DE2050267A1

DE2050267A1 - Verfahren zur Herstellung von stabilen NADH-Zubereitungen

Info

Publication number: DE2050267A1
Application number: DE19702050267
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1970-10-13
Filing date: 1970-10-13
Publication date: 1972-04-27
Also published as: SE385507B; IT943598B; GB1299040A; US3819487A; AT306051B; NL7113053A; IL37584A; DE2050267B2; FR2109878A5; DE2050267C3; IL37584A0; CH572619A5; JPS557440B1

Description

Patentanavälte Dipl. - Ing. F. Weickmann, 2050267

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.WEICKMANN, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22

Boehringer Mannheim G-nibH, 6800 Mannlieim

Verfahren zur Herstellung von stabilen ITADH-Zubereitungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von lagerungsstabilen IADH-(reduziertes Hikotinamid-adenin-dinucleotid)-Zubereitungen, welche innerhalb längeren Zeitraums keine' Inhibitoren für die Hydrogenasen bilden.

Die Bestimmung der Aktivität von Dehydrogenasen wie z. B,^rLac~ tatdehydrogenase oder a-Hydroxybutyratdehydrοgenäse erfolgt in Gegenwart von NADH, welches hierbei die Rolle des Ccenzyms spielt, beispielsweise nach folgender Reaktionsgleichung: |

Pyruvat + ITADH + H Lactat + FAD

Es ist bekannt', daß die üblichen Reinheitskriterien für NADH nicht aiisreichen. Beispielsweise bildet gefriergetrocknetes NADH sogar wenn es bei 4° C gelagert wird, Hemmstoffe, welche die Dehydrogenasen hemmen und bereits in sehr kleinen Konzentrationen zu geringe Enzymwerte vortäuschen. Der hierdurch verursachte Fehler kann auch nicht durch Überdosierung von NADH behoben werden, da auf diese Weise auch die Hemrastoffkonzentration vergrößert wird (A. Härtel, R. Helger, H. lang in Z. klin. Chem.

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u. klin. Biοehem., 1968, Seite 259 - 262). Da bisher ein zufriedenstellendes Verfahren zur Verhinderung dieser Inhibitorbildung nicht gefunden wurde, mußte NADH bereits nach relativ kurzer Lagerzeit vor einer Verwendung zur Bestimmung der Dehydrogenasen durch umständliche Reinigungsschritte, beispielsweise durch Säulenehromatographie über DEAE-Zellulose, vom gebildeten Inhibitor gereinigt werden (R. B. McComb und Royal J. fray, Clin. Chemistry, J4_, 754 (1968), Seite 754" - 762).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines gegen Inhibitorbildung längere Zeit stabilen NADHs zvl finden.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Herstell3n von stabilen NADH-Zubereitungen, welches darin besteht, daß eine verdünnte, wäßrige lösung von inhibitorfreiem NADH in dünner Schicht im Vakuum bei etwa Raumtemperatur bis zur Trockne stehengelassen wird.

Bei Anv/endung des erfindungs gemäß en Verfahrens erhält man das NADH in glasiger Form auf dem Schichtträger. Überraschenderweise ist das so erhaltene NADH-Präparat auch bei Raumtemperatur monatelang gegen Inhibitorbildung stabil. ,Unter Inhibitor wird hierbei eine Substanz verstanden, welche die Aktivität --VOn—Behydrogenasen-herabse tz t.

Erfindungsgemäß erhaltenes NADH ist hinsichtlich der Stabilität eintiD durch Lyophilisieren bekannterweise aus inhibitorfreiem JJATH erhaltenen Präparat erheblieh überlegen, wie die Ergebnisss von Vergleichsversuchen zeigen, die nachstehend einander gegenüber gestellt sind. In beiden Fällen wurde hierbei von einer inhibitorfreien HADH-Qualität ausgegangen.

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gefundene 1-iDH-Aktivitat

und Temperatur

O .tfoehen/53⁰ C -i Il 11

ex-findungsgep.äß

Iy ο phi 1 i s i e r I;

100	-/>
83	ot /'■
74	i
65
53	-rf 7°
30

Die obigen Werte zeigen_s daß mit erfinäungsgeiiiäß hergestelltem NADH nach 5-vb"eiliger Lagerung bei 33° C noch 98 $ der ursprünglichen LDK-Aktivität (LDH = Lactatdehyrogenase) gemessen werden, während ein lyophilisierte*.^rs HADE-Präpai^at nur noch 30 $ des ursprünglichen Wertes ergibt. Einer Aktivitätsverminderung um 2 fa bei erfindungsgemäß erhaltenem KADH steht somit eine Aktivitätsverminderung um 70 f^: bei nach bekanntem Verfahren erhaltenem KADH gegenüber.

Das nach dem erfindungsgemäßen Yerfahren hergestellte MADH eignet sich aufgrund einer wesentlich verbesserten Stabilität zur Herstellung von kombinierten Testreagenrien zur Bestimmung der Dehydrogenasen, wie z. B. LDH, a-HBDH (Eydroxybutyratdehydrogenase), SDH ( Sorbitdehydrogenase ) u. ä. Ein derartiges Reagens zur Bestimmung einer Behydrogenase besteht daher aus

a) erfindungsgeraäS hergestelltem HADH und

b) einer Lösung des jeweiligen Dehydrogenasesubstrates in 'wäßrigem Puffer

in vor Cebrauch unvermischbaren Zustand· -

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BADORiGi_NAL

Die Hydrogenase-Substrate sind beispielsweise für Lactatdehydrogenase (LDH) Pyruvat, für α-Hydroxybutyratdehydrogena.se (cc-KBDH).a-Ketobutyrat.

Ein erfindungsgemäßes Reagenz zur Bestimmung der Lactatdehydrogenase enthält zweckmäßig als Komponente b 0,05 bis 0,2 M wäßrigen Phosphatpuffer, pH 7,2 bis 7,8, vorzugsweise 7,5, in dem 0,1 bis 0,5 mM Pyruvat enthalten sind.

In analoger Weise ist ein Reagenz zur Bestimmung der a-HBDH zusammengeseczt, welches jedoch anstelle von Pyruvat a-Keto~ out/rat enthält«

"*'- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter: Beispiel 1:

Je 0,05 ml einer 1-^-igen inhibitorfreien, v/äßrigen NADH-Lösung werden auf den Boden von kleinen Flaschen pipettiert. Dann wird ein Vakuum von weniger als 20 mm Hg angelegt und die Flaschen werden bei 25 bis 30° C stehengelassen, bis z_rur vollständigen Trocknung (3 bis 4 Stunden). Dann werden die Flaschen bei normalem Druck verschlossen. Die so erhaltenen ITADH-Zubereitungen sind bei Raumtemperatur mindestens 6 Mo- _nate ohne Inhibitorbildung stabil und lassen sich nach Auf- W lösung in einer Puffer/Substratlösung zur Bestimmung der entsprechJTiden Dehydrogenaee verwenden.

Beispiel 2:

3 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,5, enthaltend 0,3 mM Pyruvat, werden in eine der gemäß Beispiel 1 hergestellten NADH-haltigen Flaschen eingebracht. Innerhalb weniger Sekunden löst sich das iTADH vollständig auf. Die so erhaltene Lösung wird dann in eine Meßküvette gebracht, mit 0,1 ml Probelösung (z. B. '

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Serum) versetzt und die NADH-Abnahme bei 366 um. gemessen. Die Geschwindigkeit der KADH-Abnahme ist ein Maß für die in der Probelösung enthaltene LDH-Aktivität.

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Claims

"■* D *■*

PlTENIiUSPRÜCHE

1.) Verfahren zur Herstellung von stabilen HADH-Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine verdünnte, waß-* • rige lösung von inhibitorfreiem IJABR in dünner Schicht im Vakuum bei etwa Raumtemperatur 'bis zur Trockne stehengelassen wird. - /■-

2.) "Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» daß eine wäßrige Lösung mit weniger als 5 f° ITADH verwendet j;,'. ■ wird.

"* 3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß die'Schichtdicke der lösung so gering als möglich gehalten wird.

.4·) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch ge-, kennzeichnet, daß ein Vakuum unter 30 Him Hg angewendet wird.

5.) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur,20 bis 35° C beträgt.

™ 6.) Reagenz zur Bestimmung einer Dehydrogenase mittels HADH, bestehend aus

a.) nach Anspruch 1 bis 5 erhaltenem IFADH und

'· *■ ■ . ■ ■

b) einer lösung des Dehydrogenase-Substrates in wäßrigem Puffer

in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

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— Π '—- '

7.) Reagenz nach Anspruch 6 zur Bestimmung der' Lacbatdehydrogenäse, gekennzeichnet durch 0,05 bis 0,2 M wäßrigen Phosphatpuffer, pH 7,2 bis 7,8, enthaltend 0,1 bis 0,5 mM Pyruvat.

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