Rundschüttelmaechine bis 28°C, bebrütet bei 24⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 3-tägiger Inkubation 9,1 SIE/ml und 24O AIE/ml und nach 4-tägiger Inkubation 10,4 SIE/ml und 675 AIE/ml enthält.

Beispiel 2

Gibt man einer Nährlösung nach Beispiel 1 Maltose in verschiedenen Konzentrationen zu, beimpft und inkubiert nach Beispiel 1, so erhält man folgende Ausbeuten an SIE/ml und AIE/ml:

Maltose konzentration *	nach 3 AIE/ml	Tagen SIE/ml	nach 5 AIE/ml	Tagen SIE/ml
0	363	11,2	444	8,8
0,5	479	12,7	614	11,3
1,0	383	13,6	688	12,5
1,3	337	15,7	725	12,7
1,8	274	16,6	678	14,4
2,2	287	16,8	600	15,5
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Beispiel 3

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung nach Beispiel 1, die zusätzlich 1,3 $ Maltose enthält, so erhält man eine KuItürbrühe, die nach 2-tägiger Fermentation 14,4 SIE/ml und 81 AIE/ml und nach 4-tägiger Fermentation 14,5 SIE/ml und 580 AIE/ml enthält.

Beispiel 4

Beimpft man 1-Liter-Erlenmeyerkolben, die 120 ml einer Nähr lösung der Zusammensetzung 3 Ί» Glucose, 1 fo Maltose, 0,5 # Caseinhydrolysat, 1,3 1» Hefe-Extrakt, 0,3 % CaCO₅, 0,3 # K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit Na₂CO, auf 7,2 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes SE 50 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3 # Glycerin, 3 # Sojamehl, 0,2 j6 CaCO,, gewonnen durch Inkubation auf einer Rundschüttelmaschine bis 28° C, bebrütet bei 24⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 4-tägiger Inkubation 22 SIE/ml und 500 AIE/ml enthält.

Beispiel 5

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten braunen Kulturlösung des Stammes SE 50 mit 22 000 SIE/Liter wurde mit halbkonz. HNO, auf pH 2,5 eingestellt und mit 5 g Aktivkohle (Pa. Merck) versetzt und 10 Minuten gerührt. Man zentrifugierte 15 Minuten bei 10 000 Upm und neutralisierte den klaren gelben Überstand mit Ammoniak. Danach wurde am Rotationsverdampfer bei 20 Torr auf 50 ml einrotiert und diese konzentrierte Lösung mit 50 ml Aceton zur Ausfällung inaktiver Anteile versetzt. Das klare Filtrat wurde in 400 ml Aceton unter Rühren eingetropft und der ausfallende Niederschlag auf einer Nutsche gesammelt, .

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mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Ausbeute: 1,4 g mit 6 000 3IE/g = 70 $ Ausbeute, bezogen auf Aktivität.

Beispiel 6

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten Kulturlösung des Stammes SE 50 mit 22 000 SIE/Liter wurden nach Beispiel 5 aufgearbeitet, jedoch nicht mit Aceton, sondern mit Äthanol

gefällt.

Ausbeute: 0,6 g mit 7 000 SIE/g = 38 fi Ausbeute, beaogen auf

Aktivität.

Beispiel 7

1 Liter einer analog Beispiel 4 fermentierten dunkelbraunen Kulturlösung (21 000 SIE/Liter) wurde mit halbkonz. Salpetersäure auf pH 2,5 eingestellt, mit 10 g Aktivkohle (Pa. Merck) und 10 g des PiIterhilfsmitteis Clarcell versetzt und 10 Minuten gerührt. Man saugte über eine mit einer 1 - 2 cm hohen Clarcellschicht versehene Nutsche ab und neutralisierte das Piltrat mit Ammoniak. Der Filterkuchen wurde verworfen. Zum neutralen Piltrat (19 000 SIE/Liter) wurde 1,5 & Aktivkohle zugesetzt und 10 Minuten gerührt, danach erneut abgenutscht. Das Piltrat enthielt noch ca. 10 5^ der Aktivität und wurde verworfen. (Soll diese Restaktivität mitgewonnen werden, so adsorbiert man nochmals mit 0,5 $ Aktivkohle und vereint die Kohlerückstände.) Der die Saccharaseaktivität enthaltende Kohlerückstand wurde mit wenig Wasser gewaschen und anschließend 3mal mit je 50 ml 50 ^igem Aceton pH 2,5 (HCl) zur Desorption der Aktivität 10 Minuten gerührt. Danach wurde jedesmal abgenutscht und die drei Desorbate vereinigt. Man engte im Rotationsverdampfer auf 10 ml ein und versetzte das zähflüssige Konzentrat mit dem gleichen Volumen (10 ml)

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Methanol unter Rühren. Der ausgefallene Niederschlag wurde abzentrifugiert. Die klare, gelbbraune, 50 $ methanolische Lösung wurde dann in 250 ml (= 12,5 Vol.) absolutes Aceton unter Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag setzte sich gut
ab, er wurde nach dem Abdekantieren des tiefgelben Überstanden mit absolutem Aceton aufgenommen und gewaschen. Es wurde abgenutscht und noch je einmal mit absolutem Aceton und Äther
nachgewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Ausbeute: 850 mg mit 12 500 SIE/g = 51 # Ausbeute (bezogen auf Einheiten in der Kulturbrühe).

Tabelle 1 zu Beispiel 7
(Aktivitätsausbeuten der Aufarbeitung)

Aufarbeitungs- VoIu- SIE/L

schritt men (ml)

AIEA

χ 10

SIE SIE-

Ausbeute

1000

45 45 45

19000 0.4x10^l

2000

260000 3.5x10*

Originallösung 1000 21000 0.5x10

nach 1. Aktivkohle-Adsorpt. 1000 (pH 2,5)

nach 2. Aktivkohle-Adsorpt. (pH 7,0)

1. Desorbat

2. Desorbat

3. Desorbat

Einrotiert auf 10 ml

50% Methanolfällung (filtriert) Überstand der Acetonfällung

42 21000 100

92000

2x10

30000 0.75x10*

10 1500000 22x10'

18 730000 12x1O¹

260

8400 10) Niederschlag 0.85g 12500/g 0.22x10⁶/g

48 19000

90

(verwor-2000 fen:

75 11500 55"!

46 4100 19,5?81

40 1350 6,5j

68 15000 72

61 13200 63

(verwor-2200 fen: 10Jt)

56 10600 51

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Beispiel 8

Versuchsanordnungen zum Wirkungsnachweis von Saccharase-Inhibitoren an Ratten.

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhalten nüchterne Ratten (n = 6) 2,5 g/kg
Saccharose p. os. 6 andere Ratten erhalten zusätzlich zur Saccharose den Saccharase-InhiMtor, hergestellt analog
Beispiel 5, in der angegebenen Dosierung. Die Blutglucose und das Seruminsulin werden in den angegebenen Zeitintervallen nach Saccharoseapplikation untersucht. Die Blutproben werden aus dem retroorbitalen Venenplexus gewonnen. Blutglucose wird im Auto-Analyzer ^Technicon ^ , nach Hoffman: J. biol. Chem. 120, 51 (1937J7» Seruminsulin nach der Methode von Haies und Rändle: Biοchem. J. 88, 137 (1963)
bestimmt.

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Tabelle 1 zu Beispiel 8

Durchschnittliche Blutglucosewerte in mg/100 ml - Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose - Wirkstoff analog Beispiel 5.

Dosis/kg p. os 10 20 30 60 120 Min.

Sac^ar^e^{Ohne 6?} ^± ⁷'¹ . . 72 ± 4,6 68 ± 5,3 66 ± 5,0 71 ± 3,3 iaSSarose^ 134 ±15 HO ±16 126 ±12 117 ±20 103 ±3,0

100 SIE in · ₃₆ + + _{6 2} + ^_{6 2} + 95 ± 12

Saccharose ======? ======*= i=====*= ^ ii.2

O P < 0,05 ===== P <0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose

σ> Tabelle 2 zu Beispiel 8

.* Durchschnittliche Seruminsulinwerte in /uE/ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen _w Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose ± Wirkstoff analog Beispiel 5.

Dosis/kg p. os 10 20 30 60 120 Min.

Sa?cSarise^Ohne 8,8 ± 1,8 9,8 ±1,4 10,8 ±2,3 10,7 ± 4,6 8,1 ± 0,7 Saccharole^mlt 22,2 ±11 35,3 ±14 19,3 ± 5,0 16,7 ±5,3 8,1 ±1,1 100 SIE in 9_Χ9_±_4_Χ3 11.1 ± 3.5 ZjJLL=*= ^U»8 ± 3,8 10,2 ± 2,8 Saccharose ~ ~* ~ tsj

P < 0,05 — P <0,01 ===== ρ < 0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose ο

CD OO CJ

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Claims

Patentansprüche

1) Verwendung des Actinoplanaceen-Stammes SE 50 sowie seiner Mutanten und Varianten zur Gewinnung von Saccharase-Inhibitoren.

2) Verfahren zur Herstellung von Saccharase-Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man den Actinoplanaceen-Stamm SE 50 in einem stärkefreien Nährmedium kultiviert, und aus dem Nährmedium die Inhibitoren nach an sich bekannten Methoden gewinnt.

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Maltose zusetzt.

4) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saecharase-Inhi·:■·»■*-or abbricht.

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