DE2050267B2 - Verfahren zur Herstellung von stabilen Zubereitungen von reduziertem Nicotinamidademndinucleotid - Google Patents

Description

Gefundene LDH-Aktivität

Pyruvat + NADH + H⁺

LDH

»5 Lagerungsdauer
und Temperatur

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von lagerungsstabilen Zubereitungen von reduziertem NicotinamidadenindinucleotidinachfolgendalsNADH bezeichnet), welche innerhalb eines längeren Zeitraums keine Inhibitoren für die Hydrogenasea bilden.

Die Bestimmung der Aktivität von Dehydrogenasen wie z. B. Lactatdehydrogenase (LDH) oder «-Hydroxybutyratdehydrogenase erfolgt in Gegenwart von NADH, welches hierbei die Rolle des Coenzyms spielt, beispielsweise nach folgender Reaktionsgleichung:

0 Wochen/33 ⁰C

1 Woche/33°C

2 Wochen/33 ⁰C

3 Wochen/33 "C

4 Wochen/33 ⁰C
5Wochen/33°C

Erfindungsgemäß

100 %
99%

98 «A,
98°/₀
98%
98%

Lyphilisiert

100 »/„

83%
74°/o
65°/„
53°/o
30%

Lactat+NAD+

Es ist bekannt, daß die üblichen Reinheitskriterien für NADH nicht ausreichen. Beispielsweise bildet gefriergetrocknetes NADH, sogar wenn es bei 4⁰C gelagert wird, Hemmstoffe, welche die Dehydrogenasen hemmen und bereits in sehr kleinen Konzentrationen zu geringe Enzymwerte vortäuschen. Der hierdurch verursachte Fehler kann auch nicht durch Uberdosierung von NADH behoben werden, da auf diese Weise auch die Hemmstoffkonzentration vergrößert wird (A. H ä r t e 1, R. H e 1 g e r, H. L a η g in Z. klin. Chem. u. klin. Biochem., 1968, S. 259 bis 262). Da bisher ein zufriedenstellendes Verfahren zur Verhinderung dieser Inhibitorbildung nicht gefunden wurde, mußte NADH bereits nach relativ kurzer Lagerzeit vor einer Verwendung zur Bestimmung der Dehydrogenasen durch umständliche Reinigungsschritte, beispielsweise durch Säulenchromatographie über DEAE-Zellulose, vom gebildeten Inhibitor gereinigt werden (R. B. M c C ο m b und Royal J. Gay, Clin, Chemistry, 14, [1968], S. 754 bis 762).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Die obigen Werte zeigen, daß mit erfindungsgemäß hergestelltem NADH nach 5wöchiger Lagerung bei 33°C noch 98°/₀ der ursprünglichen LDH-Aktivität (LDH = Lactadehyrogehase) gemessen werden, während ein lyophilisiertes NADH-Präparat nur noch 30⁰/o des ursprünglichen Wertes ergibt. Einer Aktiyitätsverminderung um 2°/₀ bei erfindungsgemäß erhaltenem NADH steht somit eine Aktivitätsverminderung um 70% bei nach bekanntem Verfahren erhaltenem NADH gegenüber.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte NADH eignet sich auf Grund einer wesentlich verbesserten Stabilität zur Bestimmung der Dehydrogenasen, wie z. B. LDH, λ-HBDH (Hydroxybutyratdehydrogenase), SDH (Sorbitdehydrogenase).

Die Hydrogenase-Substrate sind beispielsweise für Lactatdehydrogenase (LDH) Pyruvat, für «-Hydroxybutyratdehydrogenase (a-HBDH) <x-Ketobutyrat.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Je 0,05 ml einer l%igen inhibitorfreien, wäßrigen NADH-Lösung werden auf den Boden von kleinen Flaschen pipettiert. Dann wird ein Vakuum von weniger als 20 mm Hg angelegt und die Flaschen werden bei 25 bis 30⁰C stehengelassen, bis zur vollständigen Trocknung (3 bis 4 Stunden). Dann werden die Flaschen bei normalem Druck verschlossen. Die so erhaltenen NADH-Zubereitungen sind bei Raumtemperatur mindestens 6 Monate ohne Inhibitorbildung stabil und lassen sich nach Auflösung in

einer Puffer/Substratlösung zur Bestimmung der entsprechenden Dehydrogenase verwenden.

Beispiel 2
Bestimmung der LDH-Aktivität

3 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,5, enthaltend 0,3mM/l Pyruvat, werden in eine der gemäß Beispiel 1 hergestellten NADH-haltigen Flaschen eingebracht. Innerhalb weniger Sekunden löst sich das NADH vollständig auf. Die so erhaltene Lösung wird dann in eine Meßküvette gebracht, mit 0,1 ml Probelösung (z. B. Serum) versetzt und die NADH-Abnahme bei 366 mn gemessen. Die Geschwindigkeit der NADH-Abnahme ist ein Maß für die in der Probelösung enthaltene LDH-Aktivität.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von stabilen Zubereitungen von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (nachfolgend als NADH bezeichnet), dadurch gekennzeichnet, daß eine verdünnte, wäßrige Lösung von inhibitorfreiem NADH in dünner Schicht im Vakuum bei etwa Raumtemperatur bis zur Trockne stehengelassen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung mit weniger als 5°/₀ NADH verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke der Lösung so gering als möglich gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vakuum unter 30 mm Hg angewendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur 20 bis 35°C beträgt.

6. Verwendung von nach Anspruch 1 bis 5 erhaltenem NADH zur Bestimmung einer Dehydrogenase.

ein Verfahren zur Herstellung eines gegen Inhibitorbildung längere Zeit stabilen NADHs zu finden.
' ' Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren, welches darin besteht, daß eine verdünnte, wäßrige Lösung von inhibitorfreiem NADH in dünner Schicht im Vakuum bei etwa Raumtemperatur bis zur Trockne stehengelassen wird.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man das NADH in glasiger Form auf dem

ίο Schichtträger. Überraschenderweise ist das so erhaltene NADH-Präparat auch bei Raumtemperatur monatelang gegen Inhibitorbildung stabil. Unter Inhibitor wird hierbei eine Substanz verstanden, welche die Aktivität von Dehydrogenasen herabsetzt.

Erfindungsgemäß erhaltenes NADH ist hinsichtlich der Stabilität einem durch Lyophilisieren bekannterweise aus inhibitorfreiem NADH erhaltenen Präparat erheblich überlegen, wie die Ergebnisse von Vergleichsversuchen zeigen, die nachstehend einander gegenüber-

ao gestellt sind. In beiden Fällen wurde hierbei von einer inhibitorfreien NADH-Qualität ausgegangen.