DE2129661B2 - Verfahren und Mittel zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine einfache zuverlässige Methode zur Bestimmung der Aktivität oder Konzentration von hydrolysierenden Enzymen, wie beispielsweise von Endoenzymen, welche Polysaccharide, Proteine und verschiedene Ester hydrolysieren, und ein zu ihrer Durchführung geeignetes Mittel.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen bekannt. Alle diese Verfahren erfordern jedoch die Anwendung verschiedener Reagenzien sowie Pipettierungsschritte oder die Benutzung aufwendiger Apparaturen oder beides.

So ist z. B. aus der US-PS 3089828 ein Verfahren bekannt, bei dem in eine Lösung des zu bestimmenden proteolytischen Enzyms ein fester Körper aus vcrnetzter Gelatine mit bestimmten Abmessungen gebracht und dann die Dimcnsionsverklcinerung des Körpers als Funktion der Zeit bestimmt wird. Dieses Verfahren erfordert einen sehr beträchtlichen Zeitaufwand und das Ergebnis läßt sich nur schwierig auswerten. In vielen Fällen ist es jedoch wichtig, aufgrund einer gaiv einfachen und ohne besondere Hilfsmittel durchführbaren Methode eine rasche und zuverlässige Bestimmung durchzuführen, beispielsweise im lalle mancher Krankheiten, bei denen i-iiie rasche Entscheidung über die zu ergreifenden Maßnahmen unbedingt geboten ist, diese Entscheidung aber von einer AktwtätsbestJmmung eines Enzyms, beispielsweise von Amylase beim sogenannten »akuten Oberbauch«, abhängig ist.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines solchen einfachen und trotzdem zuverlässigen Verfahrens, welches keiner besonderen ,Hilfsmittel bedarf und ohne die Verwendung zusätzliche-" Reagenzien u. dgl. eine rasche und zuverlässige Bestimmung der erwähnten Enzyme ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das in den-Patentansprüchen definierte Verfahren und Mittel zur Durchführung des Vefahrens gelöst.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren steht die Größe des nicht mehr markierten Fleckens in exakter Relation zur Aktivität bzw. Konzentration des aufgebrachten Enzyms. Dies ist überraschend, weil eine Diffusion erst nach der Spaltung beginnen kann und nicht zu erwarten war, daß sowohl Spaltungsgeschwindigkeit als auch Diffusionsgeschwindigkeit zueinander in solcher Beziehung stehen, daß die Größe des Fleckens der Aktivität des Enzyms exakt entspricht. Als Trägermatrix im Rahmen der genannten Schicht kommen Agargel, Agarosegel, Stärkegel, Quaran, Gelatine, Polyacrylamidgel, Silikagel oder andere Gelarten oder anderes, die Diffusion erlaubendes Material, wie z. B. Cellulose, Filterpapier usw. in Frage. Bevorzugt wird Agargel.

Das Substrat, welches in wasserunlöslicher Form vorliegen muß, wird mit einem Farbstoff, einer radioaktiven Substanz od. dgl. markiert und mit der Matrix gemischt verwendet. Bei der Einwirkung des hydrolysierenden Enzyms wird das unlöslich gemachte Substrat abgebaut zu löslichen Bruchstücken, welche innerhalb der Matrix diffundieren. Wird daher beispielsweise eine Enzymlösung auf eine derartige Schicht gebracht, weiche ein durch Reaktion mit einem Farbstoff gefärbtes und beispielsweise durch Vernetzung unlöslich gemachtes Substrat für das Enzym enthält, so spaltet das Enzym das unlösliche Substrat in lösliche Bruchstücke, welche durch die Trägermatrix abdiffundieren. Auf diese Weise entsteht eine nicht mehr gefärbte fleckenartige Fläche in der Schicht, deren Größe in direkter Relation zur Aktivität bzw. Konzentration des Enzyms steht. Da die Enzymlösung einfach in Form eines Tropfens aufgebracht werden kann, bildet sich nach einer bestimmten Zeitdauer ein runder Fleck, dessen Durchmesser einfach gemessen werden kann und direkt der gesuchten Aktivität des Enzyms proportional ist.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren tritt also eine Reaktion zwischen dem Enzym und dem unlöslich gemachten Substrat auf unter Freisetzung löslicher markierter Bruchstücke des Substrates, welche die bestimmbaren Gruppen oder Atome enthalten. Die Bruchstücke trennen sich von dem noch nicht abgebauten Substrat durch Diffusion innerhalb der Trägermatrix und sobald an einer bestimmten Stelle das gesamte unlösliche Substrat gespalten ist, wiru diese Stelle vollständig entfärbt.

Das unlöslich gemachte Substrat für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung ist entweder eine an sich wasserunlösliche und gefärbte Substanz, welche beispielsweise mit warmer Agarlösung zur Herstellung der Schichtmasse gemischt wird, oiler wird wasserunlöslich gemacht durch chemische Hindi.ng an einen unlöslichen Träger, der dann seinerseits mit der

Trägermatrix, beispielsweise einer warmen Agarlösung, gemischt wird, Die gewünschte Schicht läßt sich dann durch einfaches Aufbringen auf eine geeignete Unterlage, beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffplatte, eine transparente oder undurchsichtige Folie zu einer Schicht formen.

Das Substrat besteht also aus einem wasserunlöslichen und gefärbten oder radioaktiv markierten und enzymatisch zersetzbaren Netz von Molekülen, beispielsweise vom Polysaccharid- oder Proteintyp, wobei diese Moleküle, falls sie nicht von Natur aus unlöslich sind, durch Vernetzung unlöslich gemacht werden. Es ist auch möglich, die löslichen Substrate an einen inerten und wasserunlöslichen Träger chemisch zu binden.

Die Herstellung des unlöslichen Substrats kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können wasserlösliche Polysaccharide oder Proteine oder Derivate derselben, welche durch Endrohydrolasen hydrolysiert werden können, mittels bifunktioneller Brückenbildner bzw. Vernetzer zu einem dreidimensionalen kovalent gebundenen Netz verknüpft werden. Anschließend können die bestimmbaren Gruppen oder Atome mit dem Netzwerk wiederum beispielsweise durch Ausbildung kovalenter Gruppen, verbunden werden. Es ist auch umgekehrt möglich, zuerst die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalente Bindungen an die löslichen Substratmoleküle zu binden und dann erst die Vernetzung durchzuführen. Schließlich ist es auch möglich, Vernetzung und Einführung der bestimmbaren Gruppen gleichzeitig vorzunehmen.

Als Vernetzer kommen zahlreiche Arten von Substanzen in Frage. Es ist lediglich notwendig, daß sie bifunktionell sind und Funktionen tragen, welche mit dem Substrat eine Reaktion unter Bildung einer Bindung eingehen können. Beispiele für derartige Briikkenbildneroder Vernetzungsmittel sind die Epoxyde, die korrespondierenden Halogenhydrine, die Isocyanate und die Thioisocyanate. Derartige Vernetzungsmittel können beispielsweise mit Hydroxylgruppen oder Aminogruppen im Polysaccharid oder im Protein oder einem Derivat davon reagieren, wobei die gewünschte Vernetzung bzw. Unlöslichkeit erzielt wird.

Falls das Substrat an sich bereih wasserunlöslich ist, so braucht lediglich die optisch oder photographisch auswertbare Gruppe an das Substrat gebunden zu werden.

Beispiele für optisch oder photographisch auswertbare Markierungsgruppcn sind gefärbte Gruppen bzw. Substanzen, fluoreszierende Gruppen, radioaktive Gruppen u. dgl. Gefärbte Gruppen werden bevorzugt, da die Auswertung der Messung bei diesen am einfachsten durchzuführen ist, indem einfach mit Hilfe eines Maßstabs der Durchmesser des gebildeten Fleckens bestimmt wird. Ähnlich einfach gestaltet sich die Durchführung auch bei radioaktiv markierten Gruppen, da lediglich eine Folie aufgelegt werden muß, welche eine Schicht trägt, die radioaktive Strahlung direkt oder nach F.ntwickliing anzeigt.

Die Einführung der Markierungsgruppcn in das Substrat läßt sich einfach durch Reaktion mit tlcn Hydroxylgruppen oder Aminogruppen oder anderen reaktiven Gruppen in den Polysacchariden und Proleinen bzw. ihren Derivaten durchführen. Geeignete farbbildcnde Gruppen sind beispielsweise (ibacronseharlach 2G. Proünscharlach H HCi S. C'ibacronblau

3G, Procin Blau HBS, RemazobrilHantblau und ähnliche. Die Einführung fluoreszierender Gruppen kann beispielsweise mit fluoreszierenden Derivaten wie Fluoresceinisothiocyanat und anderen fluoreszierenden Verbindungen erfolgen. Wird beispielsweise die Bestimmung der Aktivität eines proteolytischen Enzyms wie Trypsin gewünscht, so kann man Arginin-/3-naphthylamin mit einem unlöslichen Träger wie z. B. teilchenförmigen! Dextran (Sephadex) oder einem anderen inerten und wasserunlöslichen Material, welches als Substrat dienen kann, kuppeln, und nach Einwirkung des Trypsins wird Naphthylamin freigesetzt, welches fluoresziert und daher leicht aufgefunden werden kann.

Ist das Substrat wasserlöslich, so läßt es sich beispielsweise an aktivierte Dextranteilchen, aktivierte Celluloseteilchen, aktivierte Kunststoff-, z. B. Polystyrolteilchen, aktivierte Glasteilchen u. dgl. binden, welche ihrerseits wiederum mit der eigentlichen Trägermatrix, beispielsweise dem Agar, gemischt und zu einer homogenen Schicht geformt werden.

Auch radioaktive Gruppen könner nach vielen verschiedenen Methoden eingeführt werden. Beispielsweise kann eine Gruppe eingeführt werden, die ein radioaktives Jodisotop, beispielsweise ¹²⁵I enthält. Auch is! es möglich, zuerst eine Gruppe einzuführen, welche kein Isotop enthält und dann in diese Gruppe nachträglich ein radioaktives Isotop einzubringen. Im Falle von Polysacchariden kann dies beispielsweise erfolgen, indem zuerst eine Allylgruppe eingeführt wird, beispielsweise mittels Allylbromid, worauf an die Doppelbindung ein radioaktives Jodisotop addiert wird. Die Einführung von ¹²⁵I in Proteine kann nach mehreren unterschiedlichen Methoden erfolgen, bei denen dei Tyrosylgruppen jodiert werden. Falls das Substrat keine Tyrosylrcste enthält, können solche eingeführt werden. Reaktive Gruppen, welche sich besonders für die Bindung der Markierungsgruppe mit dem Substrat eignen, sind Aminogruppen, Hyd;oxylgruppen und Carboxylgruppen. Dies kann unter Brückenbildung erfolgen, so daß beispielsweise Bindungen der folgenden Typen entstehen:

Markierungsgruppe - NH. CS. NH. - Substrat Markierungsgruppe - NH. CO. NH. - Substrat Markierungsgruppe -N = N- Substrat

Das Ausmaß der Einführung von Markierungsgruppen richtet sich danach, mit welcher Menge an derartigen Gruppen eine ausreichende Bestimmung sichergestellt ist. Es ist jedoch dabei Sorge zu tragen, daß nicht soviel Markierungsgruppen eingeführt werden, daß hierdurch die Reaktion zwischen dem zu bestimmenden Enzym und dem Substrat beeinträchtigt wird. Dies läßt sich in jedem Fall durch einfache Versuche «vorher leicht bestimmen.

Wenn das wasserunlösliche Substrat in Teilchenform gewünscht wird, so kann dies beispielsweise durch Vermählen auf die gewünschte Teilchengröße erfolgen. Es ist auch möglich, das Substrat zu synthetisieren, beispielsweise durch Perlpolymerisation, indem die Reaktionsmischung in einer inerten Flüssigkeit cmulgiert wird.

Von besonderer Bedeutung für das erfindi-ngsgemaße Verfahren ist die überraschende Tatsache, daß die bei der Einwirkung des Enzyms auf das unlösliche Substrat gebildeten Mruchstückr in die Trägermatrix derart diffundieren, daß sich eine scharfe Grenze ausbildet zwischen hydrolysierlem und nieht-hydrolysiertem Substrat, so daß tatsächlich eine einfache Bc-

Stimmung der Größe der hydrolysieren Fläche durch Messen ihres Durchmessers, ihrer Fläche oder des Volumens möglich ist. Die Aktivität des zu messenden Enzyms wird natürlich durch den pH-Wert, Temperatur, Substratkonzentration, Art der Trägermatrix, ihre Dicke und Konzentration beeinflußt. Unter hierfür festgelegten Bedingungen läßt sich jedoch eine quantitative Bestimmung auf einfachste Weise leicht durchführen, da das Enzym durch die Matrix ziemlich langsam diffundiert und es nicht einmal notwendig ist, das Enzym zu inaktivieren, ehe die Größe des hydrolysierten Fleckens gemessen wird. Es ist aber auch möglich, durch Zusatz von Säuren, Alkalien, Lösungsmitteln, Inhibitoren, Temperaturänderung u. dgl. die Enzymaktivität zu zerstören.

Ein besonderer Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es sich mit Hilfe eines einfachen Mittels ohne besondere sonstige Hilfsmittel leicht Hiirrhführfin läßt. Das e.rfinrliinosoemäRp Mittel zur Durchführung des Verfahrens welsfeinen Träger auf, der mit einer Schicht überzogen ist, die aus einem unlöslich gemachten, optisch oder photographisch auswertbar markierten Substrat und einer die Diffusion der bei der Spaltung entstehenden Substratbruchstücke erlaubenden Trägermatrix besteht. Als Träger für das Mittel der Erfindung kann beispielsweise eine transparente oder nicht-transparente Platte oder Folie verwendet werden. Geeignete Materialien sind Kunststoff, Glas, Metall u. dgl. Derartige Mittel können vom Arzt beispielsweise zu einer direkten Bestimmung der Enzymaktivität beim Patienten verwendet werden, indem einfach ein Tropfen Körperflüssigkeit, in dem die Enzymaktivität bestimmt werden soll, auf eine kleine Platte der oben beschriebenen Art gebracht wird und nach einer festgesetzten Zeit der Durchmesser des entfärbten Fleckens gemessen wird. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß auf diese Weise Enzyme mit einem Fehler von weniger als 5% bestimmt werden können.

Es ist auch möglich, die Bestimmung in besonders kurzer Zeit durchzuführen, indem ähnlich wie bei der Elektrophorese ein elektrisches Potentialgefälle an die Mittel angelegt wird, wobei innerhalb kurzer Zeit ellipsoidartige Flächen gebildet werden, die unter sonst festgelegten Bedingungen in ihrer Größe oder im Volumen der enzymatischen Aktivität entsprechen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1
Bestimmung von cr-Amylase

Es wird eine 1 %ige Lösung von Agar in 20 tnM Natriumphosphatpuffer pH 7,5 durch Erhitzen der Mischung auf etwa 95° C hergestellt. Dann wird das in Experientia 25, 555, beschriebene blau gefärbte Stärkepolymerisat unter starkem Rühren der heißen Agarlösung zugesetzt, bis eine 0,5%ige Suspension erhalten wird. Die so erhaltene Agar-Substrat-Mischung wird auf saubere Mikroskopträgerplatten einer Dicke von etwa 1 mm aufgetragen und erstarren gelassen.

Auf die so vorbereiteten Plättchen wurden 5 μΐ einer Urinprobe aufgebracht. Dann wurde die Probe bei Zimmertemperatur stehengelassen. Unter den angegebenen Bedingungen war bereits nach etwa 1 Stunde der Durchmesser des entfärbten Fleckens proportional der Enzymaktivität in der Probe. Der Durchmesser stieg mit fortdauernder Inkubation während mindestens 48 Stunden stets direkt linear an und gestattete zu jeder Zeit eine Aktivitätsbestimmung, wobei lediglich die Dauer der Inkubation bekannt sein mußte.

Das obige Verfahren wurde wiederholt wie beschrieben, jedoch wurden 50 μΙ Urin eingesetzt. Bereits nach liiminütiger Inkubation konnte durch Bestimmung des Durchmessers der farblos gewordenen Fläche die Aktivität der a-Amylase mit einer Genauigkeit von etwa 95% bestimmt werden.

Im obigen Beispiel kann das Agar durch Agarose, Pektin, Gelatine, Stärke, Quaran, Polyacrylamid oder Silikatgel ersetzt werden, ohne daß die direkte Auswertbarkeit der Bestimmung durch Messung des Durchmessers der entfärbten Stelle verlorengeht.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Abhängigkeit der entfärbten Fläche von der Reaktionsdauer unter gegebenen Bedingungen. Es wurden die wie oben beschrieben hergestellten Plättchen verwendet. Als Enzym wurden 5 μg a-Amylase, gewonnen aus Bacillus subtilis, gelöst in 5 μΙ Puffer angewendet. Die Inkubationstemperatur betrug 37 ° C.

Tabelle 1

Inkubationsdauer,
Stunden

entfärbte Fläche, mm¹

70
173
280
543

Unter Verwendung von menschlichem Serum wurden Verdünnungsversuche durchgeführt. Das Serum wurde mit dem Faktor 0,125, 0,25, 0,5 und 1,0 verdünnt, auf wie oben beschrieben hergestellte Testplatten gebracht und bei 37° C inkubiert. Die Durchmesser der erhaltenen entfärbten Flächen sind in der Zeichnung für verschiedene Inkubationszeiten angegeben. Die erhaltenen Werte zeigen, daß der Durchmesser eine direkte Bestimmung der Aktivität der a-Amylase gestattet.

Beispiel 2

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Testplatten hergestellt unter Verwendung von 1 %iger Agarlösung sowie einem durch Vernetzen mit Diepoxyd unlöslich gemachten und mit einem blauen Farbstoff gekoppelten Dextran als Substrat.

Die so erhaltenen Plättchen wurden zur Bestimmung von roher Dextranase aus Penicillin! funiculosutn NRRL 1768 verwendet. Es wurden 5 μΐ Dextranaselösung aufgebracht mit einem Enzymgehali von 125 μg. Die Inkubationstemperatur betrug 37° C der pH-Wert des Reagensmediums 5,5. In der nachstehenden Tabelle wird die Größe der entfärbter Flecken bei verschiedenen Reaktionszeiten angegeben.

Tabelle 2
Reaktionsdauer, Stunden entfärbte Fläche, mm²

105
174
299
799

Eine Reihe weitererTestplättchen wurde mit je 5 μΙ Dextranaselösung mit unterschiedlichem Dextranasegehalt inkubiert. Die Temperatur betrug 37° C, die Reaktionsdauer 25 Stunden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt Tabelle 3.

Tabelle 3

μg Lrextranase

entfärbte Fläche, mm²

0,035

0,067

0,125

0,500

1,000

434

564

799

984

1176

1389

Beispiel 3

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Testplatten hergestellt, wobei jedoch als Substrat ein durch Vernetzen mit Diepoxyd unlöslich gemachtes Albumin, welches nach der obenerwähnten Methode angefärbt worden war, eingesetzt wurde.

Auf eine so erhaltene Testplatte wurden 5 ul einer Lösung aufpipettiert, welche 0,5 μg Papain mit einer Aktivität von 15 U/mg enthielten. Der pH-Wert des Mediums betrug 11,0, die Inkubationstemperatur 50° C. Das Medium enthielt zusätzlich 0,5 M Cystein

als Aktivator. Die nachstehende Tabelle 4 zeigt die Größe der entfärbten Fläche in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer.

Tabelle 4 Reaktionsdauer, Stunden entfärbte Fläche, mm²

103 151 200 250

Wie oben beschrieben wurde Papin auf Testplatten aufgebracht. Die Papainmenge wurde dabei zwischen 0,5 und 30,0 μg Protein auf je 5 ul variiert. Unter den oben angegebenen Bedingungen wurden die in der nachstehenden Tabelle 5 wiedergegebenen Werte erhalten.

Tabelle 5

Papain, ug

entfärbte Fläche, mm²

151 236 324 385

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen durch Einwirkung einer Lösung des hydrolysierenden Enzyms auf eine Schicht, die aus einem unlöslich gemachten und optisch oder photographisch auswertbar markiertem Substrat in einer die Diffusion der bei der Spaltung entstehenden Substratbruchstücke erlaubenden Trägermatrix besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Einwirkung des Enzyms gebildete, nicht mehr markierte Fläche nach einer bestimmten Zeit ausgemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermatrix eine wäßrige Lösung von Agar, Agarose, Pektin, Gelatine, Stärke, Quaran, Polyacrylamid oder Silikatgel verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat mit Diepoxyd vernetzte Stärke, Dextran, Cellulose oder Protein verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat durch Kupplung mit einem Farbstoff markiert wird.

5. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Träger, der mit einer Schicht überzogen ist, die aus einem unlöslich gemachten und optisch oder photographiscn auswertbar markiertem Substrat in einer die Diffusion der bei der Spaltung entstehenden Substratbruchstücke erlaubenden Trägermatrix besteht.

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einer Platte oder Folie aus Kunststoff, Glas oder Metall besteht.