DE2158125A1

DE2158125A1 - Diagnostisches mittel zum nachweis von ketonkoerpern in koerperfluessigkeiten und verfahren zur herstellung desselben

Info

Publication number: DE2158125A1
Application number: DE19712158125
Authority: DE
Inventors: Otto Dr Rer Nat Hoefele; Hans-Georg Dr Rer Nat Rey; Peter Dr Rer Nat Rieckmann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1971-11-24
Filing date: 1971-11-24
Publication date: 1973-05-30
Also published as: JPS4863791A; GB1369138A; DE2158125B2; FR2166957A5; JPS5321319B2; IT971112B

Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH 16 82

Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketönkörpern in Körperflüssigkeiten und Verfahren zur Herstellung desselben

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern, insbesondere von Aceton und Acetessigsäure, in Körperflüssigkeiten, insbesondere Harn _t sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.

Eine Reihe von diagnostischen Mitteln der genannten Art, die praktisch ausnahmslos auf der sog. Probe nach Legal

beruhen, sind bekannt, In der ärztlichen Praxis.werden %

diese diagnostischen Mittel häufig angewandt, da das Auftreten von Aceton bzw. Acetessigsäure im Urin ein Hinweis auf Diabetes mellitus sein kann.

Die Legal'sehe Probe, d. h. die Bildung einer kirschroten bis violetten Farbe bei der Reaktion von Keton mit Nitroprussid-Natrium in alkalischer Lösung, ist seit langem bekannt, konnte jedoch zunächst nur mit frisch hergestellten Lösungen durchgeführt werden, da sich das Nitroprussid-Natrium bei längerem Kontakt mit alkalischen Medien zersetzt. Durch das US-Patent 2 509 140 ist es bekannt geworden, dem Reaktionsgemisch eine niedere.aliphatische Aminosäure, ^ wie z. B. Glycin oder Alanin, zuzusetzen und die Verschiedenen Komponenten zur einfacheren Handhabung in trockenem'Zustand zu Tabletten zu verpressen. In dem deutschen Patent Nr. 1 153 920 wurde erstmals ein Nitroprussid-haltiges Reagenz auf einem saugfähigen Träger imprägniert, welches jedoch durch einen Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 6,5 - 7,5 abgepuffert sein soll. Bei diesem pH-Wert ist das Reagenz ausreichend stabil, jedoch nur noch zum Nachweis von Acetessigsäure und nicht mehr zum Nachweis Von Aceton geeignet. Ein auch für den Nachweis von Aceton brauchbares diagnostisches Mittel in Form eines saugfähigen Trägers wurde erstmalig in der deutschen Auslögeschrift 1 256 920 beschrieben.

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Gemäß diesem Vorschlag werden die alkalischen Bestandteile in wässriger Lösung auf den Träger aufimprägniert und in einem weiteren Schritt das Natrium-Nitroprussid in einem organischen Lösungsmittel, das zusätzlich noch größere Mengen eines organischen filmbildenden Polymeren enthält, aufgetragen. Das filmbildende Polymere bewirkt im : trockenen Zustand eine physikalische Trennung der Komponenten auf dem saugfähigen Träger. Es stellt einen gewissen Nachteil dieser Teststreifen dar, daß nach dem Eintauchen in die Testflüssigkeit die Reaktionskomponenten durch das filmbildende Polymere erst zusammendiffundieren müssen, bevor eine Reaktion eintreten kann. Zusätzliche Netzmittel scheinen diesen Nachteil etwas zu beheben.

Überraschenderweise ist es uns gelungen, ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonen zu finden, bei dem Natrium-Nitroprussid _fein alkalischer Puffer und eine Aminosäure direkt auf einen saugfähigen Träger imprägniert sind, ohne daß eine physikalische Trennung durch einen organischen Filmbildner oder einen Zusatz von Netzmitteln notwendig ist · Ausgedehnte Versuche haben gezeigt, daß von den verschiedenen für die Legal'sehe Probe bisher vorgeschlagenen Puffern im Sinne unserer Erfindung ausschließlich das Tetranatriumsalz der Athylendiaminotetraessigsäure verwendbar ist. Weiterhin muß das Natriumnitroprussid aus einer Lösung in Dimethylformamid oder Dimethylformamid-Alkohol imprägniert werden, um den erfindungsgemäßen Effekt zu erreichen. Es ist vorläufig noch nicht ganz klar, worauf die spezielle Wirkung des Lösungsmittels, das ja beim Trocknungsvorgang wieder entfernt wird, beruht, jedoch haben andere Lösungsmittel, wie z. B. reiner Alkohol, nicht die gleiche Wirkung. Sowohl mit den anderen Puffersystemen als auch mit anderen Lösungsmitteln wurden ausschließlich leicht zersetsliche und damit unbrauchbare Indikatorsysteme erhalten.

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Als wasserlösliche, niedere Aminosäure haben sich besonders Glycin und Alanin bewährt. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Aminosäure zusammen mit dem Tetranatriumsais der Äthylendiaminotetraessigsäure in wässriger Lösung aufzutragen, wobei 100 ml Imprägnierlösung,ca. 20 - 40, . vorzugsweise etwa 27 - 38 g Puffer und 10 - 20, vorzugsweise etwa 13 - 19 g Aminosäure enthalten.

Das Natriunnitroprussid wird in einer Menge von ca. 0,5 5 g, vorzugsweise.etwa 1 g, in 100 ml Imprägnierlösung gelöst, wobei die Imprägnierlösung 0 - 80 ml Alkohol und 20 - 100 ml Dimethylformamid enthält, bevorzugt wird ein Gemisch mit 50 - 70 ml Methanol und 50 - 30 ml Dimethylformamid.

Als saugfähige Träger kommen prinzipiell alle für ähnliche Zwecke bekannte infrage. Normale Filterpapiere haben jedoch den Nachteil, daß sie durch die hohe Konzentration an stark alkalischen Puffer etwas brüchig werden. Besonders bewährt haben sich deswegen Cellulosevliese, die mit Kunstfasern verstärkt sind und Kunstfaservliese, insbesondere auf Basis von Polyamid.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis" von Ketonen bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit Nitroprussidnatrium, einer alkalischen Puffersubstanz, und einer wasserlöslichen niederen Aminosäure imprägniert ist, ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt die Aminosäure zusammen mit dem Tetranatriumsalz der Athylendiaminotetraessigsäure als Puffersubstanz in wässriger Lösung auf den Träger aufgebracht und getrocknet wird und dann in einem zweiten Schritt das.Nitroprussidnatrium in einem Lösungsmittelgemisch aus einem niederen Alkohol und Dimethylformamid aufgetragen und getrocknet wird.

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In den folgenden Beispielen werden die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel näher erläutert:

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•Beispiel 1

Filterpapier Schleicher und Schüll Nr. 601 wird mit einer Lösung von 25,0 g Glycin und 36,3 g Äthylendiamintetraacetat (Tetranatriumsalz) in 100 ml destilliertem Wasser imprägniert und bei 100°C getrocknet. Danach wird mit einer Lösung von 1,0 g Nitroprussidnatrium in 40 ml Dimethylformamid und 60 ml Methanol nachimprägniert und bei 80⁰C getrocknet, Mit diesem Testpapier lassen sich mindestens 5 mg Acetessigsäure oder 20 mg Aceton in 100 ml Urin innerhalb von 15 - 30 Sekunden durch eine violette Färbung nachweisen.

Dreitägiges Aufbewahren in feuchter Luft (52% relative Feuchte) beeinträchtigt die Empfindlichkeit nicht» Im Gegensatz hierzu v/erden die folgenden Testpapiere unter diesen Bedingungen fast völlig zerstört:

Filterpapier Schleicher und Schüll Nr. 601 wird mit Lösungen von xg Glycin und yg Puffer in 100 ml destilliertem" Wasser imprägniert, getrocknet, mit einer Lösung von 1,0 g Nitroprussidnatrium in 40 ml Dimethylformamid und 60 ml Methanol nachimprägniert und erneut getrocknet.

X	0	y	Puffer
25,	1	2ß,0 12,0	Tr i na t r i um ρ h ο 8 ρ h α t (Hydra Dinatriumhydrogenphosphat, umsoorfrei
-11,	0	32,4	Diruilr iumh yd ro geophon ρ hat
10,	0	5,0	Na tr i-umtotrnborat
25,	30,0	Natriumcarbonat

1 VJV

RAD

Beispiel

Cellulose-Polyvinylchlorid-Mischvlies VS 446 (Binzer) wird mit einer Lösung aus 18,7 g Glycin, 38,5 g
Äthylendiamiii Letraacetat (Tetranatriumsalz) und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt, vorimprägniert und bei 100°C getrocknet. Danach wird mit einer Lösung aus 1 g Nitroprussidnatrium, 40 ml
Dimethylformamid und 60 ml Methanol nachimprägniert und bei 80°C getrocknet. Acetessigsäure bzw. Aceton in Urin geben mit diesem Teststreifen violette
Färbungen innerhalb 15-30 Sekunden. Die Nachweisgrenze liegt bei ca. 5 bzw. 20 mg%.

Teststreifen aus Polyamidvlies FT 2114 (Kalle) und aus Polyamid-Polyester-Mischvlies Suprotex (Kalle) haben praktisch die gleichen Eigenschaften wie die oben
erwähnten Teststreifen.

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Claims

Γ a t α η t a η s ρ r ü c h e

1» Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis von Ketonen bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit Nitroprussidnatrium, einer alkalisehen Puffersubstanz und einer wasserlöslichen, niederen Aminosäure imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt die Aminosäure zusammen mit dem Tetranatriumsalz der Äthyl endiamino-tetraessigsäurc als Puffersubstanz in wässriger Lösung auf den Träger aufgebracht und getrocknet wird und dann in einem zv/eiten Schritt das Nitroprussidnatrium in ein Lösungsmittelgemisch aus einem niederen Alkohol und Dimethylformamid aufgetragen und getrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Imprägnierlösung 10-2Og Aminosäure und 20 - 40 g Puffer auf 100 ml Wasser und die zweite Lösung 0,5 - 5 g Nitroprussid, 2O - 80 ml Alkohol und 8O - 20 ml Dimethylformamid auf 100 ml Lösung enthält.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als niederer Alkohol Methanol verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Glycin oder Alanin ist.
5. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonen bestehend aus rdnem saugfähigen Träger, der mit Nitroprussidnatriiini, einer alkalischen Pufίersubstanz und einer wasserlöslichon niederen Aminosäure imprägniert ist, dadurch gokonnzeichnet, daß es nach einem der / Vorfahren rjomiiß oinem der Ansprüche 1-4 herqesteJ. .11 ist.

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