AT308051B - Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden EnzymenInfo
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Description
<Desc/Clms Page number 1> Die Erfindung betrifft eine einfache zuverlässige Methode zur Bestimmung der Aktivität oder Konzentration von hydrolysierenden Enzymen wie beispielweise von Endoenzymen, welche Polysaccharide, Proteine und verschiedene Ester hydrolysieren. Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen bekannt. Alle diese Verfahren erfordern jedoch die Anwendung verschiedener Reagentien sowie Pipettierungsschritte oder die Benutzung aufwendiger Apparaturen oder beides. In vielen Fällen ist es jedoch wichtig, auf Grund einer ganz einfachen und ohne besondere Hilfsmittel durchführbare Methode eine rasche und zuverlässige Bestimmung durchzuführen, beispielsweise im Falle mancher Krankheiten, bei denen eine rasche Entscheidung über die zu ergrei- fenden Massnahmen unbedingt geboten ist, diese Entscheidung aber von einer Aktivitätsbestimmung eines Enzyms, beispielsweise von Amylase beim sogenannten"akuten Oberbauchschmerz", abhängig ist. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines solchen einfachen und trotzdem zuverlässigen Verfahrens, welches keiner besonderen Hilfsmittel bedarf und ohne die Verwendung zusätzlicher Reagentien eine rasche und zuverlässige Bestimmung der erwähnten Enzyme ermöglicht. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen durch Einwirkungeiner Lösung des hydrolysierenden Enzyms auf eine Schicht, die aus einem unlöslich gemachten Substrat besteht, das in einer gelartigen porösen Trägermatrix eingebettet ist, in welcher bei der Spaltung des Substrates entstehende niedermolekulare Bruchstücke diffundieren können, besteht darin, dass ein optisch oder photographisch auswertbar markiertes Substrat verwendet und die durch Einwirkung des Enzyms gebildete, nicht mehr markierte Fläche nach einer bestimmten Zeit ausgemessen wird. Beim erfindungsgemässen Verfahren steht die Grösse des gebildeten Substrat-freien Hofes in exakter Relation zur Aktivität bzw. Konzentration des aufgebrachten Enzyms. Dies ist überraschend, weil eine Diffusion erst nach der Spaltung beginnen kann und nicht zu erwarten war, dass sowohl Spaltungsgeschwindigkeit als auch Diffusionsgeschwindigkeit zueinander in solcher Beziehung stehen, dass die Grösse des Fleckens der Aktivität des Enzyms exakt entspricht. Als Trägermatrix im Rahmen der genannten Schicht kommen Agargel, Agarosegel, Stärkegel, Quaran, Gelatine, Polyacrylamidgel, Kieselsäuregel oder andere Gelarten oder anderes, die Diffu- sion erlaubendes Material, wie z. B. Cellulose, Filterpapier usw. in Frage. Bevorzugt wird Agargel. Das Substrat, welches in wasserunlöslicher Form vorliegen muss, wird mit einem Farbstoff oder einer radioaktiven Substanz markiert und mit der Matrix gemischt verwendet. Bei der Einwirkung des hydrolysierenden Enzyms wird das unlöslich gemachte Substrat abgebaut zu löslichen Bruchstücken, welche innerhalb der Matrix diffundieren. Wird daher eine Enzymlösung auf eine derartige Schicht gebracht, welche ein durch Reaktion mit einem Farbstoff gefärbtes und beispielsweise durch Vernetzung mit einem Diepoxyd unlöslich gemachtes Substrat für das Enzym enthält, so spaltet das Enzym das unlösliche Substrat in lösliche Bruchstücke, welche durch die Trägermatrix abdiffundieren. Auf diese Weise entsteht eine nicht mehr gefärbte fleckenartige Fläche in der Schicht, deren Grösse in direkter Relation zur Aktivität bzw. Konzentration des Enzyms steht. Da die Enzymlösung einfach in Form eines Tropfens aufgebracht werden kann, bildet sich nach einer bestimmten Zeitdauer ein runder Fleck, dessen Fläche und Durchmesser einfach gemessen werden kann und direkt der gesuchten Aktivität des Enzyms proportional ist. Beim erfindungsgemässen Verfahren tritt also eine Reaktion zwischen dem Enzym und dem unlöslich ge- EMI1.1 Gruppen oder Atome enthalten. Die Bruchstücke trennen sich von dem noch nicht abgebauten Substrat durch Diffusion innerhalb der Trägermatrix und sobald an einer bestimmten Stelle das gesamte unlösliche Substrat gespalten ist, wird diese Stelle vollständig entfärbt. Das unlöslich gemachte Substrat für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung ist entweder eine an sich wasserunlösliche und gefärbte Substanz, welche beispielweise mitwarmer Agarlösung zur Herstellung der Schichtmasse gemischt wird, oder wird wasserunlöslich gemacht durch chemische Bindung an einen unlöslichen Träger, der dann seinerseits mit der Trägermatrix, beispielweise einer warmen Agarlösung, gemischt wird. Die gewünschte Schicht lässt sich dann durch einfaches Aufbringen auf eine geeignete Unterlage, beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffplatte, eine transparente oder undurchsichtige Folie zu einer Schicht formen. Das Substrat besteht also aus einem wasserunlöslichen und gefärbten oder radioaktiv markierten und enzymatisch zersetzbaren Netz von Molekülen, beispielweise vom Polysaccharid- oder Proteintyp, wobei diese Moleküle, falls sie nicht von Natur aus unlöslich sind, durch Vernetzung z. B. mit einem Diepoxyd unlöslich gemacht werden. Es ist auch möglich, die löslichen Substrate an einen inerten und wasserunlöslichen Träger chemisch zu binden. Die Herstellung des unlöslichen Substrates kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielweise können wasserlösliche Polysaccharide oder Proteine oder Derivate derselben, welche durch Endohydrolasen hydrolysiert werden können, mittels bifunktioneller Brückenbildner bzw. Vernetzer zu einem dreidimensionalen kovalent gebundenenNetz verknüpft werden. Anschliessend können die bestimmbaren Gruppen oder Atome mit dem Netzwerk wieder beispielsweise durch Ausbildung kovalenter Gruppen, verbunden werden. Es ist auch umgekehrt möglich, zuerst die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalente Bindungen an die löslichen Substratmoleküle zu binden und dann erst die Vernetzung durchzuführen. Schliesslich ist es auch möglich, Vernetzung <Desc/Clms Page number 2> und Einführung der bestimmbaren Gruppen gleichzeitig vorzunehmen. Als Vernetzer kommen zahlreiche Arten von Substanzen in Frage. Es ist lediglich notwendig, dass sie funktionell sind und funktionelle Gruppen tragen, welche mit dem Substrat eine Reaktion unter Bildung einer Bindung eingehen können. Beispiele für derartige Brückenbildner oder Vernetzungsmittel sind die Epoxyde, die korrespondierenden Halogenhydrine, die Isocyanate und die Thioisocyanate. Derartige Vernetzungsmittel können beispielsweise mit Hydroxylgruppen oder Aminogruppen im Polysaccharid oder im Protein oder einem Derivat davon reagieren, wobei die gewünschte Vernetzung bzw. Unlöslichkeit erzielt wird. Falls das Substrat an sich bereits wasserunlöslich ist, so braucht lediglich die optisch oder photographisch auswertbare Gruppe an das Substrat gebunden zu werden. Beispiele für optisch oder photographisch auswertbare Markierungsgruppen sind an das Substrat gebundene Farbstoffe bzw. Substanzen, fluoreszierende Gruppen, radioaktive Gruppen. An das Substrat gebundene Farbstoffe werden bevorzugt, da die Auswertung der Messung bei diesen am einfachsten durchzuführen ist, indem einfach mit Hilfe eines Massstabes der Durchmesser des gebildeten Fleckens bestimmt wird. Ähnlich einfach gestaltet sich die Durchführung auch bei radioaktiv markierten Gruppen, da lediglich eine Folie aufgelegt werden muss, welche eine Schicht trägt, die radioaktive Strahlung direkt oder nach Entwicklung anzeigt. Die Einführung der Markierungsgruppen in das Substrat lässt sich einfach durch Reaktion mit den Hydroxylgruppen oder Aminogruppen oder andern reaktiven Gruppen in den Polysacchariden und Proteinen bzw. ihren Derivaten durchführen. Geeignete farbbildende Gruppen sind beispielsweise Cibacronscharlach 2G, Procinschar- lachHSGS, CibacronblauSG, ProcinBlauHBS, Remazobrilliantblau und ähnliche. Die Einführungfluoreszierender Gruppen kann beispielsweise mit fluoreszierenden Derivaten wie Fluoresceinisothiocyanat und andern fluoreszierenden Verbindungen erfolgen. Wird beispielsweise die Bestimmung der Aktivität eines proteolytischen Enzyms wie Trypsin gewünscht, so kann man Arginin-ss-naphthylamin mit einem unlöslichen Träger wie z. B. teilchenförmigem Dextran (Sephadex) oder einem andern inerten und wasserunlöslichen Material, welches als Substrat dienen kann, kuppeln und nach Einwirkung des Trypsins wird Naphthylamin freigesetzt, welches fluoresziert und daher leicht aufgefunden werden kann. Ist das Substrat wasserlöslich, so lässt es sich beispielsweise an aktivierte Dextranteilchen, aktivierte Celluloseteilchen, aktivierte Kunststoff-, z. B. Polystyrolteilchen oder aktivierte Glasteilchen binden, welche ihrerseits wieder mit der eigentlichen Trägermatrix, beispielsweise dem Agar, gemischt und zu einer homogenen Schicht geformt werden. Auch radioaktive Gruppen können nach vielen verschiedenen Methoden eingeführt werden. Beispielsweise kann eine Gruppe eingeführt werden, die ein radioaktives Jodisotop, beispielsweise 1251 enthält. Auch ist es möglich, zuerst eine Gruppe einzuführen, welche kein Isotop enthält und dann in diese Gruppe nachträglich ein radioaktives Isotop einzubringen. Im Falle von Polysacchariden kann dies beispielsweise erfolgen, indem zuerst eine Allylgruppe eingeführt wird, beispielsweise mittels Allylbromid, worauf an die Doppelbindung ein radioaktives Jodisotop addiert wird. Die Einführung von 125 I in Proteine kann nach mehreren unterschiedlichen Methoden erfolgen, bei denen die Tyrosylgruppen jodiert werden. Falls das Substrat keine Tyrosylreste enthält, können solche eingeführt werden. Reaktive Gruppen, welche sich besonders für die Bindung der Markierungsgruppe mit dem Substrat eignen, sind Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen. Dies kann unter Brückenbildung erfolgen, so dass beispielsweise Bindungen der folgenden Typen entstehen : EMI2.1 Markierungsgruppe N = N - Substrat Das Ausmass der Einführung von Markierungsgruppen richtet sich danach, mit welcher Menge an derartigen Gruppen eine ausreichende Bestimmung sichergestellt ist. Es ist jedoch dabei Sorge zu tragen, dass nichtsoviel Markierungsgruppen eingeführt werden, dass hiedurch die Reaktion zwischen dem zu bestimmenden Enzym und dem Substrat beeinträchtigt wird. Dies lässt sich in jedem Fall durch einfache Versuche vorher leicht bestimmen. Wenn das wasserunlösliche Substrat in Teilchenform gewünscht wird, so kann dies beispielsweise durch Vermahlen auf die gewünschte Teilchengrösse erfolgen. Es ist auch möglich, das Substrat zu synthetisieren, beispielsweise durch Perlpolymerisation, indem die Reaktionsmischung in einer inerten Flüssigkeit emulgiert wird. Von besonderer Bedeutung für das erfindungsgemässe Verfahren ist die überraschende Tatsache, dass die bei der Einwirkung des Enzyms auf das unlösliche Substrat gebildeten Bruchstücke in die Trägermatrix derart diffundieren, dass sich eine scharfe Grenze ausbildet zwischen hydrolysiertem und nicht hydrolysiertem Substrat, so dass tatsächlich eine einfache Bestimmung der Grösse der hydrolysierten Fläche durch Messen ihres Durchmessers, ihrer Fläche oder des Volumens möglich ist. Die Aktivität des zu messenden Enzyms wird natürlich durch den pH-Wert, Temperatur, Substratkonzentration, Art der Trägermatrix, ihre Dicke und Konzentration beeinflusst. Unter hiefür festgelegten Bedingungen lässt sich jedoch eine quantitative Bestimmung auf einfachste Weise leiclt durchführen, da das Enzym durch die Matrix ziemlich langsam diffundiert und es nicht einmal notwendig ist, <Desc/Clms Page number 3> das Enzym zu inaktivieren, ehe die Grösse des hydrolysierten Fleckens gemessen wird. Es ist aber auch möglich, durch Zusatz von Säuren, Alkalien, Lösungsmitteln, Inhibitoren oder durch Temperaturänderung die Enzymaktivität zu zerstören. Ein besonderer Vorzug des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass es sich mit Hilfe eines einfachen Mittels ohne besondere sonstige Hilfsmittel leicht durchführen lässt. Das erfindungsgemässe Mittel zur Durchführung des Verfahrens ist gekennzeichnet durch einen Träger, der mit einer Schicht überzogen ist, die aus einem unlöslich gemachten, optisch oder photographisch auswertbar markierten Substrat und einer die Diffusion der bei der Spaltung entstehenden Substratbruchstücke erlaubenden Trägermatrix besteht. Als Träger für das erfindungsgemässe Mittel kann beispielsweise eine transparente oder nicht transparente Platte oder Folie verwendet werden. Geeignete Materialien sind Kunststoff, Glas oder Metall. Derartige Mittel können vom Arzt beispielsweise zu einer direkten Bestimmung der Enzymaktivität beim Patienten verwendet werden, indem einfach ein TropfenKörperflüssigkeit, in dem die Enzymaktivität bestimmt werden soll, auf eine kleine Platte der oben beschriebenen Art gebracht wird und nach einer festgesetzten Zeit der Durchmesser des entfärbten Fleckens gemessen wird. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass auf diese Weise Enzyme mit einem Fehler von weniger als 5% bestimmt werden können. Es ist auch möglich, die Bestimmung in besonders kurzer Zeit durchzuführen, indem ähnlich wie bei der Elektrophorese ein elektrisches Potentialgefälle an die Mittel angelegt wird, wobei innerhalb kurzer Zeit ellipsoidartige Flächen gebildet werden, die unter sonst festgelegten Bedingungen in ihrer Grösse oder im Volumen der enzymatischen Aktivität entsprechen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1 : Bestimmung von a-Amylase : Es wird eine lToige Lösung von Agar in 20 mM Natriumphosphatpuffer PH 7, 5 durch Erhitzen der Mischung auf etwa 950C hergestellt. Dann wird das in Experientia 25,555 beschriebene blau gefärbte Stärkepolymerisat unter starkem Rühren der heissen Agarlösung zugesetzt, bis eine 0, 5%ige Suspension erhalten wird. Die so erhaltene Agar-Substrat-Mischung wird auf saubere Mikroskopträgerplatten einer Dicke von etwa 1mm aufgetragen und erstarren gelassen. Auf die so vorbereiteten Plättchen wurden 5 ul einer Urinprobe aufgebracht. Dann wurde die Probe bei Zimmertemperatur stehengelassen. Unter den angegebenen Bedingungen war bereits nach etwa 1 h der Durchmesser des entfärbten Fleckens proportional der Enzymaktivität in der Probe. Der Durchmesser stieg mit fortdauernder Inkubationwährend mindestens 48 h stets direkt linear an und gestattete zu jeder Zeit eine Aktivitätsbestimmung, wobei lediglich die Dauer der Inkubation bekannt sein musste. Das obige Verfahren wurde wiederholt wie beschrieben, jedoch wurden 50J. LI Urin eingesetzt. Bereits nach 15 minütiger Inkubation konnte durch Bestimmung des Durchmesser der farblos gewordenen Fläche die Aktivität dera-Amylase mit einer Genauigkeit von etwa 951o bestimmt werden. Im obigen Beispiel kann das Agar durch Agarose, Pektin, Gelatine, Stärke, Quaran, Polyacrylamid oder Silikatgel ersetzt werden, ohne dass die direkte Auswertbarkeit der Bestimmung durch Messung des Durchmessers der entfärbten Stelle verlorengeht. Die nachstehende Tabelle zeigt die Abhängigkeit der entfärbten Fläche von der Reaktionsdauer unter ge- gebenenBedingungen. Es wurden die wie oben beschrieben hergestellten Plättchen verwendet. Als Enzym wurden 5'Y a-Amylase, gewonnen aus Bacillus subtilis, gelöst in 5 J. LI Puffer angewendet. Die Inkubationstemperatur betrug 370C. Tabelle I EMI3.1 <tb> <tb> Inkubationsdauer, <SEP> Stunden <SEP> entfärbte <SEP> Fläche, <SEP> mm <tb> 2 <SEP> 70 <tb> 6 <SEP> 173 <tb> 10 <SEP> 280 <tb> 20 <SEP> 543 <tb> Unter Verwendung von menschlichem Serum wurden Verdünnungsversuche durchgeführt. Das Serum wurde EMI3.2 koppelten Dextran als Substrat. Die so erhaltenen Plättchen wurden zur Bestimmung von roher Dextranase aus Penicillium funiculosum <Desc/Clms Page number 4> NRRL 1768 verwendet. Es wurden 5 pl Dextranaselösung aufgebracht mit einem Enzymgehalt von 125 y. Die Inkubationstemperatur betrug 37 C, der pH-Wert des Reagensmediums 5, 5. In der nachstehenden Tabelle wird die Grösse der entfärbten Flecken bei verschiedenen Reaktionszeiten angegeben. Tabelle 2 EMI4.1 <tb> <tb> Reaktionsdauer, <SEP> Stunden <SEP> entfärbte <SEP> Fläche, <SEP> mm2 <tb> 2 <SEP> 105 <tb> 4 <SEP> 174 <tb> 8 <SEP> 299 <tb> 25 <SEP> 799 <tb> Eine Reihe weiterer Testplättchen wurde mit je 5 gl Dextranasegehalt mit unterschiedlichem Dextranasegehalt inkubiert. Die Temperatur betrug 37 C, die Reaktionsdauer 25 h. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt Tabelle 3. Tabelle 3 EMI4.2 <tb> <tb> y <SEP> Dextranase <SEP> entfärbte <SEP> Fläche, <SEP> mm <tb> 0,035 <SEP> 434 <tb> 0, <SEP> 067 <SEP> 564 <tb> 0,125 <SEP> 799 <tb> 0,25 <SEP> 984 <tb> 0,500 <SEP> 1176 <tb> 1,000 <SEP> 1389 <tb> Beispiel 3 : Wie in Beispiel 1 beschrieben wurden Testplatten hergestellt, wobei jedoch als Substrat ein durch Vernetzen mit Diepoxyd unlöslich gemachtes Albumin, welches nach der oben erwähnten Methode angefärbt worden war, eingesetzt wurde. Auf eine so erhaltene Testplatte wurden 5 1 einer Lösung aufpipettiert, welche 0, 5 y Papain mit einer Aktivität von 15 U/y enthielten. Der pH-Wert des Mediums betrug 11, 0, die Inkubationstemperatur 50 C. Das Medium enthielt zusätzlich 0, 5 M Cystein als Aktivator. Die nachstehende Tabelle 4 zeigt die Grösse der entfärbten Fläche in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer. Tabelle 4 EMI4.3 <tb> <tb> Reaktionsdauer, <SEP> Stunden <SEP> entfärbte <SEP> Fläche, <SEP> mm2 <tb> 2 <SEP> 103 <tb> 5 <SEP> 151 <tb> 7 <SEP> 200 <tb> 10 <SEP> 250 <tb> EMI4.4 stehenden Tabelle 5 wiedergegebenen Werte erhalten. Tabelle 5 EMI4.5 <tb> <tb> 2 <tb> Papain, <SEP> p <SEP> entfärbte <SEP> Fläche, <SEP> mm <tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 151 <SEP> <tb> 2, <SEP> 5 <SEP> 236 <tb> 10, <SEP> 0 <SEP> 324 <tb> 30, <SEP> 0 <SEP> 385 <tb>
Claims (1)
- PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Bestimmung von hydrolysierenden Enzymen durch Einwirkung einer wässerigen Lösung des hydrolysierenden Enzyms auf eine Schicht, die auf einem inerten Träger aufgebracht ist und aus einem durch Vernetzung mit einem Diepoxyd unlöslich gemachten und durch eine farbbildende, fluoreszierende oder radioaktive Gruppe oder durch einen Farbstoff markierten Substrat besteht, das in einer Diffusion der bei der hydrolytischen Spaltung entstehenden Sp altstücke ermöglichenden inerten Trägermatrix eingebettet ist, dadurch gekennzeichnet, dass man als Substrat eine mit einem Diepoxyd vernetzte Stärke, ein mit einem Diepoxyd vernetztes Dextran,eine mit einem Diepoxyd vernetzte Cellulose oder ein mit einem Diepoxyd vernetztes Protein verwendet, welches Substrat durch Kupplung mit einem Farbstoff markiert ist, dass man weiters als Trägermatrix ein Agargel, ein Agarosegel, ein Stärkegel, ein Quarangel, ein Polyacrylamidgel oder ein Kieselsäuregel verwendet, und dass man die Fläche des durch Einwirkung des Enzyms auf das Substrat gebildeten farblosen, nicht fluoreszierenden oder nicht radioaktiven Flecks auf der substrathaitigen Trägermatrix kolorimetrisch, fluorometrisch oder radiometrisch ausmisst.2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch l, gekennzeichnet durch einen inerten Träger, der mit einer Schicht überzogen ist, die aus einem durch Vernetzung mit Diepoxyd unlöslich gemachten und durch eine farbbildende, fluoreszierende oder radioaktive Gruppe oder durch einen Farbstoff markierten Substrat u. zw. Dextran, Cellulose oder Protein und aus Agargel, Agarosegel, Stärkegel, Quarangel, Polyacrylamidgel oder Kieselsäure als Trägermatrix besteht.3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einer Platte oder Folie aus Kunststoff, Glas oder Metall besteht.
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