DE2051429A1 - Desacetylaranotin - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE Dr.-Ιηβ. HAN3 RUSCHKE DIpL-lftQ. HEINZ AGUlAR

■ERLIN SS

E

Eil Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, 7.St.A,

Desacetylaranotin

Die Erfindung Detrifft ein neuartiges Derivat des Aranotins, das durch die folgende Formel dargestellt wird:

OH

Desacetylaranotin wird durch Hydrolyse von Acetylaranotin in saurem Alkohol hergestellt /""oeschrieben in "J. Am. Chern. JO, 2980 7

Die Hersteilung wixd folgende!'massen ausgeführt!

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Herstellung von Desacetylaranotin

50 rag Acetylaranotin wurden in 50 ml inethanolischer Salzsäurelösung aufgelöst, die durch Zusatz von 1 ml 36 ^lger, wässriger Salzsäure zu 100 ml wasserfreiem Methanol zubereitet worden war. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur etwa 7 Stunden lang stehen gelassen und anschliessend filtriert. Durch Einengen des Piltrats uis zur Trockne wurden 30 rng eine« trockenen Pulvers gewonnen, das im wesentlichen aus Desacetylaranotin bestand. Chromatographie des Rückstandes über Siliciumdioxid unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat und Benzol (4:1) pls Lösungsmittel ergab das gereinigte Desacetylaranotin. Desacetylaranotin ist ein weisser, kristalliner Festatoff, der eich oberhalb 280° C iefsetzt, ohne einen bestimmten Schmelzpunkt aufzuweisen. Die Dünnschichtchromatographie zeigt einen einzelnen Fleck.

Das Infrarotspektrum des Desacetylaranotins, in einem Mineralöl verrieben, wird in Fig. 1 gezeigt. Das Spektrum zeigt charakteristische Peaks bei 2,97Ä, 3,458, 5,95^, 6,3bR und 7,JfR.

Die Fähigkeit des Dee ac e ty larano tins, das Wachstum vor^ Virusarten in vitro zu hemmen, lässt sich durch einen Plaque-Hemmtest ähnlich dem von Siminoff in "Applied Microbiology" 2,(1), 66-72 (1961) aufzeigen. Der Versuch wird folgendermassen durchgeführt» Die Versuche werden unter Verwendung von rechteckigen Olasgefassen mit den Abmessungen 190,5 χ 381 χ 38,1 mm, die aus Stücken von doppelt starkem Flachglas hergestellt sind, welch« ait Siliconkautechukkltt zusammengeklebt wurden. Die Olasschalen werden mit ' einem αlasdeckel verschlossen und vor der Verwendung mittels ; trockener Hitze bei einer Temperatur von etwa 300° C sterilisiert. Eine Zellsuspension von etwa 10 /ml BS-C-I ( Serienkultur von Cercopitheous-Affennieren ) wird in einem Medi up zubereitet, da« ' sich aus Medium 199 zusammen mit 5 ? Kalbsserum, 150 Einheiten Penicillin pro Milliliter und 150 meg Streptomycin pro Milliliter zusammensetzt. 250 ml der Suspension werden in Jede der sterilisierten Olasschalen eingefüllt, und die Schalen werden bei etwa

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37° C etwa 96 Stunden lang in ebener Lage im Brutschrank gehalten^ Nach der Inkubation wird das Medium sorgfältig abgesogen, wodurch eine Einzelschicht der Zellen unzerstört auf dem Glas zurückbleibt. Die Zellen werden dann infiziert, indem man in jede Schale vorsichtig etwa 100 ml einer Suspension des speziellen Virus in, Medium 199 hinxttgibt. Polio Tiyp I ( Mahoney-Stamm ) und Polio Typ III ( Saukett-Stamm ) wurden verwendet.

Naoh einer Verweilzeit von etwa 1 bis 3 Stunden zur Adsorption des Virus an den Zellen wird das Infektionsmedium, aus den Schalen entfernt. Ein Gemisch aus 75 ml doppelt starkem Medium 199 mit Kalbseerum, Penicillin und Streptomycin und 75 ml doppelt starker Agarlösung ( Difco-gereinlgt ) ( 2 % ) von 50° C wird über die vom Virus Infizierte Zelleneinzelschicht in jeder Schale gegossen und in ebener Lage ers&ren gelassen. Filterpapierseheiben werden i in Lösungen der zu untersuchenden Substanzen getaucht*, in einem Vakuumofen bei nicht mehr als 37° C etwa 1 Stunde lang getrocknet und dann auf die Oberfläche des Agare in den Schalen gelegt. Die Schalen werden bei etwa 37° C etwa 84 Stunden lang im Brutschrank gehalten, dann mit einer wässrigen Lösung mit 10 % Formalin und 2 % Natriumacetat überflutet, und der Agar wird mit Wasser abgeschwemmt. Die zurückbleibenden Zellen werden nach Wright angefärbt. Toxizität, Antivirusaktivität und mikroskopisches Aussehen der Zellen werden geaKss dem Verfahren von Hermann et al., "Proc.Soc.j Εχρΐ Biol. and Med." ICg, 625 (I960) festgestellt.

Plaques werden in denjenigen Bereichen der Platte festgestellt, wo der Virus die Zellen Infiziert und sich in ihnen vermehrt hat.'' Toxizitätezonen werden beobachtet, und der Durchmesser derselben ■ in mm wird gemessen, wenn die Versuchssubstanz den Virus unter ' der Filterpaplerschelbe und um diese herum getötet hat. Die Anti»; virusaktlvität der Versuchssubstanxen wird ermittelt, indem das '

Fehlen von Plaques und ein intensiveres Wachstum der Zellen in \ einer Zone unter der Filterpapierscheibe und um diese herum beob-j achtet werden, und der Durchmesser dieser Zone wird in mm ge- _; messen. 1

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Wenn die Menge des Antivlnas-mittels begrenzt ist, können Ausschnitte des aktiven Mittels auf einem Papierchromatogramm anstelle der Filterpapierscheiben verwendet werden, oder man kann das Verfahren modifizieren, indem man eine Dünnschichtchromatographieplatte auf die infizierte Agarschrägschicht legt.

Die Zellen in den Zonen, in denen sich .Aktivität gezeigt hat, werden unter dem Mikioskop untersucht, um das Vorhandensein und den Grad des Mittels und/oder die durch den Virus hervorgerufenen Schäden zu bestimmen. Die Färbung wird als 1+, 2+, J+, 4+ und negativ eingestuft: j

4+: Dunkel gefärbte Bereiche, welche bei der mikroskopischen Untersuchung gesunde Zellen ohne sichtbare Schaden durch den Viruß oder daß getestete Mittel zeigen;

2+: weniger dunkel gefärbte Bereiche, die keine Virusschäden zeigen, aber weniger gesund aussehen;

2+: Bereiche, die gesunde Zellen mit massigen, uurcn non Virus hervorgerufenen Symptomen zeigen;

1+: Benlche mit gesunden Zellen, aber stärkerem Virussymptomen; -: keine lebensfähigen Zellen.

Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Versuchsreihe mit Desacetylaranotin gegen Polio I und Polio III. In der Tabelle I zeigt die Spalte 1 die Konzentration in mcg/ml, in der die Verbindung auf die «Filterpapierscheibe aufgegeben wurde; Spalte ' 2 zeigt den Durchmesser in rnm von Zellen der Zelltoxizität; Spalte 3 zeigt den Durchmesser in mm der Zonen der Virusinhibition; und Spalte 4 zeigt die Bewertung der angefärbten Bereiche.

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	Tabelle	I	Durchmesser von Zonen der Virus- inhibition in mm	30	ij^ea	PülioIII
	Aktivität von	Desacetylai	Polio I Polio III	20		4+
		2e	23		4+
Konii.in mcg/ml	.-•anotin n<=	23	Io		4+
	Polio I und Polio III	20	15		4+
250	Durchmesser von Zonen der ZeIl- toxiiiität in nur.	15		Bewertung der angefäroten Bereiche	4+
125	Polio I Polio III	9	Polio I
62	7 Y	4+
31	-	4+
15	-	4+
-	4+
— —	4+

Desacetylaranotin ist ausserdem gegen vier Rhino-Virusarten in Gewebekultur unter Anwendung des obigen Verfahrens zur Bestimmung der .^ntivirusaktivität wirksam.

Die Anwendung von Desacetylaranotin zur Bekämpfung von Virusirifektionen wird durch seine Fähigkeit aufgezeigt, Mäuse, uie mit dem Virus Goxsackie A21 (Coe) infiziert sind, zu hallen. Der Virus wurde von Lanette et al /TAm. J. Hyg." to., 2?2Y (1959)_7 aus menschlichen Patienten mit schwacher Erkrankung der Atmungsorgane isoliert. Bei Mäusen bewirkt der Virus Muskeldegeneration und Schwäche durch Lähmungserscheinungen sowie auch eine Schädigung der Atmungsorgane. Der verwendete, über Mäuse gezüchtete ( mouse adapted ) Virus Coxsackle A12 lag in Form einer 1 : 10-'/erdünnung uer überstehenden Flüssigkeit einer 10 #igen Suspension •/on Mäusegesässmuükel ( von infizierten Mäusen gewonnen ) vor. Desacetylaranotin lag in Form eine3 jS-Fleckengemisches ( 3-spot mixture ) vor, wie es bei der Präperation 1 vor der endgültigen Reinigung gewonnen wurde, das über Desacetylaranotin als vorherrschendes Antivirusmittel ( gegen Coxsackie-Virus ) enthielt. Die Ve.blndun_CJ wurde don Mäusen als Suspension In 0,25 ml steri-

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lern Wasser ( das zulässigerweise bis zu 5>J eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels enthielt ) bei 0,125 ng/kg intraperitoneal verabreicht. Die verwendeten Mäuse waren welsse SPF-Swiss -Mäuse mit einem Gewicht von 11 - 13 g. Mit jeder Konzentration des Mittels wurden 10 Mäuse behandelt, und 3-5 Gruppen von jeweils 10 Mäusen wurden als Kontrollen verwendet. Bei dieser Arbeitsweise sterben uie Kontrollmäuse gewöhnlich am 5. bis 0. Tag nach der Infektion, und Tiera, die au 10. Tag noch leben, werden als Überlebende angesehen, falls sie keine Lälimungsercchei· nungen aufweisen.

Die folgende Tabelle II zeigt die Ergebnisse des obigen Versuches, In der Tabelle zeigen Spalte 1 die Behandlung, Spalte 2 den Überlebenaindex, der nach dem Verfahren von Redman öt al., "Antimicrobial Agents and Chemotherapy - 1966", Seite 497, ermittelt wurde, und Spalte 3 den Mittelwert der Tage, nach denen der Tod eintrat; Spalte 4 gibt die Anzahl der überlebenden gegenüber der Gesamtzahl der Mäuse in der behandelten Gruppe wieder.

Tabelle II

Behandlung Überlebensindex Mittlerer Anzahl der ÜberTodestag lebenden pro

^ Desacetylaranotin

0,125 mg/kg; IP 4,30 6,'Ί 5/10

Kontrolle 1,83 5,9 0/30

Die ED₁-Q für Desacetylaranotin, die anhand der obigen Werte bestimmt wurde, beträgt etwa 0,125 mg/kg Mäusegewicht. ,

Desacetylaranotin bewirkt Antivirus-Dlutßpiegel bei sowohl oraler als auch .intraptritonealer Verabreichung bei Mäusen, Im Gegensatz zu Aranotin, welches bei Verabreichung auf oralem Wege keine Blut-, spiegel ergibt.

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Desac e ty laranotln kann geanäss den den Facimiann geläufigen Arbeitsweisen in eine ^ur Verabreichung geeignete Form gebracht werden.

- Patentansprücae -

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Claims (1)

- el - 208H29 E ^35 Patentansprüche :

1. Desacetylaranotin, gekennzeichnet durch die folgende Formel:

OH

Verfahren zur Herstellung von Dcsacetylaranotin, dadurch gekennzeichnet, dass man Aadtylaranotin mit saurem Alkohol hydrolysiert.

Me./ür.

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