DE2120442A1 - Verfahren zur in vitro Bestimmung der Schilddrüsenfunktion - Google Patents

Description

betreffend

Verfahren "zur in vitro Bestimmung der gchilddrüsenfunlction

Der Gehalt an Schilddrüsenhormonen im Blutserum kann leicht bestimmt werden, indem man ein radioaktives Testsystem zur in vitro Bestimmung der Thyroid-Funktion verwendet, das einen "Proteinfehler'·- pH-Indikator wie Bromkresolpurpur enthält. Ein derartiger "Proteinfehler"-Indikator ergibt eine Färbung und zeigt das Vorhandensein der zu untersuchenden Probe an, hemmt die Bildung von freiem Jοdid und vermindert die Adsorption von radioaktiv-markierter Schilddrüsensubstanz an den "Wänden des Gefäßes, in dem sie enthalten ist.

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Es wurden in letzter Zeit zahlreiche Untersuchungsee tho den entwickelt, um die Schilddrüsenfunktion in vitro zu bestimmen, ■ ohne den Patienten ionisierender Strahlung auszusetzen. Z.B. sind spezifische Plasmaproteine, die als thyroxinbindende Proteine oder TBP bekannt sind, die hauptsächlichen bindenden Stellen für in der Schilddrüse gebildete Hormone. Ba die TBP eine starke Affinität zu den Schilddrüsenhormonen besitzen, binden sie das gesamte freie Schilddrüsenhormon, bis sie gesättigt sind. Bei dieser Untersuchungsmethode werden derartige Hormone in einer Probe des Patientenserums für die TBP verfügbar gemacht und es wird eine eekundäntoiBdende Substanz in Form eines Harzpulvers oder eines vernetzten Deztrans (Sephadez) zur Verfügung gestellt, um das nicht an das TBP gebundene, zugesetzte radioaktive Trij odthyronin oder Thyroxin (im folgenden als T^ bzw. T^ bezeichnet) zu binden. So ermöglicht die Untersuchung eine Bestimmung des Sättigungsgrades des TBP In einer bestimmten Serumprobe» der ein indirektes, aber zuverlässiges Zeichen für die Schilddrüsenfunktion darstellt. Eine hohe Barzaufnahme zeigt Hyperthyreose und eine geringe Harzaufnähme Hypothyreose an.

Zwei derartige Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion sind in den amerikanischen Patentschriften 3 206 602 und 3 451 777 beschrieben. Da bai beiden Untersuchungen keine Farbänderung auftritt, kann der Ausführende verwirrt werden, wenn die Verfahrensstufen unterbrochen werden. Außerdem führt die Zersetzung des mit radioaktivem iod markierten Τ, zu freiem tfod in Verbindung mit einer beachtlichen Adsorption der wäßrigen, gepufferten radioaktiven Tylösung an Glas oder Plastikgefäßen zu einem beachtlichen Fehler bei der Bestimmung des Thyroidhormongehaltes der Serumprobe.

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine lösung zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktica

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herzustellen, die einen pH-Indikator enthält und den dreifachen Vorteil besitzt, daß sie 1. eine Farbänderung ergibt, wenn die Serumprobe zugegeben wird, 2. die Bildung -von freiem Jod aus radioaktiv markiertem T, hemmt und 3. die Adsorption von radioaktiv markiertem T, an den Wänden des die Probe enthaltenden Gefäßes herabsetzt.

Obwohl die Untersuchungen der Schilddrüsenfunktion auf *- viele verschiedene Arten durchgeführt werden können, besteht ein übliches Verfahren darin, daß man eine geeignete Menge einer gepufferten, wäßrigen Lösung von radioaktivem Trijodthyronin oder Thyroxin und Serum auf eine Säule aus eines Ionenaustauscherharz (Amberlit IBA 4oo) oder einem vernetzten Sextran (Se pb ade χ G 25) aufbringt. Man läßt die Flüssigkeit dann aus der Säule ablaufen und mißt die Radioaktivität 1 ein mit einem Gerät zur Messung der f -Strahlung. Sie Säule wird anschließend alt destilliertem Wasser eluiert und die In der Säule verbleibende Radioaktivität erneut 1 »in lang gesessen. Die prozentuale Betention wird dann berechnet, indem aan die beiden Werte vergleicht. Betentionen von 41 bis 61 % .« mit vernetzten Dextranen (Sephadex) und von 25 bis 35 % Hit Harz werden als normal-angesehen.

' Es hat sich nun gezeigt, daß man durch Zugabe eines "Pro te infehler¹·- pH-Indikators zu einer wäßrigen radioaktiven Τ-2-Iiösung, bevor diese mit der Serumprobe zusammengegeben wird oder durch Zugabe dieses Indikators zu der vereinigten T-,-Lösung und Serumprobe, ein wesentlich verbessertes Testsystea erhalten kann.

Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete pH-Indikator 1st ein Pro te infehle rindlkat or, der die Farbe in Gegenwart von Albumin ohne eine deutliche Änderung des pH-Wertes ändert. Wenn ein derartiger Indikator in einer Konzentration von ungefähr 50 bis 70 Aug/ml einer wäßrigen ¹²⁵J - T₃-Reagens-lösung, die

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auf einen pH-Wert von 5 gepuffert 1st, zugegeben wird, ändert das Reagens seine ursprüngliche Farbe in eine zweite Farbe, wenn das Serum zugegeben wird. Diese zweite Farbe ist eine Markierung, die in verschiedenen Höhen der Harz- oder Dextransäule auftritt, in Abhängigkeit von der letzten, vollständigen Verfahrensstufe bei der Untersuchung, da sich die Farbe mit der Lösungsmittelfront vorwärts bewegt.

Ein bevorzugter Indikator^siromkresolpurpur, das seine Farbe von Gelb nach Purpur im pH-Bereich von 5,2 bis 6,8 ändert. Wenn er mit einer wäßrigen radioaktiven !-,-lösung vermischt wird, geht die gelb-orange Farbe in eine grau-grüne Farbe über, wenn Serum in einer Menge von 0,05 ml Serum auf 0,45 ml des Reagensgemisches zugegeben wird. Daher zeigt die grüne Farbe, das Vorhandensein des Serums an. Andere geeignete Indikatoren, die Je nach dem pH-Wert des Puffersystems verwendet werden können, sind 1. Chlorphenolrot, das seine Farbe bei einem pH-Wert von 6,5 von Rot nach Violett ändert, 2. Tetrabromphenolblau, das die Farbe fcal einem pH-Wert sron 3,0 von Gelb nach Blau ändert, 3. Bromphenolblau, das die Farbe bei einem pH-Wert von 3,_;0 von Gelb nach Purpur ändert, 4. Bromkresolgrün, bei dem bei einem pH-Wert von 3,0 eine Farbänderung von Gelb nach Blau auftritt und 5. Bromthymolblau, dessen Farbe sich bei einem pH-Wert von 6,5 von Grün nach Gelb ändert. In der Praxis sind die bei der Farbänderung auftretenden Farben nicht wichtig, solange ein Unterschied leicht erkennbar ist.

Vorzugswelse erhält das erfindungsgemäße, verbesserte !•»-Te stre age ns mit dem pH-Indikator die folgenden Bestandteile:

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Besten dte 11

wasserfreie Zitronensäure - 43,2 g

Zweibasisches Natriumphosphat 125,0 g

Formaldehyd (38 j£-ige wäßrige

lösung) 8,1 ml

-³J Trij.odthyronin 4,0 /tu-.g

nichtmarkierte s Trijodthyronln 26,0 /iL*g

Bromkresolpurpur 0,18 g

destilliertes Wasser auf 3,0 1

Heben der bei Verwendung eines pH-Indikators der angegebenen Art auftretenden Farbänderung ergibt sich ein anderer Vorteil aus der unvorhergesehenen Eigenschaft des Indikators, die Bildung von freiem Jod/aus dem verwendeten «Γ - T·» in dem T,-Reagens zu hemmen. Das 1st wichtig, da die Zählvor-

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richtung für die ^-Strahlung nicht zwischen ³J - T, und freiem ⁵J unterscheiden kann und zunächst während der Untersuchtung das gesamte ^D3 gemessen wird. Beim Auswaschen mit

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Wasser wird alles etwaige freie J aus der Säule entfernt,

da nur die Hormonsubstanzen in der Säule festgehalten werden. So unterliegt, wenn der Prozentsatz an freiem Jod^uber 5 % der Gesamtdosis liegt, das T,-Verhältnis einem deutlichen Fehler von 5 bis 10 %.

Bei einer Beine von Versuchen wurde eine gepufferte,

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wäßrige Lösung von «I - T·*, enthaltend 60 /u>-g Bromkresolpurpur pro ml, die, wie in dem vorigen Beispiel gezeigt, hergestellt worden war unter verschiedenen Bedingungen,in einem Polyäthylenbehälter gelagert und der Prozentsatz an gebildetem freiem Jodrwurde mit einer ähnlichen Lösung verglichen, die keinen pH-Indikator enthielt. Die verwendeten Anfangslösungen enthielten ungefähr 2 % freies Jod^^dNach 90 Tagen bei Raumtemperatur zeigte die radioaktive Τ,-Lösung, die den Indikator enthielt, einen Prozentgehalt von 2,25 % freiem Jod^verglichen mit 5,2 % freiem JödWi.n der Vergleichsprobe, die keinen Indikator

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enthielt. Hach 60 Tagen bei 4O⁰C enthielt die Τ,-Testlösung mit pH-Indikator 4,25 % freies Jo&r^während die Vergleichsprobe einen Gehalt an freiem Jod^von 9,0 % aufwies.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines pH-Indikators in einer T^-Te st lösung besteht darin, das die Adsorption von

radioaktivem T-, an den Wänden aus einem Plastik oder

behälter. ■

Glas- genemmr wird. Propylenglykol und Albumin wurden bisher verwendet, um eine derartige Adsorption herabzusetzen* Diese Zusätze stören jedoch bei der Untersuchung der Schilddrüsenfunktion. Bei den Versuchen wurden wäßrige radioaktive T^-Iiösungen, enthaltend einen oder mehrere Indikatoren, in einer Konzentration von 60 yu><g/ml Lösung t4 Tage.in einem Polyäthylen-Behälter auf einem Rad in Rotation gehalten und die verbleibende Aktivität mit einer Vergleichsprobe verglichen, die keinen Indikator enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß über 90 % der Radioaktivität (nach Korrektur des physikalischen Abklingens) in den Lösungen erhalten geblieben waren, die Bromthymolblau, Chlorphenolrot, Bromkresolpurpur und Tetrabromphenolblau enthielten, während in Lösungen, die Phenolrot oder Bromkresolgrün enthielten 80 % der Radioaktivität erhalten geblieben waren und bei denen, die Bromphenolblau enthielten, 70 %. Unter .den gleichen Versuchsbedingungen waren bei der Vergleichsprobe die keinen der erwähnten Indikatoren enthielt, 32 % der Radioaktivität in der Lösung erhalten geblieben, ähnliche Ergebnisse wurden mit Glasgefäßen erhalten.

Eine ähnlich starke Abnahme der Adsorption wurde beobachtet, wenn die Plastik-oder Glasbehälter vor dem Füllen mit radioaktivem T-*-Reagens?^inen Indikator enthält, vorgewaschen wurden. Der Ausdruck ⁵*Vorgewasohen" bedeutet, daß die Innenseiten dieser Behälter mit einer wäßrigen, gepufferten Lösung eines der oben angegebenen pH-Indikatoren in Berührung gebracht wurden, z.B. durch Ausspülen oder Benetzen. Bromkresolpurpur oder Bromthymolblau sind die bevorzugten Indikatoren. Diese Indikatoren werden in einer Konzentration von 50 bis

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pro ml auf einen pH-Wert von ungefähr 5 gepuffertes Wasser verwendet. .

Selbstverständlich kann das bei den erfindungsgenäJten Prüfmitteln verwendete T, entweder mit «T 6der J radio aktiv gemacht werden, obwohl ^J3 bevorzugt ist, da es eine Halbwertzelt von 56 Tagen besitzt, verglichen mit I, das eine Halbwertzelt von 8 Tagen hat.

Patentansprüche

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Claims (4)

1. 3? s tentan-sprüche

   U Verfahren zur in vitro Bestimmung der Schilddrüsenfunktion durch Zugabe von radioaktiv markierter Schilddrüsensubstanz zu dem zu untersuchenden Serum, dadurch gekennzeichnet, daß man in gepufferter Lösung arbeitet und einen "Pro te infehler" »pH -Indikator zusetzt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e η η seichBetp daß man einen Zitronensäure-Natriumphosphat Puffer verwendet, um den pH-Wert auf ungefähr 5 zu halten.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1/P^- SSdurch gekennzeichnet,* -daß Kan als Indikator Bromkre so Ipurpur, Chlorphenole t, Tetrabromphenolblau,, Bromphenolblau, Brom=· kresolgrün oder Bromth^nolblau verwendet,,
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 ₅ dadurch ge

   kennzeichnet:, daß raan als Indikator Bromkre solpur pur oder Bromthymolblau verwendet₀

   5« VerfahreB Bach Anspruch 1 bis 4₉ dadurch g e -

   kenn zeichnet „ daJ man den Indikator in einer Menge

   von ungefähr 60 /u^g/ml verweiadet.

   β. . Verfahren nach Anspruch 1 bis 5₅ dadurch gekennzeichnet, daß man als SeMlddrüsensubstanz Trijodthyronin verwendet.

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